<<

стр. 2
(всего 2)

СОДЕРЖАНИЕ

Плазматическая мембрана принимает участие в выведении веществ из клетки с помощью экзоцитоза - процесса, обратного эндоцитозу (см. рис. 133).
В случае экзоцитоза, внутриклеточные продукты, заключенные в вакуоли или пузырьки и отграниченные от гиалоплазмы мембраной, подходят к плазматической мембране. В местах их контактов плазматическая мембрана и мембрана вакуоли сливаются, и пузырек опустошается в окружающую среду. С помощью экзоцитоза происходит процесс рециклизации мембран, участвующих в эндоцитозе.
С экзоцитозом связано выделение синтезированных в клетке разнообразных веществ. Секретирующие, выделяющие вещества во внешнюю среду, клетки могут вырабатывать и выбрасывать низкомолекулярные соединения (ацетилхолин, биогенные амины и др.), а также в большинстве случаев макромолекулы (пептиды, белки, липопротеиды, пептидогликаны и др.). Экзоцитоз или секреция в большинстве случаев происходит в ответ на внешний сигнал (нервный импульс, гормоны, медиаторы и др.). Хотя в ряде случаев экзоцитоз происходит постоянно (секреция фибронектина и коллагена фибробластами). Сходным образом из цитоплазмы растительных клеток выводятся некоторые полисахариды (гемицеллюлозы), участвующие в образовании клеточных стенок.
Большинство секретируемых веществ используется другими клетками многоклеточных организмов (секреция молока, пищеварительных соков, гормонов и др.). Но часто клетки секретируют вещества и для собственных нужд. Так например рост плазматической мембраны осуществляется за счет встраивания участков мембраны в составе экзоцитозных вакуолей, часть элементов гликокаликса выделяется клеткой в виде гликопротеидных молекул и т.д.
Выделенные из клеток путем экзоцитоза гидролитические ферменты могут сорбироваться в слое гликокаликса и обеспечивать примембранное внеклеточное расщепление различных биополимеров и органических молекул. Огромное значение примембранное неклеточное пищеварение имеет для животных. Было обнаружено, что в кишечном эпителии млекопитающих в зоне так называемой щеточной каемки всасывающего эпителия, особенно богатой гликокаликсом, обнаруживается огромное количество разнообразных ферментов. Часть этих же ферментов имеет панкреатическое происхождение (амилаза, липазы, различные протеиназы и др.), а часть выделяется собственно клетками эпителия (экзогидролазы, расщепляющие преимущественно олигомеры и димеры с образованием транспортируемых продуктов).
Рецепторная роль плазмолеммы
Мы уже встречались с этой особенностью плазматической мембраны при ознакомлении с ее транспортными функциями. Белки-переносчики и насосы являются кроме всего также рецепторами, узнающими и взаимодействующими с определенными ионами. Рецепторные белки связываются с лигандами и участвуют в отборе молекул, поступающих в клетки.
В качестве таких рецепторов на поверхности клетки могут выступать белки мембраны или элементы гликокаликса - гликопротеиды. Такие чувствительные участки к отдельным веществам могут быть разбросаны по поверхности клетки или собраны в небольшие зоны.
Разные клетки животных организмов могут обладать разными наборами рецепторов или же разной чувствительностью одного и того же рецептора.
Роль многих клеточных рецепторов заключается не только в связывании специфических веществ или способности реагировать на физические факторы, но и в передаче межклеточных сигналов с поверхности внутрь клетки. В настоящее время хорошо изучена система передачи сигнала клеткам с помощью некоторых гормонов, в состав которых входят пептидные цепочки. Было найдено, что эти гормоны связываются со специфическими рецепторами на поверхности плазматической мембраны клетки. Рецепторы, после связи с гормоном активируют другой белок, лежащий уже в цитоплазматической части плазматической мембраны, - аденилатциклазу. Этот фермент синтезирует молекулу циклического АМФ из АТФ. Роль циклического АМФ (цАМФ) заключается в том, что он является вторичным мессенджером - активатором ферментов - киназ, вызывающих модификации других белков-ферментов. Так, при действии на печеночную клетку гормона поджелудочной железы глюкагона, вырабатываемого А-клетками островков Лангерганса, гормон связывается со специфическим рецептором, что стимулирует активацию аденилатциклазы. Синтезированный цАМФ активирует протеинкиназу А, которая в свою очередь активирует каскад ферментов, в конечном счете расщепляющих гликоген (запасной полисахарид животных) до глюкозы. Действие инсулина заключается в обратном - он стимулирует вхождение глюкозы в печеночные клетки и отложение ее в виде гликогена.
В целом цепь событий развертывается следующим образом: гормон взаимодействует специфически с рецепторной частью этой системы и, не проникая внутрь клетки, активирует аденилатциклазу, которая синтезирует цАМФ, активирующий или ингибирующий внутриклеточный фермент или группу ферментов. Таким образом, команда, сигнал от плазматической мембраны передается внутрь клетки. Эффективность этой аденилатциклазной системы очень высока. Так взаимодействие одной или нескольких молекул гормона может привести за счет синтеза множества молекул цАМФ к усилению сигнала в тысячи раз. В данном случае аденилатциклазная система служит преобразователем внешних сигналов.
Существует и другой путь, при котором используются другие вторичные мессенджеры, - это т.н. фосфатидилинозитольный путь. Под действием соответствующего сигнала (некоторые нервные медиаторы и белки) активируется фермент фосфолипиза C, которая расщепляет фосфолипид фосфатидилинозитолдифосфат, который входит в состав плазматической мембраны. Продукты гидролиза этого липида, с одной стороны, активируют протеинкиназу C, которая вызывает активацию каскада киназ, что приводит к определенным клеточным реакциям, а с другой - приводит к освобождению ионов кальция, который регулирует целый ряд клеточных процессов.
Другой пример рецепторной активности - рецепторы ацетилхолина, важного нейромедиатора. Ацетилхолин, освобождаясь из нервного окончания, связывается с рецептором на мышечном волокне, вызывает импульсное поступление Na+ в клетку (деполяризация мембраны), открывая сразу около 2000 ионных каналов в зоне нервно-мышечного окончания.
Разнообразие и специфичность наборов рецепторов на поверхности клеток приводит к созданию очень сложной системы маркеров, позволяющих отличать свои клетки (той же особи или того же вида) от чужих. Сходные клетки вступают друг с другом во взаимодействия, приводящие к слипанию поверхностей (конъюгация у простейших и бактерий, образование тканевых клеточных комплексов). При этом клетки, отличающиеся набором детерминантных маркеров или не воспринимающие их, либо исключаются из такого взаимодействия, либо у высших животных уничтожаются в результате иммунологических реакций (см. ниже).
С плазматической мембраной связана локализация специфических рецепторов, реагирующих на физические факторы. Так, в плазматической мембране или у ее производных у фотосинтетических бактерий и синезеленых водорослей локализованы белки-рецепторы (хлорофиллы), взаимодействующими с квантами света. В плазматической мембране светочувствительных клеток животных расположена специальная система фоторецепторных белков (родопсин), с помощью которых световой сигнал превращается в химический, что в свою очередь приводит к генерации электрического импульса.
Межклеточное узнавание
У многоклеточных организмов за счет межклеточных взаимодействий образуются сложные клеточные ансамбли, поддержание которых может осуществляться разными путями. В зародышевых, эмбриональных тканях, особенно на ранних стадиях развития, клетки остаются в связи друг с другом за счет способности их поверхностей слипаться. Это свойство адгезии (соединения, сцепления) клеток может определяться свойствами их поверхности, которые специфически взаимодействуют друг с другом. Механизм этих связей достаточно хорошо изучен, он обеспечивается взаимодействием между гликопротеидами плазматических мембран. При таком межклеточном взаимодействии клеток между плазматическими мембранами всегда остается щель шириной около 20 нм, заполненная гликокаликсом. Обработка ткани ферментами, нарушающими целостность гликокаликса (муказы, действующие гидролитически на муцины, мукополисахариды) или повреждающие плазматическую мембрану (протеазы), приводит к обособлению клеток друг от друга, к их диссоциации. Однако если удалить фактор диссоциации, то клетки могут снова собираться, реагрегировать. Так можно диссоциировать клетки разных по окраске губок, оранжевых и желтых. Оказалось, что в смеси этих клеток образуются два типа агрегатов: состоящие только из желтых и только из оранжевых клеток. При этом смешанные клеточные суспензии самоорганизуются, восстанавливая исходную многоклеточную структуру. Сходные результаты были получены с суспензиями разделенных клеток эмбрионов амфибий; в этом случае происходит избирательное пространственное обособление клеток эктодермы от энтодермы и от мезенхимы. Более того, если для реагрегации используются ткани поздних стадий развития зародышей, то в пробирке самостоятельно собираются различные клеточные ансамбли, обладающие тканевой и органной специфичностью, образуются эпителиальные агрегаты, сходные с почечными канальцами, и т.д.
Было найдено, что за агрегацию однородных клеток отвечают трансмембранные гликопротеиды. Непосредственно за соединение, адгезию, клеток отвечают молекулы т.н. CAM-белков (cell adhesion molecules). Некоторые из них связывают клетки друг с другом за счет межмолекулярных взаимодействий, другие образуют специальные межклеточные соединения или контакты.
Взаимодействия между адгезивными белками может быть гомофильные, когда соседние клетки связываются друг с другом с помощью однородных молекул, гетерофильные, когда в адгезии участвуют разного рода CAM на соседних клетках. Встречается межклеточное связывание через дополнительные линкерные молекулы.
CAM-белков бывает несколько классов. Это кадгерины, иммуноглобулино-подобные N-CAM (молекулы адгезии нервных клеток), селектины, интегрины.
Кадгерины представляют собой интегральные фибриллярные мембранные белки, которые образуют параллельные гомодимеры. Отдельные домены этих белков связаны с ионами Ca2+, что придает им определенную жесткость. Кадгеринов насчитывают более 40 видов. Так Е-кадгерин характерен для клеток преимплантированных эмбрионов и для эпителиальных клеток взрослых организмов. P-кадгерин характерен для клеток трофобласта, плаценты и эпидермиса, N-кадгерин располагается на поверхности нервных клеток, клеток хрусталика, на сердечных и скелетных мышцах.
Молекулы адгезии нервных клеток (N-CAM) принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов, они образуют связи между нервными клетками. Некоторые из N-CAM участвуют в соединении синапсов, а также при адгезии клеток иммунной системы.
Селектины также интегральные белки плазматической мембраны участвуют в адгезии эндотелиальных клеток, в связывании кровяных пластинок, лейкоцитов.
Интегрины представляют собой гетеродимеры, с ? и ?-цепями. Интегрины в первую очередь осуществляют связь клеток с внеклеточными субстратами, но могут участвовать и в адгезии клеток друг с другом.
Узнавание чужеродных белков
Как уже указывалось, на попавшие в организм чужеродные макромолекулы (антигены), развивается сложная комплексная реакция - иммунная реакция. Суть ее заключается в том, что часть лимфоцитов вырабатывает специальные белки - антитела, которые специфически связываются с антигенами. Так, например, макрофаги своими поверхностными рецепторами узнают комплексы антиген-антитело и поглощают их (например, поглощение бактерий при фагоцитозе).
В организме всех позвоночных, кроме того, существует система рецепции чужеродных клеток или же своих, но с измененными белками плазматической мембраны, например при вирусных инфекциях или при мутациях, часто связанных с опухолевым перерождением клеток.
На поверхности всех клеток позвоночных располагаются белки, т.н. главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex - MHC). Это интегральные белки гликопротеины, гетеродимеры. Очень важно запомнить, что каждый индивидум имеет свой набор таких белков MHC. Это связано с тем, что они очень полиморфны, т.к. в каждом индивидуме имеется большое число альтериальных форм одного и того же гена (более 100), кроме того имеется 7-8 локусов, кодирующих молекулы MHC. Это приводит к тому, что каждая клетка данного организма, имея набор белков MHC, будет отличаться от клеток индивидума этого же вида. Специальная форма лимфоцитов, Т-лимфоциты, узнают MHC своего организма, но малейшие изменения в структуре MHC (например, связь с вирусом, или результат мутации в отдельных клетках), приводит к тому, что Т-лимфоциты узнают такие изменившиеся клетки и их уничтожают, но не путем фагоцитоза. Они выделяют из секреторных вакуолей специфические белки-перфорины, которые встраиваются в цитоплазматическую мембрану измененной клетки, образуют в ней трансмембранные каналы, делая плазматическую мембрану проницаемой, что и приводит к гибели измененной клетки (рис. 143, 144).
Специальные межклеточные соединения
Кроме таких сравнительно простых адгезивных (но специфических) связей (рис. 145) существует целый ряд специальных межклеточных структур, контактов или соединений, которые выполняют определенные функции. Это запирающие, заякоревающие и коммуникационные соединения (рис. 146).
Запирающее или плотное соединение характерно для однослойных эпителиев. Это зона, где внешние слои двух плазматических мембран максимально сближены. Часто видна трехслойность мембраны в этом контакте: два внешних осмофильных слоя обеих мембран как бы сливаются в один общий слой толщиной 2-3 нм. Слияние мембран происходит не по всей площади плотного контакта, а представляет собой ряд точечных сближений мембран (рис. 147а, 148).
На плоскостных препаратах разломов плазматической мембраны в зоне плотного контакта с помощью метода замораживания и скалывания было обнаружено, что точки соприкосновения мембран представляют собой ряды глобул. Это белки окклудин и клаудин, специальные интегральные белки плазматической мембраны, встроенные рядами. Такие ряды глобул или полоски могут пересекаться так, что образуют на поверхности скола как бы решетку или сеть. Очень характерна эта структура для эпителиев, особенно железистых и кишечных. В последнем случае плотный контакт образует сплошную зону слияния плазматических мембран, опоясывающую клетку в апикальной (верхней, смотрящей в просвет кишечника) ее части (рис. 148). Таким образом, каждая клетка пласта как бы обведена лентой этого контакта. Такие структуры при специальных окрасках можно видеть и в световом микроскопе. Они получили у морфологов название замыкающих пластинок. Оказалось, что в данном случае роль замыкающего плотного контакта заключается не только в механическом соединении клеток друг с другом. Эта область контакта плохо проницаема для макромолекул и ионов, и тем самым она запирает, перегораживает межклеточные полости, изолируя их (и вместе с ними собственно внутреннюю среду организма) от внешней среды (в данном случае - просвет кишечника).
Это можно продемонстрировать, используя электронноплотные контрастеры, например раствор гидроокиси лантана. Если просвет кишечника или протока какой-нибудь железы наполнить раствором гидроокиси лантана, то на срезах под электронным микроскопом зоны, где располагается это вещество, обладают высокой электронной плотностью и будут темными. Оказалось, что ни зона плотного контакта, ни межклеточные пространства, лежащие ниже его, не темнеют. Если же повредить плотные контакты (легкой ферментативной обработкой или удалением ионов Ca++), то лантан проникает и в межклеточные участки. Точно так же была доказана непроницаемость плотных контактов для гемоглобина и ферритина в канальцах почек.
Таким образом, плотные контакты являются барьерами не только для макромолекул, но и непроницаемы для жидкостей и ионов.
Замыкающий, или плотный, контакт встречается между всеми типами однослойного эпителия (эндотелий, мезотелий, эпендима).
Заякоривающие или сцепляющие соединения или контакты так называются из-за того, что они соединяют не только плазматические мембраны соседних клеток, но и связываются с фибриллярными элементами цитоскелета (рис. 149). Для этого рода соединений характерным является наличие двух типов белков. Один из них - это трансмембранные линкерные (связующие) белки, которые участвуют или в собственно межклеточном соединении или в соединении плазмолеммы с компонентами внеклеточного матрикса (базальная мембрана эпителиев, внеклеточные структурные белки соединительной ткани).
Второй - внутриклеточные белки, соединяющие или заякоревающие за мембранные элементы такого контакта цитоплазматические фибриллы цитоскелета.
К заякоревающим соединениям относятся межклеточные сцепляющие точечные контакты, сцепляющие ленты, фокальные контакты или бляшки сцепления - все эти контакты связываются внутри клеток с актиновыми микрофиламентами.
Другая группа заякоревающих межклеточных соединений - десмосомы и полудесмосомы - связываются с другими элементами цитоскелета, а именно с промежуточными филаментами.
Межклеточные точечные сцепляющие соединения обнаружены у многих неэпителиальных тканей, но более отчетливо описана структура специальных (адгезивных) лент в однослойных эпителиях (рис. 150). Это структура опоясывает весь периметр эпителиальной клетки, подобно тому как это происходит в случае плотного соединения. Чаще всего такой поясок или лента лежит ниже плотного соединения (см. рис. 146). В этом месте плазматические мембраны не сближены, а даже несколько раздвинуты на расстояние 25-30 нм, и между ними видна зона повышенной плотности. Это ничто иное как места взаимодействия трансмембранных гликопротеидов, которые специфически сцепляются друг с другом и обеспечивают механическое соединение мембран двух соседних клеток. Эти линкерные белки относятся к Е-кадгеринам - белкам, обеспечивающим специфическое узнавание клетками однородных мембран. Разрушение этого слоя гликопротеидов приводит к обособлению отдельных клеток и разрушению эпителиального пласта. С цитоплазматической стороны около мембраны видно скопление какого-то плотного вещества, к которому примыкает слой тонких (6-7 нм) филаментов, лежащих вдоль плазматической мембраны в виде пучка, идущего по всему периметру клетки. Тонкие филаменты относятся к актиновым фибриллам, они связываются с плазматической мембраной посредством белка катенина, образующего плотный около мембранный слой.
Функциональное значение такого ленточного соединения заключается на только в механическом сцеплении клеток друг с другом: при сокращении актиновых филаментов в ленте может изменяться форма клетки. Считается, что кооперативное сокращение актиновых фибрилл во всех клетках эпителиального пласта может вызвать изменение его геометрии, например, сворачивание в трубку, подобно тому, что происходит при образовании нервной трубки у эмбрионов позвоночных.
Фокальные контакты или бляшки сцепления встречаются у многих клеток и особенно хорошо изучены у фибробластов. Они построены по общему плану со сцепляющими лентами, но выражены в виде небольших участков - бляшек на плазмолемме. В этом случае трансмембранные линкерные белки-интегрины специфически связываются с белками внеклеточного матрикса (например с фибронектином) (рис. 151). Со стороны цитоплазмы эти же гликопротеиды связаны с примембранными белками, куда входит и винкулин, который в свою очередь связан с пучком актиновых филаментов. Функциональное значение фокальных контактов заключается как в закреплении клетки на внеклеточных структурах, так и создании механизма, позволяющего клеткам перемещаться.
Десмосомы, структуры в виде бляшек или кнопок также соединяют клетки друг с другом (рис. 152, 153а). В межклеточном пространстве здесь также виден плотный слой, представленный взаимодействующими интегральными мембранными кадгеринами - десмоглеинами, которые сцепляют клетки друг с другом. С цитоплазматической стороны к плазмолемме прилежит слой белка-десмоплакина, с которым связаны промежуточные филаменты цитоскелета. Десмосомы встречаются чаще всего в эпителиях, в этом случае промежуточные филаменты содержат кератины. В сердечной мышце клетки, кардиомиоциты, содержат десминовые фибриллы в составе десмосом. В эндотелии сосудов в состав десмосом входят виментиновые промежуточные филаменты.
Полудесмосомы - в принципе сходны по строению с десмосомой, но представляют собой соединение клеток с межклеточными структурами. Так в эпителиях линкерные гликопротеиды (интегрины) десмосомы взаимодействуют с белками т.н. базальной мембраны, куда входят коллаген, ламинин, протеогликаны и др.
Функциональная роль десмосом и полудесмосом сугубо механическая - они сцепляют клетки друг с другом и с подлежащим внеклеточным матриксом прочно, что позволяет эпителиальным пластам выдерживать большие механические нагрузки. Подобно этому десмосомы прочно связывают друг с другом клетки сердечной мышцы, что позволяет им выполнять огромную механическую нагрузку, оставаясь связанными в единую сокращающуюся структуру.
В отличие от плотного контакта все типы сцепляющих контактов проницаемы для водных растворов и не играют никакой роли в ограничении диффузии.
Щелевые контакты считаются коммуникационными соединениями клеток; это структуры, которые участвуют в прямой передаче химических веществ из клетки в клетку, что может играть большую физиологическую роль не только при функционировании специализированных клеток, но и обеспечивать межклеточные взаимодействия при развитии организма, при дифференцировке его клеток. Характерным для этого типа контактов является сближение плазматических мембран двух соседних клеток на расстояние 2-3 нм (рис. 147б, 153б). Именно это обстоятельство долгое время не позволяло на ультратонких срезах отличить данный вид контакта от плотного разделительного (замыкающего) контакта. При использовании гидроокиси лантана было замечено, что некоторые плотные контакты пропускают контрастер. В этом случае лантан заполнял тонкую щель шириной около 3 нм между сближенными плазматическими мембранами соседних клеток. Это и послужило появлению термина - щелевой контакт. Дальнейший прогресс в расшифровке его строения был достигнут при использовании метода замораживания-скалывания. Оказалось, что на сколах мембран зоны щелевых контактов (размеров от 0,5 до 5 мкм) усеяны гексагонально расположенными с периодом 8-10 нм частицами 7-8 нм в диаметре, имеющими в центре канал около 2 нм шириной. Эти частицы получили название коннексонов (рис. 154). В зонах щелевого контакта может быть от 10-20 до нескольких тысяч коннексонов в зависимости от функциональных особенностей клеток. Коннексоны были выделены препаративно, они состоят из шести субъединиц коннектина - белка с молекулярным весом около 30 тыс. Объединяясь друг с другом, коннектины образуют цилиндрический агрегат - коннексон, в центре которого располагается канал. Отдельные коннексоны встроены в плазматическую мембрану так, что прободают ее насквозь. Одному коннексону на плазматической мембране клетки точно противостоит коннексон на плазматической мембране соседней клетки так, что каналы двух коннексонов образуют единое целое. Коннексоны играют роль прямых межклеточных каналов, по которым ионы и низкомолекулярные вещества могут диффундировать из клетки в клетку. Было обнаружено, что коннексоны могут закрываться, изменяя диаметр внутреннего канала, и тем участвовать в регуляции транспорта молекул между клетками.
Функциональное значение щелевых контактов было понято при изучении гигантских клеток слюнных желез двукрылых. В такие клетки благодаря их величине легко можно вводить микроэлектроды, для того чтобы изучать электропроводимость их мембран. Оказалось, что если ввести электроды в две соседние клетки, то их плазматические мембраны проявляют низкое электрическое сопротивление, между клетками идет ток. Более того, оказалось, что при инъекции в одну клетку флуоресцирующего красителя метка быстро обнаруживается в соседних клетках. Используя разные флуорохромы, на клетках культуры ткани млекопитающих было обнаружено, что через щелевые контакты могут транспортироваться вещества с молекулярным весом не более 1-1,5 тыс. и размером не более 1,5 нм (у насекомых через щелевой контакт могут проходить вещества с молекулярным весом до 2 тыс.). Среди этих веществ были разные ионы, аминокислоты, нуклеотиды, сахара, витамины, стероиды, гормоны, цАМФ. Ни белки, ни нуклеиновые кислоты через щелевые контакты проходить не могут.
Такая способность щелевых контактов служить местом транспорта низкомолекулярных соединений используется в тех клеточных системах, где нужна быстрая передача электрического импульса (волны возбуждения) от клетки к клетке без участия нервного медиатора. Так, все мышечные клетки миокарда сердца связаны с помощью щелевых контактов (кроме того, клетки там связаны и адгезивными контактами) (рис. 147б). Это создает условие для синхронного сокращения огромного количества клеток. При росте культуры эмбриональных сердечных мышечных клеток (миокардиоциты) некоторые клетки в пласте начинают независимо друг от друга спонтанно сокращаться с разной частотой, и лишь только после образования между ними щелевых контактов они начинают биться синхронно как единый сокращающийся пласт клеток. Таким же способом обеспечивается совместное сокращение гладкомышечных клеток в стенке матки.
Щелевые контакты могут служить целям метаболической кооперации между клетками, обмениваясь различными молекулами, гормонами, цАМФ или метаболитами. Примером этого может служить совместное культивирование мутантных по тимидин-киназе клеток с нормальными: при возникновении щелевых контактов между этими типами клеток, мутантные клетки через щелевые контакты получали от нормальных клеток тимидин-трифосфат и могли участвовать в синтезе ДНК.
У ранних эмбрионов позвоночных, начиная с 8-клеточной стадии большинство клеток связано друг с другом щелевыми контактами. По мере дифференцировки эмбриона щелевые контакты между всеми клетками исчезают и остаются только между группами специализирующихся клеток. Например, при образовании нервной трубки связь клеток этой структуры с остальным эпидермисом прерывается, разобщается.
Целостность и функционирование щелевых контактов сильно зависит от уровня ионов Ca2+ внутри клетки. В норме концентрация кальция в цитоплазме очень низка. Если Ca2+ инъецировать в одну из клеток пласта культуры тканей, то в соседних клетках увеличения уровня Ca2+ в цитоплазме не происходит; клетки как бы разобщаются с соседями, перестают проводить электрический ток и красители. Через некоторое время, после того как введенный кальций будет аккумулирован митохондриями, структура и функции щелевых контактов восстанавливаются. Такое свойство очень важно для поддержания целостности и работы всего слоя клеток, так как повреждение одной из них не передается на соседний через щелевые контакты, которые перестают работать как межклеточные диффузионные каналы.
Синаптический контакт (синапсы). Этот тип контактов характерен для нервной ткани и встречается как между двумя нейронами, так и между нейроном и каким-либо иным элементом - рецептором или эффектором (например, нервно-мышечное окончание). Синапсы - участки контактов двух клеток, специализированных для односторонней передачи возбуждения или торможения от одного элемента к другому (рис. 155). В принципе подобного рода функциональная нагрузка, передача импульса может осуществляться и другими типами контактов (например, щелевым контактом в сердечной мышце), однако в синаптической связи достигается высокая эффективность в реализации нервного импульса. Синапсы образуются на отростках нервных клеток - это терминальные участки дендритов и аксонов. Межнейронные синапсы обычно имеют грушевидных расширений, бляшек на конце отростка нервной клетки. Такое терминальное расширение отростка одной из нервных клеток может контактировать и образовывать синаптическую связь как с телом другой нервной клетки, так и с ее отростками. Периферические отростки нервных клеток (аксоны) образуют специфические контакты с клетками-эффекторами или клетками-рецепторами. Следовательно, синапс - это структура, образующаяся между участками двух клеток (так же как и десмосома). Мембраны этих клеток разделены межклеточным пространством - синаптической щелью шириной около 20-30 нм. Часто в просвете этой щели виден тонковолокнистый, перпендикулярно расположенный по отношению к мембранам материал. Мембрана в области синаптического контакта одной клетки называется пресинаптической, другой, воспринимающей импульс, - постсинаптической. В электронном микроскопе обе мембраны выглядят плотными, толстыми. Около пресинаптической мембраны выявляется огромное количество мелких вакуолей, синаптических пузырьков, заполненных медиаторами. Синаптические пузырьки в момент прохождения нервного импульса выбрасывают свое содержимое в синаптическую щель. Постсинаптическая мембрана часто выглядит толще обычных мембран из-за скопления около нее со стороны цитоплазмы множества тонких фибрилл.
Плазмодесмы. Этот тип межклеточных связей встречается у растений. Плазмодесмы представляют собой тонкие трубчатые цитоплазматические каналы, соединяющие две соседние клетки. Диаметр этих каналов обычно составляет 20-40 нм. Ограничивающая эти каналы мембрана непосредственно переходит в плазматические мембраны соседствующих клеток. Плазмодесмы проходят сквозь клеточную стенку, разделяющую клетки (рис. 156, 157). Таким образом, у некоторых растительных клеток плазмодесмы соединяют гиалоплазму соседних клеток, поэтому формально здесь нет полного разграничения, отделения тела одной клетки от другой, это скорее представляет собой синцитий: объединение многих клеточных территорий с помощью цитоплазматических мостиков. Внутрь плазмодесм могут проникать мембранные трубчатые элементы, соединяющие цистерны эндоплазматического ретикулума соседних клеток. Образуются плазмодесмы во время деления клетки, когда строится первичная клеточная оболочка (см. ниже). У только что разделившихся клеток число плазмодесм может быть очень велико (до 1000 на клетку), при старении клеток их число падает за счет разрывов при увеличении толщины клеточной стенки.
Функциональная роль плазмодесм очень велика: с их помощью обеспечивается межклеточная циркуляция растворов, содержащих питательные вещества, ионы и другие соединения. По плазмодесмам могут перемещаться липидные капли Через плазмодесмы происходит заражение клеток растительными вирусами. Однако эксперименты показывают, что свободный транспорт через плазмодесмы ограничивается частицами с массой не более 800 дальтон.
Клеточная стенка (оболочка) растений
Если выделить любую клетку из организма животного и поместить ее в воду, то через короткое время клетка после набухания лопнет, лизируется. Это происходит из-за того, что через плазматическую мембрану вода будет поступать в цитоплазму, в зону с более высокой концентрацией солей и органических молекул. При этом будет увеличиваться внутренний объем клетки до тех пор, пока не разорвется плазматическая мембрана. В составе организма животных этого не происходит, потому что клетки низших и высших животных существуют в окружении жидкостей внутренней среды, концентрация солей и веществ в которой близка к таковой в цитоплазме. Свободноживущие в пресной воде одноклеточные простейшие организмы не лизируются (при отсутствии клеточной стенки) из-за того, что у них постоянно работает клеточный насос, откачивающий воду из цитоплазмы, - сократительная вакуоль.
Если же мы в воду поместим клетки бактерий или растений, то они не будут лизироваться до тех пор, пока цела их клеточная стенка. Воздействием набора различных ферментов эти стенки можно растворить. В этом случае моментально происходит набухание и разрыв, лизис, клеток. Следовательно, в естественных условиях клеточная стенка предотвращает этот гибельный для клетки процесс. Более того, наличие клеточных стенок является одним из главных факторов, регулирующих поступление воды в клетку. Клетки бактерий и растений обитают чаще всего в гипотонической водной среде, они не имеют сократительных (выделительных) вакуолей, чтобы откачать воду, но зато прочная клеточная стенка предохраняет их от чрезвычайного набухания. По мере поступления воды в клетке возникает внутреннее давление, тургор, которое препятствует дальнейшему поступлению воды.
Интересно, что у многих низших растений, например у зеленых водорослей, клетки имеют хорошо сформированную клеточную оболочку, но при половом размножении, когда образуются подвижные зооспоры, последние теряют клеточную оболочку и у них появляются пульсирующие вакуоли.
Клеточная стенка растений формируется при участии плазматической мембраны и является экстраклеточным (внеклеточным) многослойным образованием, защищающим поверхность клетки, служащим как бы наружным скелетом растительной клетки (рис. 158). Клеточная стенка растений состоит из двух компонентов: аморфного пластичного гелеобразного матрикса (основы) с высоким содержанием воды и опорной фибриллярной системы. Часто для придания свойств жесткости, несмачиваемости и др. в состав оболочек входят дополнительные полимерные вещества и соли.
В химическом отношении главные компоненты оболочек растений относятся к структурным полисахаридам.
В состав матрикса оболочек растений входят гетерогенные группы полисахаридов, растворяющиеся в концентрированных щелочах, гемицеллюлозы и пектиновые вещества. Гемицеллюлозы представляют собой ветвящиеся полимерные цепи, состоящие из различных гексоз (глюкоза, манноза, галактоза и др.), пентоз (ксилоза, арабиноза) и уроновых кислот (глюкуроновая и галактуроновая кислоты). Эти компоненты гемицеллюлоз сочетаются между собой в разных количественных отношениях и образуют разнообразные комбинации. Цепи гемицеллюлозных молекул не кристаллизуются и не образуют элементарных фибрилл. Из-за наличия полярных групп уроновых кислот они сильно гидратированы.
Пектиновые вещества - гетерогенная группа, в которую входят разветвленные сильно гидратированные полимеры, несущие отрицательные заряды из-за множества остатков галактуроновой кислоты. Благодаря свойствам своих компонентов матрикс представляет собой мягкую пластическую массу, укрепленную фибриллами.
Волокнистые компоненты клеточных оболочек растений состоят обычно из целлюлозы, линейного, неветвящегося полимера глюкозы. Молекулярный вес целлюлозы варьирует от 5 х 104 до 5 х 105, что соответствует 300-3000 остаткам глюкозы. Такие линейные молекулы целлюлозы могут соединяться в пучки или волокна. В клеточной оболочке целлюлоза образует фибриллы, которые состоят из субмикроскопических микрофибрилл толщиной до 25 нм, которые в свою очередь состоят из множества параллельно лежащих цепей молекул целлюлозы.
Количественные соотношения целлюлозы к веществам матрикса (гемицеллюлозы) могут быть весьма различными у разных объектов. Свыше 60% сухого веса первичных оболочек составляет их матрикс и около 30% приходится на скелетное вещество - целлюлозу. В сырых клеточных оболочках почти вся вода связана с гемицеллюлозами, поэтому вес основного вещества в набухшем состоянии достигает 80% сырого веса всей оболочки, тогда как содержание волокнистых веществ сводится всего к 12%. В случае же другого примера, волоски хлопчатника, целлюлозный компонент составляет 90%; в древесине целлюлоза составляет 50% от компонентов клеточной стенки.
Кроме целлюлозы, гемицеллюлозы и пектинов в состав клеточных оболочек входят дополнительные компоненты, придающие им особые свойства. Так, инкрустация (включение внутрь) оболочек лигнином (полимер кониферилового спирта) приводит к одревеснению клеточных стенок, повышению их прочности (рис. 159). Лигнин замещает в таких оболочках пластические вещества матрикса и играет роль основного вещества, обладающего высокой прочностью. Часто матрикс бывает укреплен минеральными веществами (SiO2, CaCO3 и др.).
На поверхностях клеточной оболочки могут скапливаться различные адкрустирующие вещества, например кутин и суберин, приводящие к опробковению клеток. В клетках эпидермиса на поверхности клеточных оболочек откладывается воск, который образует водонепроницаемый слой, препятствующий потере клеткой воды.
Из-за своего пористого, рыхлого строения клеточная стенка растений проницаема в значительной степени для низкомолекулярных соединений, таких как вода, сахара и ионы. Но макромолекулы проникают через целлюлозные оболочки плохо: величина пор в оболочках, позволяющая свободную диффузию веществ составляет всего лишь 3-5 нм.
Опыты с мечеными соединениями показали, что при росте клеточной оболочки выделение веществ, из которых она строится, происходит по всей поверхности клетки. Аморфные вещества матрикса, гемицеллюлозы и пектины синтезируются в вакуолях аппарата Гольджи и выделяются через плазмолемму путем экзоцитоза. Фибриллы целлюлозы синтезируются специальными ферментами, встроенными в плазмолемму.
Оболочки дифференцированных, зрелых, клеток обычно многослойные, в слоях фибриллы целлюлозы ориентированы по-разному, и количество их также может значительно колебаться. Обычно описывают первичные, вторичные и третичные клеточные оболочки (рис. 158). Для того чтобы разобраться в строении и появлении этих оболочек, необходимо познакомиться с тем, как же возникают, образуются клеточные оболочки после деления клеток.
При делении клеток растений после расхождения хромосом в экваториальной плоскости клеток появляется скопление мелких мембранных пузырьков, которые в центральной части клеток начинают сливаться друг с другом (рис. 160). Этот процесс слияния мелких вакуолей происходит от центра клетки к периферии и продолжается до тех пор, пока мембранные пузырьки не сольются между собой и с плазматической мембраной боковой поверхности клетки. Так образуется клеточная пластинка или фрагмопласт. В центральной части ее располагается аморфное вещество матрикса, которое наполняло сливающиеся пузырьки. Доказано, что эти первичные вакуоли происходят от мембран аппарата Гольджи. В состав первичной клеточной стенки входит также небольшое количество белка (около 10%), богатого гидроксипролином. имеющего множество коротких олигосахаридных цепей, что определяет этот белок как гликопротеид. По периферии клеточной пластинки при наблюдении ее в поляризованном свете обнаруживается заметное двойное лучепреломление, вызванное тем, что в этом месте располагаются ориентированные фибриллы целлюлозы. Таким образом, растущая первичная клеточная стенка состоит уже из трех слоев: центральный - срединная пластинка, состоящая только из аморфного матрикса, и два периферических - первичная оболочка, содержащая гемицеллюлозу и целлюлозные фибриллы. Если срединная пластинка - это продукт активности еще исходной клетки, то первичная оболочка образуется за счет выделения гемицеллюлозы и фибрилл целлюлозы уже двумя новыми клеточными телами. И все дальнейшее увеличение толщины клеточной (вернее, межклеточной) стенки будет происходить за счет активности двух дочерних клеток, которые с противоположных сторон будут выделять вещества клеточной оболочки, утолщающейся путем подслаивания все новых и новых пластов. Так же как и с самого начала, выделение веществ матрикса происходит за счет подхода к плазматической мембране пузырьков аппарата Гольджи, слияния их с мембраной и высвобождения их содержимого за пределы цитоплазмы. Здесь же вне клетки на ее плазматической мембране идет синтез и полимеризация целлюлозных фибрилл. Так постепенно образуется вторичная клеточная оболочка. С достаточной точностью определить и суметь отличить первичную оболочку от вторичной трудно, так как они соединены между собой несколькими промежуточными слоями.
Основную массу закончившей свое формирование клеточной стенки составляет вторичная оболочка. Она придает клетке ее окончательную форму. После разделения клетки на две дочерних происходит рост новых клеток, увеличение их объема и изменение формы; клетки часто вытягиваются в длину. Одновременно с этим идет наращивание толщины клеточной оболочки и перестройка ее внутренней структуры.
При образовании первичной клеточной оболочки в ее составе еще мало целлюлозных фибрилл, и они располагаются более или менее перпендикулярно будущей продольной оси клетки, позже в период растяжения (удлинения клетки за счет роста вакуолей в цитоплазме) ориентация этих поперечно-направленных фибрилл подвергается пассивным изменениям: фибриллы начинают размещаться под прямым углом друг к другу и в конечном счете оказываются вытянутыми более или менее параллельно продольной оси клетки. Постоянно идет процесс: в старых слоях (ближе к центру оболочки) фибриллы подвергаются пассивным сдвигам, а отложение новых фибрилл во внутренних слоях (ближайших к мембране клетки) продолжается в соответствии с исходным планом конструкции оболочки. Этот процесс создает возможность скольжения фибрилл относительно друг друга, а перестройка арматуры клеточной оболочки возможна из-за студенистого состояния компонентов ее матрикса. В дальнейшем при замещении в матриксе гемицеллюлозы на лигнин подвижность фибрилл резко снижается, оболочка становится плотной, происходит одревеснение.
Часто под вторичной оболочкой обнаруживают третичную оболочку, которую можно рассматривать как засохший остаток дегенерировавшего слоя собственно цитоплазмы.
Следует отметить, что при делении клеток растений формированию первичной оболочки не во всех случаях предшествует образование клеточной пластинки. Так, у зеленой водоросли спирогиры новые поперечные перегородки возникают путем образования на боковых стенках исходной клетки выступов, которые, постепенно разрастаясь к центру клетки, смыкаются и делят клетку надвое.
Как уже говорилось, если в водной гипотонической среде лишить клетку ее оболочки, то произойдет лизис, разрыв клетки. Оказалось, что, подбирая соответствующие концентрации солей и сахаров, можно уравнять осмотические давления снаружи и внутри клеток, лишенных своих оболочек. При этом такие протопласты приобретают шаровидную форму (сферопласты). Если в среде, где находятся протопласты, будет достаточное количество питательных веществ и солей (среди них необходим Ca2+), то клетки снова восстанавливают , регенерируют свою клеточную оболочку. Более того, они способны в присутствии гормонов - ауксинов - делиться и создавать клеточные колонии, которые могут дать начало для роста целого растения, от которого была взята клетка.
Главный волокнистый компонент клеточной стенки больших групп грибов (базибиомицеты, аскомицеты, зигомицеты) - хитин, полисахарид, где основным сахаридом является N-ацетилглюкозамин. В состав клеточной стенки грибов кроме хитина могут входить вещества матрикса, гликопротеиды и различные белки, синтезированные в цитоплазме и выделенные клеткой наружу.
Клеточные оболочки бактерий
Опорным каркасом клеточной стенки бактерий и синезеленых водорослей также служит в значительной степени однородный полимер - пептидогликан или муреин. Жесткий каркас, окружающий бактериальную клетку, представляет собой одну гигантскую мешковидную молекулу сложного полисахарида-пептида. Каркас этот называют муреиновым мешком. Основа структуры муреинового мешка - сеть параллельных полисахаридных цепей, построенных из чередующихся дисахаридов (ацетилглюкозамин, соединенный с ацетилмурамовой кислотой), связанных многочисленными пептидными поперечными связями (рис. 161). Длина цепочек гликана может быть огромной - до нескольких сот дисахаридных блоков. Основу пептидной части муреина составляют тетрапептиды, образованные различными аминокислотами.
Бактериальная стенка может составлять до 20-30% от сухого веса бактерии. Это связано с тем, что в ее состав кроме многослойного муреинового каркаса входит большое количество дополнительных компонентов, как и в матриксе стенки растений. У грамположительных бактерий (при окраске по Граму (окраска кристаллическим фиолетовым, обработка иодом, отмывка спиртом) бактерии по-разному воспринимают краситель: грамположительные остаются окрашенными после обработки спиртом; грамотрицательные обесцвечиваются). сопутствующими компонентами служат полимерные вещества, сложным образом вплетенные в муреиновую сеть. К ним относятся тейхоевые кислоты, полисахариды, полипептиды и белки. Клеточная стенка грамположительных бактерий обладает большой жесткостью, ее муреиновая сеть многослойна.
Стенки грамотрицательных бактерий содержат однослойную муреиновую сеть, составляющую 12% сухой массы стенки. Сопутствующие компоненты составляют до 80% сухой массы. Это липопротеиды, сложные липополисахариды. Они образуют сложную наружную липопротеиновую мембрану. Следовательно, периферия грамотрицательных бактерий содержит наружную мембрану, затем однослойную муреиновую сеть, ниже нее расположена плазматическая мембрана (рис. 162). Наружная мембрана обеспечивает структурную целостность клетки, служит барьером, ограничивающим свободный доступ разных веществ к плазматической мембране. На ней также могут располагаться рецепторы для бактериофагов. Она содержит белки-порины, которые участвуют в переносе многих низкомолекулярных веществ. Молекулы порина образуют тримеры, проходящие сквозь толщу мембраны. Одна из функций этих белков - формирование в мембране гидрофильных пор, через которые происходит диффузия молекул, не более 900 дальтон. Через поры проходят свободно сахара, аминокислоты, небольшие олигосахариды и пептиды. Поры образованы разными поринами, обладают разной проницаемостью.
Между внешней липопротеидной мембраной бактериальной стенки и плазматической мембраной лежит периплазматическое пространство или периплазма. Ее толщина обычно составляет около 10 нм, она содержит тонкий (1-3 нм) муреиновый слой и раствор, содержащий специфические белки двух типов - гидролитические ферменты и транспортные белки. Из-за наличия гидролаз иногда периплазму рассматривают как аналог лизосомного компартмента эукариот. Периплазматические транспортные белки связывают и переносят сахара, аминокислоты и др. от внешней мембраны к плазмолемме.
Предшественники стенок бактерий синтезируются внутри клетки, сборка стенок происходит снаружи от плазматической мембраны.
Под действием фермента лизоцима можно разорвать муреиновый каркас и растворить бактериальную стенку. В гипотонических условиях клетки при этом разрушаются, как разрушаются голые клетки животных и растений; в изотонических условиях образуются шаровидные протопласты, которые способны снова вырабатывать свою клеточную стенку.
Интересно, что протопласты бактерий нечувствительны к действию бактериофагов- вирусов, паразитирующих на бактериях. Следовательно, компоненты бактериальной стенки обладают антигенной специфичностью по отношению к этим вирусам.

Глава 14. Вакуолярная система внутриклеточного транспорта
Вакуолярная система, состоящая из одномембранных разнообразных по строению и функциям органелл (эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы, эндосомы, секреторные вакуоли) выполняют общую функцию синтеза, перестройки (модификации), сортировки и выведения (экспорта) из клетки биополимеров, главным образом белков-гликопротеидов, а также функцию синтеза мембран этой системы и плазматической мембраны.
Необходимо отметить, что синтез основной массы клеточных белков протекает на полисомах в цитозоле. Особенностью белкового синтеза в цитозоле является то, что в зависимости от типа иРНК синтезируются различные белки, направляющиеся строго к своим внутриклеточным компонентам. Это связано с тем, что разные по назначению белки имеют определенные "сигнальные" последовательности аминокислот, как бы адреса, по которым разные белки распределяются в клетке. Так ядерные белки имеют NLS-сигнальную последовательность, белки митохондрий имеют свою, так же как белки цитозоля, цитоскелета, пластид и пероксисом - свои сигнальные последовательности. Характерным является то, что все типы перечисленных белков начинают и заканчивают синтез в цитозоле, и затем посттрансляционно с помощью внутриклеточных белковых комплексов переносятся "по адресам".
В отличие от этих типов белков, белки экспортного назначения и белки мембран синтезируются на рибосомах, расположенных на мембранах эндоплазматического ретикулума и попадают внутрь вакуолей, по мере синтеза полипептидной цепи, котрансляционно. Затем эти белки уже внутри вакуолей, или в составе мембран вакуолей транспортируются внутри клетки.
Общая схема функционирования вакуолярной системы
На рис. 163 представлены мембранные везикулярные компоненты, объединенные в единую функциональную систему. Все они имеют ряд общих свойств: это - одномембранные компартменты, имеющие один общий источник образования (гранулярный эндоплазматический ретикулум). Для всей вакуолярной системы характерна кооперативность ее функционирования, взаимосвязь и последовательность этапов образования, перестройки, транспорта и экспорта синтезированных белков. Вкратце функции отдельных компонентов заключаются в следующем:
1. Гранулярный эндоплазматический ретикулум: котрансляционный синтез растворимых внутривакуолярных белков (секреторные белки, гидролазы лизосом и др.); котрансляционный синтез нерастворимых белков, входящих в состав всех мембран вакуолярной системы; первичная модификация растворимых и нерастворимых (мембранных) белков, их соединение с олигосахаридами - гликозилирование синтезированных белков, образование гликопротеидов; синтез мембранных липидов и их встраивание в мембрану - "сборка мембран".
2. Отделение вакуолей, содержащих новообразованные продукты и их переход в цис-зону аппарата Гольджи (ЭР-АГ комплекс).
3. Цис-зона аппарата Гольджи: вторичная модификация гликопротеидов; синтез полисахаридов (гемицеллюлоза растений) и гексозаминогликанов.
4. Промежуточная зона аппарата Гольджи: дополнительные модификации гликопротеидов, трансгликозилирование.
5. Транс-Гольджи сеть: сортировка секреторных и лизосомных белков; отделение вакуолей.
6. Экзоцитоз (секреция).
7. Экзоцитоз постоянный.
8. Отделение первичных лизосом с гидролазами.
9. Эндоцитоз.
10. Вторичная лизосома.
11. Рециклизация рецепторов гидролаз.
12. Рециклизация рецепторов плазматической мембраны.
13. Гладкий эндоплазматический ретикулум: синтез и конденсация липидов, депонирование ионов Ca2+, синтез и ресорбция гликогена и др.
14. Транспорт в зону аппарата Гольджи.
15. Транспорт от аппарата Гольджи в эндоплазматический ретикулум.
Гранулярный эндоплазматический ретиклум
Отличительной чертой вакуолярной системы является то, что синтезированные полимеры и продукты их превращений отделены от собственно цитоплазмы, от цитозоля, и становятся изолированными от цитозольных ферментов. Такое разобщение очень важно для одновременного протекания в клетке многих синтетических процессов.
Открытие этой внутриклеточной мембранной структуры произошло на заре электронной микроскопии. В 1945 г. К Портер с сотрудниками изучал фибробласты цыплят в электронном микроскопе. В это время еще не была разработана техника ультратонких срезов, поэтому авторы просматривали клетки на просвет, целиком. В световом микроскопе в фибрибластах после фиксации и окраски видно, что периферия клеток (эктоплазма) окрашивается слабо, в то время как центральная часть клеток (эндоплазма) хорошо воспринимает красители. Портер увидел в электронном микроскопе, что зона эндоплазмы заполнена большим числом мелких вакуолей и каналов, соединяющихся друг с другом и образующих что-то наподобие рыхлой сети (ретикулум). Было видно, что стопки этих вакуолей и канальцев ограничены тонкими мембранами. Так был обнаружен эндоплазматический ретикулум, или эндоплазматическая сеть. Позднее, в 50-х гг., при использовании метода ультратонких срезов удалось выяснить структуру этого образования и обнаружить его неоднородность. Самым же главным оказалось, что эндоплазматический ретикулум (ЭР) встречается практически у всех эукариот.
Подобный электронно-микроскопический анализ позволил выделить два типа ЭР: гранулярный (шероховатый) и гладкий.
На ультратонких срезах гранулярный ЭР представлен замкнутыми мембранами, которые образуют на сечениях вытянутые мешки, цистерны или же имеют вид узких каналов (рис. 164, 165). Ширина полостей цистерн может очень варьировать в зависимости от функциональной активности клетки. Наименьшая ширина их может составлять около 20 нм, в расширенном виде они достигают диаметра в несколько мкм. Отличительной чертой этих мембран является то, что они со стороны гиалоплазмы покрыты мелкими (около 20 нм) темными, почти округлыми частицами, гранулами.
Впервые эти гранулы были описаны Дж. Паладе (гранулы Паладе), который доказал, что они представляют собой рибонуклеопротеиды. Теперь хорошо известно, что эти гранулы являются ни чем иным, как рибосомами, связанными с мембранами ЭР. На мембранах рибосомы расположены в виде полисом (множество рибосом, объединенных одной информационной РНК), имеющих вид плоских спиралей, розеток или гроздей. Это работающие, синтезирующие белок рибосомы, которые прикрепляются к мембранам своей большой субъединицей.
Гранулярный (или шероховатый, в отличие от гладкого) ЭР может в клетках быть представлен или в виде редких разрозненных мембран или же в виде локальных скоплений таких мембран (эргастоплазма) (рис. 166). Первый тип гранулярного ЭР характерен для недифференцированных клеток или клеток с низкой метаболической активностью. Эргастоплазма характерна для клеток, активно синтезирующих секреторные белки. Так, в клетках печени гранулярный ЭР собран в отдельные зоны (тельца Берга), так же как в некоторых нервных клетках (тигроид). В клетках поджелудочной железы гранулярный ЭР (эргастоплазма) в виде плотно упакованных друг около друга мембранных цистерн занимает базальную и околоядерную зоны клетки.
Наличие полисом на мембранах однозначно показывает на то, что гранулярный ЭР является важным местом синтеза белков.
Количество рибосом на ЭР четко связано с его синтетической активностью. Так, на мембранах ЭР в клетке несекретирующей молочной железы связывается до 25% клеточных рибосом, после стимуляции лактации их количество там возрастает до 70%. Падение числа рибосом на мембранах ЭР может происходить при дифференцировке клеток. Например, при частичном удалении печени у грызунов резко стимулируется деление клеток в оставшейся части. Это сопровождается редукцией гранулярного ЭР и обеднение его рибосомами: число свободных рибосом, не связанных с мембранами, достигает 40%. Такое же уменьшение числа рибосом, связанных с ЭР, наблюдается при различных патологических состояниях клеток ( при алкагольном хроническом отравлении происходит уменьшение числа связанных рибосом на 25%).
Рибосомы, связанные с мембранами ЭР, участвуют в синтезе белков, выводимых из данной клетки, "экспортируемых" белков.
Действительно, большое число клеток многоклеточных организмов, богатых гранулярным ЭР, синтезирует и выводит огромное количество белков. Так, например, клетки ацинусов поджелудочной железы синтезируют и выделяют массу белков - ферментов, участвующих в расщеплении пищи в кишечном тракте (протеиназы, липазы, нуклеазы и др.); клетки печени - альбумины крови; плазмоциты - ?-глобулины; молочной железы - казеин; слюнной железы - пищеварительные ферменты, амилазу и РНКазу и т.д. Такая же картина наблюдается у растений: железистые клетки, выделяющие белковые вещества, богаты гранулярным ЭР. Другими словами, у многоклеточных организмов клетки, богатые эргастоплазмой, синтезируют выводимые из этих клеток белки, необходимые или для работы других клеток, или для выполнения общеорганизменных функций (пищеварительные ферменты, белки плазмы крови, гормоны и др.).
У одноклеточных также можно наблюдать гранулярный ЭР, который, по-видимому, участвует в синтезе выводимых экспортируемых белков. Среди таких белков могут быть не только ферменты внеклеточного пищеварения.
Следовательно, роль гранулярного ЭР заключается не просто в участии в синтезе белков на рибосомах его мембран, но и в процессе сегрегации, обособления этих синтезированных белков, в их изоляции от основных функционирующих белков клетки. Эта функциональная особенность гранулярного ЭР очень важна, так как она связана с целым рядом процессов, приводящих к выделению таких белков с помощью вакуолей аппарата Гольджи.
Котрансляционный синтез растворимых белков
Пути синтеза белков на рибосомах ЭР можно представить в следующем виде (рис. 167). Еще в гиалоплазме происходит связывание иРНК, кодирующей секреторный белок, с рибосомой и начинается синтез белковой цепи. Важным является то, что сначала синтезируется "сигнальная последовательность" , богатая гидрофобными аминокислотами. В нее входит 16-30 аминокислот. Эта "сигнальная последовательность" в цитозоле узнается и связывается с "узнающей сигнал частицей" (SRP-частица), состоящей из одной молекулы 7S РНК и 6 различных полипептидных цепей. SRP-частица связывается после узнавания сигнального конца синтезирующейся молекулы белка с рибосомой, что приводит к полной остановке синтеза белка. На поверхности же мембраны ЭР, обращенной к гиалоплазме расположены интегральные рецепторные белки, связывающиеся с SRP-частицами. В результате SRP-частица связывается со своим рецептором и одновременно связывает данную рибосому с мембраной ЭР.
Такая "заякоренная" рибосома с SRP-частицей, блокирующей дальнейший рост полипептидной цепи, взаимодействует с большим белковым комплексом, транслаконом. После связывания рибосомы с транслаконом происходит отделение SRP-частицы и синтезированный первичный пептид входит в канал диметром около 2 нм, который образует транслакон. После этого возобновляется синтез полипептида, он удлиняется и его сигнальная последовательность, вместе с растущей цепочкой оказывается внутри полости цистерны ЭР. Таким образом синтезируемый белок проходит сквозь мембрану ЭР во время его синтеза, т.е. котрансляционно, одновременно с его трансляцией. Внутри полости ЭР с помощью фермента (сигнальная петидаза) сигнальная последовательность отщепляется. После окончания синтеза вся белковая молекула оказывается в полости ЭР и в это время рибосома отделяется от транслакона и диссоциирует. После этого в транслаконе канал закрывается. Во время трансмембранного переноса растущей белковой цепи происходит ее связь с олигосахаридами (гликозилирование - см. ниже). В полости цистерн ЭР белки претерпевают ряд дополнительных изменений: образуются дисульфидные связи, происходит их правильное сворачивание, происходит сборка четвертичной структуры белков. Только белки с правильной конформацией в дальнейшем будут переноситься в зону аппарата Гольджи.
Синтез нерастворимых (мембранных) белков
В гранулярном ЭР происходит синтез белков, которые, встраиваясь в мембрану ЭР, становятся интегральными мембранными белками (рис. 168).
Начальные стадии синтеза мембранных белков похожи на таковые при синтезе растворимых белков. Здесь также участвуют SRP-частицы, узнающие сигнальную последовательность, также происходит прохождение начального участка белковой цепи через транслакон. Однако в цепи синтезирующегося мембранного белка существует одна или несколько аминокислотных стоп-последовательностей, которые препятствуют белковой цепи пересекать мембрану и белок в области стоп-сигнала остается связанным с мембраной, но при этом синтез белка на рибосоме не останавливается. Это приводит к тому, что в области стоп-сигнала локализуется гидрофобный ?-спиральный участок, а весь белок остается встроенным в мембрану. В некоторых белках число ?-спиральных "заякоревающих" участков может быть от одного до нескольких. Так, например, белок транспорта глюкозы (GLUT-1) имеет 12 таких участков. Мембранные белки, также как и растворимые могут подвергаться различным модификациям. Наиболее характерной из них для ЭР является первичное гликозилирование - ковалентное связывание белковой цепи со сложным олигосахаридом. В результате этого синтезирующийся белок становится гликопротеидом.
Большинство белков, синтезированных в гранулярном ЭР, относится к гликопротеидам. Связывание синтезирующейся белковой цепи с олигосахаридами происходит также котрансляционно. При этом на белковую молекулу переносится готовый блок олигосахаридов, который связывается с аспарагиновыми остатками белковой молекулы (рис. 169). Этот олигосахаридный комплекс содержит 2 молекулы N-ацетилгликозамина, 9 молекул маннозы и 3 молекулы глюкозы и связан со специальным липидом долихолом на внутренней поверхности мембраны ЭР, смотрящей в просвет вакуоли ЭР. По мере транслокации белковой цепи во время ее синтеза, каждый аспарагиновый остаток связывается с олигосахаридным комплексом, с помощью фермента, являющегося интегральным белком мембран ЭР. Первичной модификации, гликозилированию, подвергаются как растворимые, так и мембранные белки, синтезирующиеся в ЭР.
Синтез клеточных мембран
Итак, на рибосомах ЭР происходит синтез основной части мембранных белков клетки. Синтез этих белков отличается от синтеза секреторных тем, что по мере синтеза мембранные белки не освобождаются от мембран, а остаются в их составе, становясь таким образом или трансмембранными интегральными белками, или полуинтегральными.
В ЭР происходит синтез и сборка липидов самих мембран, включая фосфолипиды и холестерол. Ферменты, участвующие в синтезе липидов, встроены в мембрану ЭР со стороны цитозоля, и синтез липидов происходит на мембране там же. Таким образом синтезированные липиды встраиваются в мембрану ЭР в липидный слой со стороны цитоплазмы, но переносятся на внутреннюю сторону с помощью переносчиков фосфолипидов. Таким образом билипидный слой мембраны растет, увеличивая поверхность вакуоли или цистерны ЭР. Этот процесс идет одновременно с синтезом интегральных мембранных белков, так что липопротеидная мембрана, как таковая, строится и растет за счет двух процессов: синтеза и встраивания липидов, и синтеза и интеграции мембранных белков. Необходимо подчеркнуть, что такое "зарождение" мембран вакуолярной системы происходит только в гранулярном ЭР.
Сегодня можно сказать, что важнейшей функцией гранулярного ЭР, вне зависимости от специализации или тканевой принадлежности клеток, является функция образования, построения клеточных мембран, которая заключается в том, что элементы гранулярного ЭР синтезируют все мембранные белки, синтезируют липидный компонент мембран, но, кроме того, именно в гранулярном ЭР происходит сборка липопротеидных мембран.
Этот процесс хорошо прослежен и проанализирован на примере образования вируса везикулярного стоматита (VSV) (рис. 170). Это РНК-содержащий вирус, построенный из небольшого числа белков и покрытый снаружи липопротеидной мембраной. В зрелой частице VSV кроме одной молекулы РНК есть белок, входящий в рибонуклеопротеидный комплекс (N-белок), белок, крепящий этот комплекс с окружающей мембраной (М-белок), и специфический белок мембранной оболочки (G-белок). Мембранная оболочка VSV произошла от клетки хозяина, в которой этот вирус развивается: по мере выхода РНП вируса происходит образование выроста плазматической мембраны, напоминающего короткую микроворсинку, куда включается нуклеоид (РНП) вируса, затем такой вырост отделяется от поверхности клетки, и получается готовая зрелая частица VSV. Благодаря G-белку такая частица может специфически контактировать с незараженной клеткой; мембрана VSV и плазматические мембраны клеток сливаются, а вирусный рибонуклеопротеид оказывается в цитоплазме клетки, где развивается инфекционный процесс. При этом останавливаются синтезы нормальных белков клетки-хозяина, и начинается синтез только вирусных белков на рибосомах инфицированной клетки. Вирусная РНК кодирует только пять белковых молекул. Две из них являются ферментами, необходимыми для репликации и транскрипции вирусного генома, третья - N-белок, четвертая кодирует M-белок, пятая - специфический гликопротеин, G-белок. Это интегральный белок мембраны, окружающий зрелую вирусную частицу. G-белок состоит из 550 аминокислот и имеет две боковые полисахаридные цепи. Он асимметрично расположен в мембране, большая его часть вместе с углеводными цепочками торчит наружу, а 30 аминокислот локализованы с цитоплазматической стороны мембраны.
При заражении клеток VSV с молекулы его РНК считывается пять разных иРНК, с помощью которых на рибосомах клетки происходит синтез вирусных белков. N-белок и M-белок синтезируются на свободных полисомах и связываются с размножившимися молекулами вирусной РНК и с мембраной клетки. Синтез G-белка происходит на полисомах гранулярного эндоплазматического ретикулума. В этом случае синтез G-белка также начинается с синтеза "сигнальной" аминокислотной последовательности, которая проходит сквозь мембрану и как бы тянет за собой остальную растущую цепь аминокислот. Однако, в отличие от секреторных белков G-белок остается связанным с мембраной ЭР. Большая его часть находится в просвете цистерн ЭР, где она принимает специфическую конформацию и присоединяет два первичных участка углеводных цепей. Часть молекулы G-белка погружена и проходит через билипидный слой мембраны, а небольшой участок С-конца торчит на цитоплазматической части мембраны. Дальнейшая судьба G-белка хорошо прослежена: через 20-30 мин после синтеза он обнаруживается в составе интегральных белков аппарата Гольджи. Здесь происходит дополнительный рост его углеводных цепей. Позже его обнаруживают в составе интегральных белков плазматической мембраны.
Из этих экспериментов следует, что интегральные белки мембран эндоплазматического ретикулума, мембран аппарата Гольджи, секреторных вакуолей и плазматической мембраны имеют одно происхождение: они синтезируются и встраиваются в мембрану в гранулярном ЭР.
Следовательно, гранулярный эндоплазматический ретикулум представляет собой настоящую "фабрику" клеточных мембран. От того, какие интегральные и периферические белки будут синтезироваться на рибосомах ЭР, и от того, какие фосфолипиды будут здесь синтезироваться и включаться в мембрану, будет зависеть тип образующегося нового участка мембраны; будет ли он компонентом гладкого ЭР, мембран аппарата Гольджи, лизосомы, или плазматической мембраны.
Транспорт между ЭР и аппаратом Гольджи
Дистальные участки гранулярного ЭР, которые расположены в зоне, приближенной к аппарату Гольджи (АГ), теряют рибосомы и образуют мембранные выступы, от которых отпочковываются мелкие вакуоли, содержащие синтезированные в ЭР белки. Эта зона называется ЭР-АГ-промежуточный компартмент (ERGIC) или везикулярно-тубулярная группа (VTC) (рис. 171). Вакуоли, отщепившиеся в этой зоне от ЭР, транзитные элементы, покрыты окаймляющим белковым слоем, аналогичным клатриновому слою эндоцитозных вакуолей. Белки этого слоя также относятся к COP-белкам, в данном случае отщепляющиеся вакуоли покрыты комплексом COP II, состоящим из нескольких гетеродимеров, связанных с мембраной посредством белка Sar 1p, малой ГТФазой (рис. 172). Отделившиеся от ЭР вакуоли становятся окаймленными пузырьками, затем они теряют белковую оболочку и сливаются друг с другом и транспортируются с помощью микротрубочек к цис-зоне аппарата Гольджи, где и сливаются с его мембранами. Адресность и точность слияния любых вакуолей с другими мембранами определяется специальными белками SNARE (рецептор белков, участвующих в прикреплении и слиянии мембран).
После деполимеризации окаймляющего слоя COP II на поверхности вакуоли открываются интегральные мембранные белки - V-SNARE. Эти белки специфичны для каждого типа вакуолей, направляя их к тому участку, где они должны слиться с другими мембранами. Там они связываются с мембранными белками T-SNARE и SNAP25 (рис. 173). В местах взаимодействия этих двух групп белков и происходит слияние мембран.
Таким образом происходит транспорт синтезированных белков в зону аппарата Гольджи.
Глава 15. Аппарат (комплекс) Гольджи
В 1898 г. итальянский ученый К. Гольджи, используя свойства связывания тяжелых металлов (осмия и серебра) с клеточными структурами, выявил в нервных клетках сетчатые образования, которые он назвал "внутренним сетчатым аппаратом" (рис. 174). Дальнейшее усовершенствование метода окраски металлами (импрегнации) дало возможность убедиться, что сетчатые структуры (аппарат Гольджи) встречаются во всех клетках любых эукариотных организмов. Обычно элементы аппарата Гольджи расположены около ядра, вблизи клеточного центра (центриоли). Участки аппарата Гольджи, четко выявляемые методом импрегнации, имели в некоторых клетках вид сложных сетей, где ячейки были связаны друг с другом или представлялись в виде отдельных темных участков, лежащих независимо друг от друга (диктиосомы), имеющих вид палочек, зерен, вогнутых дисков и т.д. (рис. 175). Между сетчатой и диффузной формой аппарата Гольджи нет принципиального различия, так как часто в одних и тех же клетках наблюдается смена форм этого органоида. Элементы аппарата Гольджи часто связаны с вакуолями, что особенно характерно для секретирующих клеток.
Было обнаружено, что морфология АГ меняется в зависимости от стадий клеточной секреции, что послужило основанием Д.Н. Насонову (1924) выдвинуть гипотезу о том, что АГ является органоидом, обеспечивающим сепарацию и накопление веществ в самых различных клетках.
Долгое время в растительных клетках не удавалось обнаружить элементов аппарата Гольджи обычными методами микротехники. Однако с появлением метода электронной микроскопии элементы АГ были обнаружены во всех растительных клетках, где они расположены по периферии клетки.
Тонкое строение аппарата Гольджи
В электронном микроскопе видно, что аппарат Гольджи представлен мембранными структурами, собранными вместе в небольшой зоне (рис. 176, 177). Отдельная зона скопления этих мембран является диктиосомой (рис. 178). В диктиосоме плотно друг к другу (на расстоянии 20-25 нм) расположены в виде стопки плоские мембранные мешки, или цистерны, между которыми располагаются тонкие прослойки гиалоплазмы. Каждая отдельная цистерна имеет диаметр около 1 мкм и переменную толщину; в центре ее мембраны могут быть сближены (25 нм), а на периферии иметь расширения, ампулы, ширина которых непостоянна. Количество таких мешков в стопке обычно не превышает 5-10. У некоторых одноклеточных их число может достигать 20 штук. Кроме плотно расположенных плоских цистерн в зоне АГ наблюдается множество вакуолей. Мелкие вакуоли встречаются главным образом в периферических участках зоны АГ; иногда видно, как они отшнуровываются от ампулярных расширений на краях плоских цистерн. Принято различать в зоне диктиосомы проксимальный или формирующийся, цис-участок, и дистальный или зрелый, транс-участок (рис. 178). Между ними располагается средний или промежуточный участок АГ.
Во время деления клеток сетчатые формы АГ распадаются до диктиосом, которые пассивно и случайно распределяются по дочерним клеткам. При росте клеток общее количество диктиосом увеличивается.
В секретирующих клетках обычно АГ поляризован: его проксимальная часть обращена к цитоплазме и ядру, а дистальная - к поверхности клетки. В проксимальном участке к стопкам сближенных цистерн примыкает зона мелких гладких пузырьков и коротких мембранных цистерн. В образцах препаративно выделенных зон АГ при негативном контрастировании видно, что к проксимальной части диктиосомы примыкает сетевидная или губкообразная система мембранных полостей. Считается, что эта система может представлять собой зону перехода элементов ЭР в зону аппарата Гольджи (рис. 179).
В средней части диктиосомы периферия каждой цистерны также сопровождается массой мелких вакуолей около 50 нм в диаметре.
В дистальном или транс-участке диктиосом к последней мембранной плоской цистерне примыкает участок, состоящий из трубчатых элементов и массой мелких вакуолей, часто имеющих фибриллярную опушенность по поверхности со стороны цитоплазмы - это опушенные или окаймленные пузырьки такого же типа, как и окаймленные пузырьки при пиноцитозе. Это - так называемая транс-сеть аппарата Гольджи (TGN), где происходит разделение и сортировка секретируемых продуктов. Еще дистальнее располагается группа более крупных вакуолей - это уже продукт слияния мелких вакуолей и образования секреторных вакуолей.
При изучении толстых срезов клеток в мегавольтный электронный микроскоп было найдено, что в клетках отдельные диктосомы могут быть связаны друг с другом системой вакуолей и цистерн. Так что образуется рыхлая трехмерная сеть, выявляемая в световом микроскопе. В случае диффузной формы АГ каждый отдельный его участок представлен диктиосомой. У клеток растений преобладает диффузный тип организации АГ, обычно в среднем на клетку приходится около 20 диктиосом. В клетках животных часто с зоной мембран аппарата Гольджи ассоциированы центриоли; между радиально отходящих от них пучков микротрубочек лежат группы стопок мембран и вакуолей, которые концентрически окружают клеточный центр. Эта связь, вероятно, отражает участие микротрубочек в движении вакуолей.
Секреторная функция аппарата Гольджи
Мембранные элементы АГ участвуют в сегрегации и накоплении продуктов, синтезированных в ЭР, участвуют в их химических перестройках, созревании: это, главным образом перестройка олигосахаридных компонентов гликопротеинов в составе водорастворимых секретов или в составе мембран (рис. 180).
В цистернах АГ происходит синтез полисахаридов, их взаимосвязь с белками, приводящая к образованию мукопротеидов. Но главное, с помощью элементов аппарата Гольджи происходит процесс выведения готовых секретов за пределы клетки. Кроме того, АГ является источником клеточных лизосом.
Участие АГ в процессах выведения секреторных продуктов было очень хорошо изучено на примере экзокринных клеток поджелудочной железы. Для этих клеток характерно наличие большого числа секреторных гранул (зимогеновых гранул), которые представляют собой мембранные пузырьки, заполненные белковым содержимым. В составе белков зимогеновых гранул входят разнообразные ферменты: протеазы, липазы, карбогидразы, нуклеазы. При секреции содержимое этих зимогеновых гранул выбрасывается из клеток в просвет железы, а затем перетекает в полость кишечника. Так как основным продуктом, выводимым клетками поджелудочной железы, является белок, то исследовали последовательность включения радиоактивных аминокислот в различные участки клетки (рис. 181). Для этого животным вводили меченную тритием аминокислоту (3Н-лейцин) и с помощью электронно-микроскопической радиоавтографии следили во времени за локализацией метки. Оказалось, что через короткий промежуток времени (3-5 мин) метка локализовалась только в базальных участках клеток, в участка, богатых гранулярным ЭР. Так как метка включалась в белковую цепь во время синтеза белка, то было ясно, что ни в зоне АГ, ни в самих зимогеновых гранулах синтез белка не происходит, а он синтезируется исключительно в эргастоплазме на рибосомах. Несколько позднее (через 20-40 мин) метка кроме эргастоплазмы была обнаружена в зоне вакуолей АГ. Следовательно, после синтеза в эргастоплазме белок был транспортирован в зону АГ. Еще позднее (через 60 мин) метка обнаруживалась уже и в зоне зимогеновых гранул. В дальнейшем метку можно было видеть в просвете ацинусов этой железы. Таким образом, стало ясно, что АГ является промежуточным звеном между собственно синтезом секретируемого белка и выведением его из клетки. Также подробно процессы синтеза и выведения белков были изучены на других клетках (молочная железа, бокаловидные клетки кишечника, щитовидная железа и др.), и были исследованы морфологические особенности этого процесса. Синтезированный на рибосомах экспортируемый белок отделяется и накапливается внутри цистерн ЭР, по которым он транспортируется к зоне мембран АГ. Здесь от гладких участков ЭР отщепляются мелкие вакуоли, содержащие синтезированный белок, которые поступают в зону вакуолей в проксимальной части диктиосомы. В этом месте вакуоли могут сливаться друг с другом и с плоскими цис-цистернами диктиосомы. Таким образом происходит перенесение белкового продукта уже внутри полостей цистерн АГ.
По мере модификации белков в цистернах аппарата Гольджи, они с помощью мелких вакуолей переносятся от цистерн к цистерне в дистальную часть диктиосомы, пока не достигают трубчатой мембранной сети в транс-участке диктиосомы. В этом участке происходит отщепление мелких пузырьков, содержащих уже зрелый продукт. Цитоплазматическая поверхность таких пузырьков бывает сходна с поверхностью окаймленных пузырьков, которые наблюдаются при рецепторном пиноцитозе. Отделившиеся мелкие пузырьки сливаются друг с другом, образуя секреторные вакуоли. После этого секреторные вакуоли начинают двигаться к поверхности клетки, соприкасаются с плазматической мембраной, с которой сливаются их мембраны, и, таким образом, содержимое этих вакуолей оказывается за пределами клетки. Морфологически этот процесс экструзии (выбрасывания) напоминает пиноцитоз, только с обратной последовательностью стадий. Он носит название экзоцитоз.
Такое описание событий является только общей схемой участия аппарата Гольджи в секреторных процессах. дело усложняется тем, что одна и та же клетка может участвовать в синтезе многих выделяемых белков, может их друг от друга изолировать и направлять к клеточной поверхности или же в состав лизосом. В аппарате Гольджи происходит не просто "перекачка" продуктов из одной полости в другую, но и постепенно идет их "созревание", модификация белков, которая заканчивается "сортировкой" продуктов, направляющихся или к лизосомам, или к плазматической мембране, или к секреторным вакуолям.

Модификация белков в аппарате Гольджи
В цис-зону аппарата Гольджи синтезированные в ЭР белки попадают после первичного гликозилирования и редукции там же нескольких сахаридных остатков. В конечном итоге все белки там имеют одинаковые олигосахаридные цепи, состоящие из двух молекул N-ацетилглюкозамина, шести молекул маннозы (рис. 182). В цис-цистернах начинается вторичная модификация олигосахаридных цепей и их сортировка на два класса. В результате олигосахариды на гидролитических ферментах, предназначенных для лизосом (богатые маннозой олгосахариды), фосфорилируются, а олигосахариды других белков, направляемых в секреторные гранулы, или к плазматической мембране, подвергаются сложным превращениям, теряя ряд сахаров и присоединяя галактозу, N-ацетилглюкозамин и сиаловые кислоты.
При этом возникает специальный комплекс олигосахаридов. Такие превращения олигосахаридов осуществляются с помощью ферментов - гликозилтрансфераз, входящих в состав мембран цистерн аппарата Гольджи. Так как каждая зона в диктиосомах имеет свой набор ферментов гликозилирования, то гликопротеиды как бы по эстафете переносятся из одного мембранного отсека ("этажа" в стопке цистерн диктиосомы) в другой и в каждом подвергаются специфическому воздействию ферментов. Так в цис-участке происходит фосфорилирование манноз в лизосомных ферментах и образуется особая маннозо-6-группировка, характерная для всех гидролитических ферментов, которые потом попадут в лизосомы.
В средней части диктиосом протекает вторичное гликозилирование секреторных белков: дополнительное удаление маннозы и присоединение N-ацетилглюкозамина. В транс-участке к олигосахаридной цепи присоединяются галактоза и сиаловые кислоты (рис. 183).
Эти данные были получены совершенно разными методами. С помощью дифференциального центрифугирования удалось получить раздельные более тяжелые (цис-) компоненты аппарата Гольджи и более легкие (транс-) и определить в них наличие гликозидаз и их продуктов. С другой стороны, используя моноклональные антитела к различным ферментам с помощью электронной микроскопии удалось их локализовать прямо на срезах клеток.
В ряде специализированных клеток в аппарате Гольджи происходит синтез собственно полисахаридов.
В аппарате Гольджи растительных клеток происходит синтез полисахаридов матрикса клеточной стенки (гемицеллюлозы, пектины). Кроме того, диктиосомы растительных клеток участвуют в синтезе и выделении слизей и муцинов, в состав которых входят также полисахариды. Синтез же основного каркасного полисахарида растительных клеточных стенок, целлюлозы, происходит как уже говорилось, на поверхности плазматической мембраны.
В аппарате Гольджи клеток животных происходит синтез длинных неразветвленных полисахаридных цепей глюкозаиногликанов. Один из них, гиалуроновая кислота, входящая в состав внеклеточного матрикса соединительной ткани, содержит несколько тысяч повторяющихся дисахаридных блоков. Многие глюкозаиногликаны ковалентно связаны с белками и образуют протеогликаны (мукопротеины). Такие полисахаридные цепи модифицируются в аппарате Гольджи и связываются с белками, которые в виде протеогликанов секретируются клетками. В аппарате Гольджи происходит также сульфатирование глюкозаиногликанов и некоторых белков.
Сортировка белков в аппарате Гольджи
Итак, через аппарат Гольджи проходит по крайней мере, три потока синтезированных клеткой нецитозольных белков: поток гидролитических ферментов в компартмент лизосом, поток выделяемых белков, которые накапливаются в секреторных вакуолях, и выделяются из клетки только по получении специальных сигналов, поток постоянно выделяемых секреторных белков. Следовательно, должен быть какой-то специальный механизм пространственного разделения этих разных белков и их путей следования.
В цис- и средних зонах диктиосом все эти белки идут вместе без разделения, они только раздельно модифицируются в зависимости от их олигосахаридных маркеров.
Собственно разделение белков, их сортировка, происходит в транс-участке аппарата Гольджи. Этот процесс не до конца расшифрован, но на примере сортировки лизосомных ферментов можно понять принцип отбора определенных белковых молекул (рис. 184).
Известно, что только белки-предшественники лизосомных гидролаз имеют специфическую олигосахаридную, а именно маннозную группу. В цис-цистернах эти группировки фосфорилируются и дальше вместе с другими белками переносятся от цистерны к цистерне, через среднюю зону в транс-участок. Мембраны транс-сети аппарата Гольджи содержат трансмембранный белок - рецептор (манноза-6-фосфатный рецептор или М-6-Ф-рецептор), который узнает фосфорилированные маннозные группировки олигосахаридной цепи лизосомных ферментов и связывается с ними. Это связывание происходит при нейтральных значениях рН внутри цистерн транс-сети. На мембранах эти М-6-Ф-рецепторные белки образуют кластеры, группы, которые концентрируются в зонах образования мелких пузырьков, покрытых клатрином. В транс-сети аппарата Гольджи происходит их отделение, отпочковывание и дальнейший перенос к эндосомам. Следовательно М-6-Ф-рецепторы, являясь трансмембранными белками, связываясь с лизосомными гидролазами, отделяют их, отсортировывают, от других белков (например, секреторных, нелизосомных) и концентрируют их в окаймленных пузырьках. Оторвавшись от транс-сети эти пузырьки быстро теряют шубу, сливаются с эндосомами, перенося свои лизосомные ферменты, связанные с мембранными рецепторами, в эту вакуоль. Как уже говорилось, внутри эндосом из-за активности протонного переносчика происходит закисление среды. Начиная с рН 6 лизосомные ферменты диссоциируют от М-6-Ф-рецепторов, активируются и начинают работать в полости эндолизосомы. Участки же мембран вместе с М-6-Ф-рецепторами возвращаются путем рециклизации мембранных пузырьков обратно в транс-сеть аппарата Гольджи.
Вероятнее всего, что та часть белков, которая накапливается в секреторных вакуолях и выводится из клетки после поступления сигнала (например нервного или гормонального) проходит такую же процедуру отбора, сортировки на рецепторах транс-цистерн аппарата Гольджи. Эти секреторные белки попадают сначала в мелкие вакуоли тоже одетые клатрином, которые затем сливаются друг с другом. В секреторных вакуолях часто происходит агрегация накопленных белков в виде плотных секреторных гранул. Это приводит к повышению концентрации белка в этих вакуолях примерно в 200 раз, по сравнению с его концентрацией в аппарате Гольджи. Затем эти белки по мере накопления в секреторных вакуолях выбрасываются из клетки путем экзоцитоза, поле получения клеткой соответствующего сигнала.
От аппарата Гольджи исходит и третий поток вакуолей, связанный с постоянной, конститутивной секрецией. Так фибробласты выделяют большое количество гликопротеидов и муцинов, входящих в основное вещество соединительной ткани. Многие клетки постоянно выделяют белки, способствующие связыванию их с субстратами, постоянно идет поток мембранных пузырьков к поверхности клетки, несущие элементы гликокаликса и мембранных гликопротеидов. Этот поток выделяемых клеткой компонентов не подлежит сортировке в рецепторной транс-системе аппарата Гольджи. Первичные вакуоли этого потока также отщепляются от мембран и относятся по своей структуре к окаймленным вакуолям, содержащим клатрин (рис. 185).
Заканчивая рассмотрение строения и работы такой сложной мембранной органеллы, как аппарат Гольджи, необходимо подчеркнуть, что несмотря на кажущуюся морфологическую однородность его компонентов, вакуоли и цистерны, на самом деле, это не просто скопище пузырьков, а стройная, динамичная сложно организованная, поляризованная система.
В АГ происходит не только транспорт везикул от ЕР к плазматической мембране. Существует ретроградный перенос везикул. Так от вторичных лизосом отщепляются вакуоли и возвращаются вместе с рецепторными белками в транс-АГ зону. Кроме того существует поток вакуолей от транс-зоны к цис-зоне АГ, а так же от цис-зоны к эндоплазматическому ретикулуму. В этих случаях вакуоли одеты белками COP I-комплекса. Считается, что таким путем возвращаются различные ферменты вторичного гликозилирования и рецепторные белки в составе мембран.
Эти особенности поведения транспортных везикул дали основу гипотезе о существовании двух типов транспорта компонентов АГ (рис. 186).
По одному из них, наиболее старому, в АГ существуют стабильные мембранные компоненты, к которым от ЭР эстафетно переносятся вещества с помощью транспортных вакуолей. По альтернативной модели АГ является динамическим производным ЭР: отщепившиеся от ЭР мембранные вакуоли сливаются друг с другом в новую цис-цистерну, которая затем продвигается через всю зону АГ и в конце распадается на транспортные везикулы. По этой модели ретроградные COP I везикулы возвращают постоянные белки АГ в более молодые цистерны. Таким образом предполагается, что переходная зона ЭР представляет собой "родильный дом" для аппарата Гольджи.
Глава 16. Лизосомы
О лизосомах уже упоминалось в разделах, посвященных эндоцитозу и аппарату Гольджи.
Наличие лизосом разного типа в клетках отражает процесс переноса гидролитических ферментов, необходимых для внутриклеточного расщепления экзогенных (энзоцитоз) или эндогенных (аутофагоцитоз) полимеров, процесс секреции, но как бы направленный "внутрь" клетки.
Сходство лизосомных вакуолей с секреторными находит свое отражение не только в общности их происхождения, но иногда и в общности конечного этапа их активности. В некоторых случаях лизосомы могут подходить к плазматической мембране и выбрасывать свое содержимое в наружную среду. Так, у клеток гриба нейроспоры лизосомы, выбрасывая гидролазы из клетки, обеспечивают внеклеточный протеолиз. Возможно, что часть лизосом макрофагов таким же образом обеспечивает внеклеточный гидролиз при воспалительных и резорбционных процессах. При оплодотворении акросома спермия, вакуоль, аналогичная лизосоме и содержащая гидролитические ферменты гиалуронидазу и протеазы, сливается с плазматической мембраной спермия, изливается на поверхность яйцеклетки. Освободившиеся из вакуоли ферменты расщепляют полисахаридные и белковые оболочки ооцита, давая возможность слиться двум половым клеткам.
Лизосомы не представляют собой в клетках самостоятельных структур, они образуются за счет активности эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи и в этом отношении напоминают секреторные вакуоли и что основная их роль заключается в участии в процессах внутриклеточного расщепления как экзогенных, так и эндогенных биологических макромолекул.

Общая характеристика лизосом
Лизосомы как мембранные внутриклеточные частицы были открыты биохимиками (Де Дюв, 1955). При изучении легкой подфракции макросом из гомогенатов печени крысы было найдено, что эта подфракция (в отличие от основной фракции макросом - митохондриальной фракции) обладает группой кислых гидролитических ферментов (гидролаз), расщепляющих белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды. Создалось впечатление, что эти ферменты содержатся в особого рода цитоплазматических частицах, лизосомах. Оказалось, что ферменты изолированных лизосом проявляют свою активность только в том случае, если предварительно вызывается повреждение самих лизосом, либо воздействием осмотического шока или детергентов, либо замораживанием и оттаиванием препаратов. На основании этого было сделано заключение, что лизосомы окружены липопротеидной мембраной, которая препятствует доступу находящихся снаружи субстратов к ферментам, находящимся внутри лизосом.
Характерной чертой лизосом является то, что они содержат около 40 гидролитических ферментов: протеиназы, нуклеазы, гликозидазы, фосфорилазы, фосфатазы, сульфитазы, оптимум действия которых осуществляется при рН 5. В лизосомах кислое значение среды создается из-за наличия в их мембранах H+ помпы, зависимой от АТФ. Кроме того, в мембране лизосом встроены белки-переносчики для транспорта из лизосом в гиалоплазму продуктов гидролиза: мономеры расщепленных молекул - аминокислоты, сахара, нуклеотиды, липиды. При ознакомлении с работой лизосом, всегда возникает вопрос, почему же эти мембранные образования не переваривают сами себя? Вероятнее всего, что мембранные элементы лизосом защищены от действия кислых гидролаз олигосахаридными участками, которые или не узнаются лизосомными ферментами, либо просто мешают гидролазам взаимодействовать с ними. Так или иначе мембранные компоненты лизосом очень устойчивы к гидролазам, содержащимся внутри лизосомных пузырьков.
Наличие некоторых гидролаз можно выявить гистохимическими методами. Так одной из характерных гидролаз, выявляемых как в световом так и в электронном микроскопе, является кислая фосфатаза, по наличию которой можно четко определить, является тот или иной мембранный пузырек лизосомой.
Под электронным микроскопом видно, что фракция лизосом состоит из очень пестрого класса пузырьков размером 0,2-0,4 мкм (для клеток печени), ограниченных одиночной мембраной (толщина ее около 7 нм), с очень разнородным содержанием внутри (рис. 187, 188). Во фракции лизосом встречаются пузырьки с гомогенным, бесструктурным содержимым, встречаются пузырьки, заполненные плотным веществом, содержащим в свою очередь вакуоли, скопления мембран и плотных однородных частиц; часто можно видеть внутри лизосом не только участки мембран, но и фрагменты митохондрий и ЭР. Иными словами, эта фракция по морфологии оказалась крайне неоднородной, несмотря на постоянство присутствия гидролаз.
Сходные по морфологии частицы были описаны еще ранее в разных тканях многих животных. Однако цитологи не могли выяснить функциональные значения этих полиморфных частиц. И только сочетание биохимических, цитохимических и электронно-микроскопических методов исследований позволило достаточно подробно разобраться в строении, происхождении и функционировании клеточных лизосом.
Морфологическая гетерогенность лизосом
Было обнаружено, что среди различных по морфологии лизосомных частиц можно выделить по крайней мере четыре типа: первичные лизосомы, вторичные лизосомы, аутофагосомы и остаточные тельца (рис. 189). Пестрота же морфологии лизосом вызвана тем, что эти частицы участвуют в процессах внутриклеточного переваривания, образуют сложные пищеварительные вакуоли как экзогенного (внеклеточного), так и эндогенного происхождения.
Первичные лизосомы представляют собой мелкие мембранные пузырьки размером около 100 нм, заполненные бесструктурным веществом, содержащим набор гидролаз и в том числе кислую фосфатазу, - маркерный для лизосом фермент. Эти мелкие вакуоли, первичные лизосомы, практически очень трудно отличить от мелких вакуолей на периферии зоны аппарата Гольджи. Часть из них несет клатриновую оболочку. Более того, вакуоли этой периферической части АГ также содержат кислую фосфатазу. Прослеживая процесс синтеза и локализацию этого фермента в клетках, было найдено, что местом его синтеза, как и следовало ожидать, является гранулярный ретикулум, затем этот фермент появляется в проксимальных участках диктиосом, а потом - в мелких вакуолях по периферии диктиосомы и, наконец, выявляется в первичных лизосомах. Весь путь образования первичных лизосом очень сходен с образованием зимогеновых гранул в клетках поджелудочной железы, за исключением последнего этапа - выбрасывания из клетки.
С помощью ряда точных экспериментов установили, что в дальнейшем первичные лизосомы сливаются с фагоцитарными или пиноцитозными вакуолями, эндосомами, образуя вторичную лизосому или внутриклеточную пищеварительную вакуоль. При этом содержимое первичной лизосомы сливается с полостью эндоцитозной вакуоли, и гидролазы первичной лизосомы получают доступ к субстратам, которые они и начинают расщеплять.
При слиянии первичной лизосомы с эндоцитозной вакуолью происходит диссоциация комплексов М-6-Ф-рецептор-гидролаза, из-за кислой среды внутри вторичной лизосомы. Затем уже свободный фермент после потери фосфатной группы активируется и вступает в работу. Освободившиеся мембранные рецепторы переходят в мелкие пузырьки, отщепляющиеся от вторичной лизосомы, и уходят снова в транс-участок аппарата Гольджи, т.е. происходит их рециклизация (см. рис. 184).
Процесс слияния первичных лизосом с эндоцитозными вакуолями прослежен очень подробно. Так, если ввести в организм мыши чужеродный белок пероксидазу, то она начинает накапливаться в эндоцитозных вакуолях. С помощью гистохимической реакции можно выявить пероксидазу в таких вакуолях в электронном микроскопе. Было замечено, что к этим вакуолям подходят первичные лизосомы, обладающие кислой фосфатазой, продукты активности которой также выявляются гистохимически. Затем происходит слияние мембран вакуолей, и в слившемся объеме новой вакуоли обнаруживается как пероксидазная, так и фосфатазная активность. По своей морфологии такая вакуоль представляет собой лизосому, содержащую компоненты, захваченные в процессе эндоцитоза. Это вторичная лизосома. Разнообразие по величине и по структуре клеточных лизосом связано в первую очередь с разнообразием вторичны лизосом - продуктов слияния эндоцитозных вакуолей с первичными лизосомами. Таким образом, вторичные лизосомы представляют собой не что иное, как внутриклеточные пищеварительные вакуоли, ферменты которых доставлены с помощью мелких первичных лизосом. Поэтому от типа поглощенных веществ или частичек зависит размер и внутренняя структура таких лизосом.
Лизосомы могут сливаться друг с другом и таким путем увеличиваться в объеме, при этом усложняется их внутренняя структура. Так, давая клеткам культуры ткани в среду коллоидное железо, можно видеть, как частички его (хорошо выявляемые в электронном микроскопе) сначала появляются в фагоцитозных вакуолях, а затем обнаруживаются во вторичных лизосомах. Если через некоторое время снова клетке дать инородное вещество, например коллоидное золото (частички которого отличаются по морфологии от частиц коллоидного железа), то динамика его появления в лизосомах будет такая же. Но появятся лизосомы, одновременно содержащие гранулы как коллоидного железа, так и коллоидного золота.
Судьба поглощенных биогенных веществ, попавших в состав лизосомы, заключается в их расщеплении гидролазами до мономеров и в транспорте этих мономеров через мембрану лизосомы в состав гиалоплазмы, где они реутилизируются, включаются в различные синтетические и обменные процессы.
Кроме участия в переваривании поглощенных частиц и растворов лизосомы могут играть роль внутриклеточных структур, участвующих в изменении клеточных продуктов. Так, в клетках щитовидной железы в ЭР синтезируется тироглобулин, белок-предшественник тироидного гормона. Тироглобулин с помощью АГ выводится из клеток в полость фолликулов щитовидной железы. При гормональной стимуляции иодированный тироглобулин снова попадает в железистую клетку путем пиноцитоза. Пиноцитозные вакуоли, содержащие тироглобулин, сливаются с первичными лизосомами, ферменты которых вызывают частичный гидролиз тироглобулина, приводящий к образованию тироксина - тироидного гормона, который затем выводится из клетки, секретируется, и попадает в кровеносное русло.
Однако расщепление, переваривание биогенных макромолекул внутри лизосом может идти в ряде клеток не до конца. В этом случае в полостях лизосом происходит накопление непереваренных продуктов, происходит переход вторичных лизосом в телолизосомы, или остаточные тельца. Остаточные тельца уже содержат меньше гидролитических ферментов, в них происходит уплотнение содержимого, его перестройка. Часто в остаточных тельцах наблюдается вторичная структуризация непереваренных липидов, которые образуют сложные слоистые структуры. Там же происходит отложение пигментных веществ. У человека при старении организма в клетках мозга, печени и в мышечных волокнах в телолизосомах происходит отложение "пигменте старения" - липофусцина.
Аутолизосомы (аутофагосомы) постоянно встречаются в клетках простейших, растений и животных. По своей морфологии их относят к вторичным лизосомам, но с тем отличием, что в составе этих вакуолей встречаются фрагменты или даже целые цитоплазматические структуры, такие, как митохондрии, пластиды, элементы ЭР, рибосомы, гранулы гликогена и т.д. Процесс образования аутофагосом еще недостаточно ясен. По одним представлениям, первичные лизосомы могут выстраиваться вокруг клеточной органеллы, сливаться друг с другом и таким образом отделять ее от соседних участков цитоплазмы: участок оказывается отделенным мембраной и заключенным внутри такой сложной лизосомы (см. рис. 189).
Есть предположение, что процесс аутофагоцитоза связан с отбором и уничтожением измененных, "сломанных" клеточных компонентов. В этом случае лизосомы выполняют роль внутриклеточных чистильщиков, контролирующих дефектные структуры. Такой автофагии подвергаются митохондрии печени, где время жизни отдельной митохондрии составляет 10 дней. Интересно, что в нормальных условиях число аутофагосом увеличивается при метаболических стрессах ( например, при гормональной индукции активности клеток печени). Значительно возрастает число аутофагосом при различных повреждениях клеток; в этом случае автофагоцитозу могут подвергаться целые зоны внутри клеток.
Лизосомные патологии
Увеличение числа лизосом в клетках при патологических процессах - обычное явление. Это наблюдение послужило появлению представления о том, что лизосомы могут играть активную роль при гибели клеток. Однако в большинстве случаев смерти клетки не предшествовало освобождение гидролаз из лизосом. Более того, даже при разрыве мембраны лизосомные гидролазы должны терять свою активность, попадая в цитоплазму с нейтральным значением рН. Ферменты лизосом, несомненно, участвуют в автолизе погибших клеток, но скорее всего это вторичное явление, а не причина гибели самих клеток.
Существует ряд врожденных заболеваний, которые называют лизосомными "болезнями накопления". Отличительным признаком этих болезней является то, что под световым микроскопом в клетках наблюдается множество вакуолей. Например, при болезни Помпе происходит накопление гликогена в лизосомах, где он не расщепляется из-за отсутствия у таких больных фермента кислой ?-гликозидазы. Многие "болезни накопления" возникают вследствие первичной генной мутации, приводящей к потере активности отдельных ферментов, участвующих в функционировании лизосом.
Сейчас, к сожалению, известно уже более 25 таких генетических заболеваний, связанных с патологией лизосом.
Глава 17. Гладкий ретикулум и другие мембранные вакуоли
Гладкий ЭР представляет собой часть мембранной вакуолярной системы. В морфологическом отношении он также представлен мембранами, образующими мелкие вакуоли и трубки, канальцы, которые могут ветвиться, сливаться друг с другом. В отличие от гранулярного на мембранах гладкого ЭР нет рибосом (рис. 190). Диаметр вакуолей и канальцев гладкого ЭР обычно около 50-100 нм. Выраженность сети из этих мембранных элементов может быть неодинаковой как для различных клеток, так и внутри одной клетки. Большей частью такие гладкие канальцы образуют скопления, или зоны. Так, например, в клетках эпителия кишечника гладкий ЭР локализуется главным образом в апикальной, верхней части клетки, вблизи всасывающей поверхности. В клетках печени зоны гладкого ЭР часто связаны с местами отложения гликогена. Встречаются клетки, где гладкий ЭР занимает большую часть объема цитоплазмы (например, в интерстициальных клетках семенника, в растительных железистых терпеноидогенных клетках).
Неоднократно была установлена непрерывность перехода между гладкой формой ЭР и гранулярной его формой. Часто можно наблюдать, как цистерна гранулярного ЭР теряет на своей поверхности рибосомы и становится "гладкой" (рис. 191). При этом такой участок цистерны делается неровным, начинает как бы ветвиться, переходя в трубочки и канальцы гладкого ЭР. Этот участок часто называют переходным из-за того, что именно здесь образуются и отделяются транспортные пузырьки, переносящие новосинтезированные белки и липиды к зоне аппарата Гольджи. Гладкий ЭР является вторичным по отношению к гранулярному ЭР, происходит из последнего. Так, у крысенка перед рождением в печеночных клетках образуется большое количество гранулярного ЭР, но сразу после рождения появляется масса трубочек гладкого ЭР. Ряд биохимических, морфологических и авторадиографических данных приводит к заключению, что гранулярный ЭР увеличивается в объеме, растет за счет синтезирующихся мембран, которые остаются в его составе или, потеряв рибосомы, превращается в гладкий ЭР. Например, при использовании радиоактивных предшественников мембранных компонентов и при получении отдельных фракций гладкого и гранулярного ЭР было обнаружено, что при интенсивном разрастании гладкого ЭР метка вначале появляется в гранулярном ЭР и только спустя некоторое время - в гладком ЭР.
Несмотря на топографическую связь и общность происхождения, эти два представителя ЭР резко отличаются друг от друга в функциональном отношении. Как уже указывалось, отсутствие рибосом на гладком ЭР прямо говорит о его непричастности к синтезу белков. Деятельность гладкого ЭР скорее можно связать с метаболизмом липидов и некоторых внутриклеточных полисахаридов.
Участие гладкого ЭР в синтезе триглицеридов и липидов было показано при изучении процессов всасывания жиров клетками кишечного эпителия. В просвете кишечника жиры распадаются до жирных кислот и моноглицеридов. В апикальных участках клеток кишечника видно при этом накопление осмиофильных гранул внутри просветов канальцев гладкого ЭР. Это связано с ресинтезом новых триглицеридов из поступивших в клетку предшественников, с образованием липидов и липопротеидов, которые с помощью вакуолей аппарата Гольджи выводятся из клеток и попадают в лимфатическое русло.
Мелкие капли липидов иногда в комплексе с белками можно наблюдать и в клетках печени, причем эти капли встречаются в полостях гладкого ЭР около зоны аппарата Гольджи. Если крысам давать вещества, приводящие к образованию отложений больших капель жира (жировая дистрофия), то первые мелкие липидные капельки появляются в гладком ЭР, но иногда и в полостях гранулярного ЭР.
Гладкий ЭР особенно в большом объеме встречается в клетках, секретирующих стероиды, в таких, как клетки коркового вещества надпочечника. Основные ферменты синтеза стероидов были обнаружены во фракциях микросом, образовавшихся при разрушении гладкого ЭР из этих клеток. Гладким ретикулумом богаты интерстициальные клетки семенников, участвующие в синтезе стероидных гормонов, а также клетки сальных желез в самом начале накопления жира.
Тесная топографическая связь гладкого ЭР с отложениями гликогена (запасного внутриклеточного полисахарида животных и грибов) в гиалоплазме различных клеток показывает на значение этой связи с метаболизмом углеводов. В клетках печени, в мышечных волокнах гликоген откладывается в зонах, свободных от гранулярных цистерн ЭР, но богатых пузырьками и канальцами гладкого ЭР. Такие зоны гладкого ЭР могут увеличиваться в размере как при исчезновении гликогена (например, при голодании), так и при увеличении его отложений (рис. 192,193).
В печени часто увеличение зон гладкого ЭР связано с рядом патологических процессов в клетках. Так, при барбитуратных отравлениях, при действии различных канцерогенов или ядовитых веществ, при действии больших доз гормональных препаратов клетки печени теряют свою характерную для них базофилию цитоплазмы, в них падает содержание РНК и появляются в цитоплазме оксифильные зоны. В электронном микроскопе эти зоны представлены скоплениями гладкого ЭР, это явление связано с тем, что в этих местах происходят процессы деградации различных вредных веществ, процессы метаболической дезактивации, которые осуществляются целым рядом окислительных ферментов, из которых наиболее известен белок, называемый цитохром Р450. Этот белок участвует в присоединении гидроксильной группы к различным, потенциально опасным водонерастворимым углеводородам или к липофильным ядовитым веществам (например, четыреххлористый углерод), попадающим в мембранный бислой. Здесь же другие ферменты добавляют к этим гидроксильным группам отрицательно заряженные молекулы (сульфат, глюкуроновая кислота), что делает метаболиты или вредные липофильные вещества растворимыми в воде, из-за чего они могут выводиться из организма вместе с мочой. Разросшийся гладкий ЭР в клетках печени после удаления токсического вещества уничтожается, вероятно, с помощью лизосом - автофагосом.
В поперечнополосатых мышцах вакуоли и каналы гладкого ЭР (саркоплазматический ретикулум) окружают каждую миофибриллу (рис. 194). Здесь ЭР выполняет специальную функцию депонирования ионов кальция. В присутствии АТФ он может активно поглощать и накапливать ионы кальция, что приводит к расслаблении, мышечного волокна. Белки кальциевого насоса являются интегральными белками мембран саркоплазматического ретикулума.
Среди высших растений гладкий ретикулум встречается в клетках тканей, участвующих в синтезе и транспорте терпенов, стероидов, липидов.
Вакуоли растительных клеток.
Клетки как низших, так и высших растительных организмов содержат в цитоплазме вакуоли, несущие ряд важных физиологических нагрузок (рис. 195).
У молодых клеток может быть несколько мелких вакуолей, которые по мере роста и дифференцировки клетки сливаются друг с другом и образуют одну или несколько крупных вакуолей, занимающих до 90% объема всей клетки. Центральные вакуоли отделены от цитоплазмы одинарной мембраной, сходной по толщине с плазмалеммой. Мембрана, ограничивающая центральные вакуоли, носит название тонопласта. Возникают центральные вакуоли из мелких пузырьков, отщепившихся от аппарата Гольджи. Такие первичные вакуоли растут в объеме, сливаются друг с другом и в конце концов образуют одну или несколько крупных вакуолей, оттесняющих цитоплазму с ядром и органоидами к периферии клетки. Полость вакуоли заполнена так называемым клеточным соком, представляющим собой водный раствор, в который входят различные неорганические соли, сахара, органические кислоты и их соли и другие низкомолекулярные соединения, а также некоторые высокомолекулярные вещества (например, белки).
Центральные вакуоли растений выполняют многообразные и важные функции. Одной из главных ее функций является поддержание тургорного давления клеток. Растворенные в соке вакуолей молекулы определяют его осмотическую концентрацию. Соответствующая молекулярная концентрация сока вакуолей и полупроницаемые свойства как ее мембраны, тонопласта, так и плазмалеммы способствуют тому, что вакуоль функционирует в качестве осмометра и придает клетке необходимую прочность и тургисцентность (напряженность).
Другая функция определяется тем, что вакуоль представляет собой большую полость, отделенную от метаболирующей гиалоплазмы мембраной, тонопластом, обладающим свойствами полупроницаемости и через котрый может происходить, как и через плазматическую мембрану, активный транспорт различных молекул. В тонопласте обнаружен АТФ-зависимый Н+-насос, направленный внутрь вакуолей, участвующий в транспорте сахаров. Поэтому вакуоли могут использоваться клетками как накопительные резервуары не только для отложения запасных веществ, но и для выброса метаболитов, для экскреции. Так выводятся, секретируются из клетки все водорастворимые метаболиты. Нерастворимые в воде органические компоненты могут превращаться в растворимые глюкозиды, соединяясь с молекулами сахаров. Перечень экскретируемых в вакуоли метаболитов очень обширен. Это различные алкалоиды (например, никотин, кофеин) и полифенолы. В вакуолях происходит отложение многих глюкозидов, к которым относятся различные пигменты, например антоцианы.
Из неорганических веществ в вакуолярном соке накапливаются фосфаты калия, натрия, кальция, могут накапливаться соли органических кислот (оксалаты, цитраты и др.). Это придает вакуолярному соку отчетливую кислую реакцию (рН от 2 до 5).
Таким образом, можно считать, что тонопласт участвует в процессах экскреции.
Другой обширный ряд функций вакуолей связан с накоплением запасных веществ, таких, как сахара и белки. Сахара в вакуолях содержатся в виде растворов, встречаются и резервные полисахариды типа инулина. В вакуолях происходит запасание белков, что характерно для семян. Поступление белков в вакуоли, вероятнее всего, связано со способностью вакуолей ЭР и АГ сливаться с тонопластом. Запасание белков семян злаковых происходит в так называемых алейроновых вакуолях, которые заполняются альбуминами и глобулинами, после чего вакуоли обезвоживаются, превращаясь в твердые алейроновые зерна. При прорастании семян эти зерна обводняются и снова превращаются в вакуоли. В таких новообразованных вакуолях выявляется активность некоторых ферментов, кислой фосфатазы, ?-амилазы, глюкозидазы, протеиназы и РНКазы. Следовательно, алейроновые вакуоли отчасти напоминают лизосомы, где происходит переваривание запасных белков при прорастании семян.
Гидролитические ферменты были обнаружены не только в алейроновых вакуолях, но и в мелких и крупных центральных вакуолях. Наблюдалась неоднократно инвагинация, впячивание тонопласта внутрь вакуолей, при этом часть "втянутого" материала оказывается в полости вакуоли и там деградирует. Возможно, так выполняется аутофагическая функция вакуолей, участвующих в гидролизе дефектных клеточных компонентов. Лизосомными свойствами обладают вакуоли дрожжей. Было обнаружено, что стенки вакуолей дрожжей тоже могут образовывать впячивания внутрь, затем они отщепляются от тонопласта и растворяются внутри вакуоли.
Сферосомы
Это мембранные пузырьки, встречающиеся в клетках растений, они окрашиваются липофильными красителями, имеют высокий коэффициент преломления и поэтому хорошо видны в световой микроскоп. Сферосомы образуются из элементов эндоплазматического ретикулума. На конце цистерны ЭР начинает накапливаться осмиофильный материал, затем от этого участка отшнуровывается и начинает расти мелкий пузырек, достигающий диаметра 0,1-0,5 мкм. Это "просферосома", окруженная одинарной мембраной. Рост сферосом и перестройка их содержимого связаны с накоплением в них масла, так что сферосома постепенно превращается в масляную каплю. Отложение липидов начинается между осмиофильными слоями мембраны. Кроме жиров в составе сферосом обнаруживают белки и среди них фермент липазу, расщепляющую липиды.
Пероксисомы (микротельца)
Это небольшие вакуоли (0,3-1,5 мкм), одетые одинарной мембраной, отграничивающей гранулярный матрикс, в центре которого располагается сердцевина, или нуклеоид (ничего не имеющий общего с нуклеоидом бактерий и вобще к ядерным структурам не относящийся).
В зоне сердцевины часто, особенно в пероксисомах печеночных клеток, видны кристаллоподобные структуры, состоящие из регулярно упакованных фибрилл или трубочек. Изолированные сердцевины пероксисом содержат фермент уратоксидазу (рис. 196, 207б).
Пероксисомы обнаружены у простейших (амебы, тетрахимена), у низших грибов (дрожжи), у высших растений в некоторых эмбриональных тканях (эндосперм) и в зеленых частях, способных к фотореспирации, у высших позвоночных животных они обнаруживаются главным образом в печени и почках. В печени крыс на клетку число пероксисом колеблется от 70 до 100.
Пероксисомы часто локализуются вблизи мембран ЭР. У зеленых растений пероксисомы часто находятся в тесном контакте с митохондриями и пластидами.
Впервые пероксисомы были выделены из печени и почек. Во фракциях пероксисом обнаруживается ферменты, связанные с метаболизмом перекиси водорода. Это ферменты (оксидазы, уратоксидаза, оксидаза d-аминокислот) окислительного дезаминирования аминокислот, при работе которых образуется перекись водорода (Н2О2 ) и каталаза, разрушающая ее. В пероксисомах печени каталаза составляет до 40 % всех белков и локализована в матриксе. Так как Н2О2 является токсическим веществом для клеток, то каталаза пероксисом может играть важную защитную роль. Пероксисомы цыплят и лягушек кроме уратоксидазы содержат ряд ферментов катаболизма пуринов.
У животных и некоторых растений (проростки клещевины) пероксисомы играют важную роль при превращении жиров в углеводы. Так, в клетках эндосперма клевещины в пероксисомах (глиоксисомах) содержатся ферменты глиоксалатного цикла.
Пероксисомы не содержат никаких нуклеиновых кислот и все белки, из которых они состоят, кодируются ядерными генами, но их относят к саморепродуцирующимся органеллам. В пероксидах происходит накопление специфических белков, которые синтезируются в цитозоле, и имеют свои сигнальные участки. В мембране пероксисом есть рецепторный белок, который узнает транспортируемые белки. Белки мембран пероксисом, также как и липиды приходят из цитозоля. Такое накопление содержимого и рост мембраны приводят к общему росту пероксисомы, которая затем с помощью неизвестного пока механизма делится на две - самореплицируется.
Секреция белков и образование мембран у бактерий
В принципе рост плазматической мембраны и её производных у бактерий происходит тем же образом, что и образование мембран у эукариотических клеток.
Как известно, синтез белков у бактерий осуществляется на 70s рибосомах, которые также, как и у клеток высших организмов, имеют двоякую локализацию. Большая часть рибосом бактериальных клеток образует полисомы в цитоплазме, около 25% рибосом связано с плазматической мембраной. Такие рибосомы участвуют как в синтезе белков мембраны, так и в синтезе экскретируемых белков. Многие бактериальные клетки получают питательные вещества за счет деградации полимеров около бактериальной поверхности. Для этого бактерии должны выделять гидролизирующие ферменты в окружающую среду. Это они делают намного проще, чем эукариотические клетки: часть их рибосом, локализованных на внутренней (цитоплазматической) поверхности плазматической мембраны, синтезирует белки, которые, подобно секреторным белкам, проходят через мембрану и оказываются вне клетки. Выделенные гидролазы застревают в компонентах муреиновой бактериальной стенки и там функционируют. На других рибосомах, связанных с мембранами, идет синтез белков для построения самой мембраны, подобно тому, что происходит в гранулярном ЭР эукариотических клеток. Так что в этом отношении бактерию можно уподобить вакуоли гранулярного ЭР, вывернутой наизнанку.
На примере бактерий хорошо изучен путь синтеза липидных компонентов мембран. Так, было найдено, что синтез фосфоэтидилэтаноламина происходит с помощью ферментов, являющихся интегральными белками плазматической мембраны, активные участки которых находятся на цитоплазматической стороне мембраны. Синтезированные здесь липиды встраиваются во внутренний липидный слой. Оказалось, что новосинтезированные липиды довольно быстро обнаруживаются и во внешнем слое мембраны за счет работы переносчиков - флиппаз.
Часть V. Цитоплазма: системы энергообеспечения клеток
Для осуществления любых клеточных функций необходимы затраты энергии. Живые организмы получают её, или используя внешние источники, например за счет энергии Солнца, или же используя энергию переноса электронов при окислении различных субстратов. В обоих случаях клетками синтезируются молекулы АТФ (аденозинтрифосфат), некая разменная "топливная" единица, обладающая высокоэнергетическими фосфатными связями, при разрушении которых выделяемая энергия может тратиться на любые клеточные функции: на активный транспорт веществ, на синтетические процессы, на механическую работу и т.д. (рис. 197). В клетках животных синтез АТФ осуществляется специальными органеллами, митохондриями, в растительных клетках кроме митохондрий в энергообеспечении огромную роль играют хлоропласты, один из видов пластид. Эти два органоида имеют общий сходный план строения, и выполняют сходные энергетические функции. Митохондрии и пластиды - двумембранные органоиды эукариотических клеток.
Общим в их строении является то, что они отделены от цитоплазмы (гиалоплазмы) двумя мембранами - внешней и внутренней. Поэтому у митохондрий и пластид различают две полости или пространства: одну между внешней и внутренней мембранами (межмебранные) и другую, основную (матрикс), ограниченную внутренней мембраной. Другой общей чертой в их строении является то, что внутренняя мембрана образует складки, мешки, гребни, глубокие впячивания, направленные внутрь матрикса. На таких мембранных гребнях и впячиваниях локализуются активные метаболические центры этих органелл - полиферментные комплексы, определяющие выполнение основных физиологических функций (окислительное фосфорилирование для митохондрий, фотофосфорилирование для хлоропластов). В матриксе и тех, и других располагаются элементы авторепродукции этих клеточных мембранных органелл и локализованы ферменты некоторых метаболических процессов. Система авторепродукции двумембранных органелл представлена ДНК, РНК и рибосомами, которые могут определять часть генетических, автономных свойств этих структур.
Главными функциональными нагрузками пластид и митохондрий являются процессы энергетического характера, приводящие к синтезу специфических молекул аденозинтрифосфата (АТФ), являющихся донорами энергии для любых клеточных процессов.
В митохондриях, хлоропластах, так же как в бактериях, АТФ синтезируется одним и тем же способом: с помощью энергии, отдаваемой электронами при продвижении их по электроннотранспортной цепи белков внутренний мембраны, происходит перенос, "перекачка" протонов с внутренней стороны мембраны на внешнюю. Вследствие этого возникает электрохимический протонный градиент, энергия которого с помощью других белков используется для синтеза АТФ.
В хлоропластах растений, кроме того, при использовании энергии АТФ, образованной в результате фосфорилирования, происходит важнейший биологический процесс - связывание СО2 и синтез углеводов.
Глава 18. Митохондрии - строение и функции
Митохондрии как органеллы синтеза АТФ характерны, за малым исключением, для всех эукариотических клеток как аутотрофных (фотосинтезирующие растения), так и гетеротрофных (животные, грибы) организмов. Их основная функция связана с окислением органических соединений и использовании освобождающейся при распаде этих соединений энергии в синтезе молекул АТФ. Поэтому митохондрии часто называют энергетическими станциями клетки.
Общая морфология
Митохондрии или хондриосомы (от греч. mitos- нить, chondrion- зернышко, soma- тельце) представляют собой гранулярные или нитевидные органеллы, присутствующие в цитоплазме простейших, растений и животных (рис. 198). Митохондрии можно наблюдать в живых клетках, так как они обладают достаточно высокой плотностью. В живых клетках митохондрии могут двигаться, перемещаться, сливаться друг с другом. Особенно хорошо митохондрии выявляются на препаратах, окрашенных различными способами после осмиевой фиксации, которая хорошо стабилизирует липиды. Наиболее широко распространен метод окраски по Альтману, который описал эти клеточные органеллы в конце позапрошлого века, называя их "биобластами".
Размеры митохондрий очень непостоянны у разных видов, так же как изменчива их форма (рис. 199). Все же у большинства клеток толщина этих структур относительно постоянна (около 0,5 мкм), а длина колеблется, достигая у нитчатых форм до 7-60 мкм. Надо сказать, что изучение величины митохондрий - не простое дело. В световом микроскопе на окрашенных препаратах не всегда можно проследить за реальными размерами митохондрий (рис. 200, 201а). Изучая митохондрии в электронном микроскопе на ультратонких срезах, трудно решить вопрос об истинной длине митохондрий, так как на срез попадает только незначительный объем данной митохондрии. Более того, на срезе одна извитая митохондрия может быть представлена несколькими сечениями (3-5), и только пространственная трехмерная реконструкция, построенная на изучении серийных срезов, может решить вопрос, имеем ли мы дело с 3-6 отдельными митохондриями или же с одной изогнутой или разветвленной. Выделенные митохондрии обычно повреждаются и фрагментируются, что также ограничивает использование этого метода для решения вопроса о величине и числе митохондрий.
В последнее время вопрос о величине и числе митохондрий занимает многих исследователей в связи с тем, что на ряде объектов показано, что размеры и число митохондрий, которые видны на ультратонких срезах, не соответствуют реальности. Так, в клетках дрожжей на срезах выявляется 5-7 сечений митохондрий; можно высчитать, что это число соответствует нескольким десяткам митохондрий. Однако при использовании высоковольтной электронной микроскопии, позволяющей исследовать объекты толщиной до нескольких микрон, было обнаружено, что в клетках дрожжей есть всего лишь несколько (1-3) сильно разветвленных митохондрий (рис. 202). Есть данные, что число митохондрий и для других клеток нужно считать завышенным из-за сложности структуры разветвленных митохондрий. Более того, появились представления о том, что в одноклеточных организмах есть всего одна митохондрия, но сильно разветвленная. Так, у трипанозм в клетке присутствует одна гигантская митохондрия, имеющая сложную разветвленную форму.
Гигиантские одиночные митохондрии были описаны для одноклеточных зеленых водорослей (Polytomella, Engiena, Chlorella) (рис. 203). Длинные ветвящиеся митохондрии были описаны в клетках культуры ткани млекопитающих, в клетках многих растений как в нормальных, так и в анаэробных условиях. В последнее время стал широко применяться для изучения свойств митохондрий флуорохром родамин. Этот краситель обладает способностью люминисцировать в фиолетовом свете, если он связывается с мембранами активных митохондрий. При этом в люминисцентном микроскопе видна единая митохондриальнвя система - митохондриальный ретикулум (рис. 200, 201а).
Обычные же подсчеты показывают, что на печеночную клетку приходится около 200 митохондрий. Это составляет более 20% от общего объема цитоплазмы и около 30-35% от общего количества белка в клетке. Площадь поверхности всех митохондрий печеночной клетки в 4-5 раз больше поверхности ее плазматической мембраны. Больше всего митохондрий в ооцитах (около 300000) и у гигантской амебы Chaos chaos (до 500000).
В клетках зеленых растений число митохондрий меньше, чем в клетках животных, так как часть их функций могут выполнять хлоропласты.
В спермиях часто присутствуют гигантские митохондрии, спирально закрученные вокруг осевой части жгутика. Отсутствуют митохондрии у кишечных энтамеб, живущих в условиях анаэробиоза, и у некоторых других паразитических простейших.
Локализация митохондрии в клетках может быть различной. Часто их расположение обусловлено топографией цитоплазматических структур и включений. Так, в дифференцированных клетках растений митохондрии большей частью расположены в периферических участках цитоплазмы, отодвинутых к плазматической мембране центральной вакуолью. В мало дифференцированных клетках меристемы растений митохондрии располагаются более или менее равномерно. В клетках эпителия почечных канальцев митохондрии ориентированы вдоль продольной оси клетки. Это связано с тем, что они располагаются между глубокими впячиваниями плазматической мембраны в базальной области клеток (рис. 204).
Обычно митохондрии скапливаются вблизи тех участков цитоплазмы, где возникает потребность в АТФ, образующейся в митохондриях. Так, в скелетных мышцах митохондрии находятся вблизи миофибрилл. В сперматозоидах митохондрии образуют спиральный футляр вокруг оси жгутика; вероятно, это связано с необходимостью использования АТФ для движения хвоста сперматозоида. Аналогичным образом у простейших и в других клетках, снабженных ресничками, митохондрии локализуются непосредственно под клеточной мембраной у основания ресничек, для работы которых необходим АТФ. В аксонах нервных клеток митохондрии располагаются около синапсов, где происходит процесс передачи нервного импульса. В секреторных клетках, которые синтезируют большие количества белков, митохондрии тесно связаны с зонами эргастоплазмы; вероятно, они поставляют АТФ для активации аминокислот и синтеза белка на рибосомах.
Ультраструктура митохондрий.
Митохондрии независимо от их величины или формы имеют универсальное строение, их ультраструктура однообразна. Митохондрии ограничены двумя мембранами (рис. 205). Наружняя митохондриальная мембрана отделяет ее от гиалоплазмы. Обычно она имеет ровные контуры, не образует впячиваний или складок. На нее приходится около 7% от площади всех клеточных мембран. Ее толщина около 7 нм, она не бывает связана ни с какими другими мембранами цитоплазмы и замкнута сама на себя, так что представляет собой мембранный мешок. Наружнюю мембрану от внутренней отделяет межмембранное пространство шириной около 10-20 нм. Внутренняя мембрана (толщиной около 7 нм) ограничивает собственно внутреннее содержимое митохондрии, ее матрикс или митоплазму. Характерной чертой внутренней мембраны митохондрий является их способность образовывать многочисленные впячивания внутрь митохондрий. Такие впячивания чаще всего имеют вид плоских гребней, или крист (рис. 206, 207а).
Общая поверхность внутренней мембраны митохондрии в печеночной клетке составляет примерно треть поверхности всех клеточных мембран. Митохондрии клеток сердечной мышцы содержат втрое больше крист, чем печеночные митохондрии. Это может отражать различия в функциональных нагрузках митохондрий разных клеток. Расстояние между мембранами в кристе составляет около 10-20 нм. На срезах связь мембраны крист с внутренней мембраной прослеживается очень отчетливо, но мест таких мембранных переходов немного. Это объясняется тем, что связь между мембранами осуществляется через узкую шейку или стебелек.
Митохондриальные кристы, отходящие от внутренней мембраны и простирающиеся в сторону матрикса, обычно не полностью перегораживают полость митохондрии, не нарушают непрерывности заполняющего ее матрикса.
Ориентация крист по отношению к длинной оси митохондрии различна для разных клеток. Так, может быть перпендикулярная ориентация (клетки печени, почек) крист; в некоторых клетках (сердечная мышца) наблюдается продольное расположение крист. Часто кристы могут ветвиться или образовывать пальцевидные отростки, изгибаться и не иметь выраженной ориентации (рис. 208). У простейших, одноклеточных водорослей, в некоторых клетках высших растений и животных выросты внутренней мембраны имеют вид трубок (трубчатые кристы).
Матрикс митохондрий имеет тонкозернистое гомогенное строение, в нем иногда выявляются тонкие собранные в клубок нити (около 2-3 нм) и гранулы около 15-20нм. Теперь стало известно, что нити матрикса митохондрий представляют собой молекулы ДНК в составе митохондриального нуклеоида, а мелкие гранулы - митохондриальные рибосомы. Кроме того, в матриксе встречаются крупные (20-40 нм) плотные гранулы, это - места отложения солей магния и кальция.
Функции митохондрий
Митохондрии осуществляют синтез АТФ, происходящий в результате процессов окисления органических субстратов и фосфорилирования АДФ. В клетках процессы окисления и выделения энергии, освобождающиеся в результате этого процесса, проходят в несколько взаимосвязанных этапов. При этом в качестве начальных субстратов используются различные углеводы, жирные кислоты, аминокислоты (рис.). Первые этапы окисления приводят кроме образования АТФ к появлению промежуточных продуктов, конечное окисление которых в митохондриях дает возможность клетке использовать этот процесс для синтеза основного количества АТФ.
Начальные этапы окисления углеводов происходят в гиалоплазме и не требуют участия кислорода. Поэтому они называются анаэробным окислением, или гликолизом. Главным субстратом окисления при анаэробном получении энергии служат гексозы и в первую очередь глюкоза; некоторые бактерии обладают свойством извлекать энергию, окисляяя пентозы, жирные кислоты или аминокислоты. В глюкозе количество потенциальной энергии, заключенной в связях между атомами С, Н и О, составляет около 680 ккал на 1 моль (т.е. на 180 г глюкозы); эта энергия освобождается при полном окислении глюкозы согласно следующей реакции:
С6Н12О6 + 6О2==> 6Н2О + 6СО2 + 680 ккал
В живой клетке это огромное количество энергии не освобождается одновременно, как при горении в пламени. Освобождение энергии идет в виде ступенчатого процесса, управляемого целым рядом окислительных ферментов, и не связано с переходом энергии химической связи в тепло, как при горении, а с переходом ее в макроэнергетическую связь в молекуле АТФ, которая синтезируется при использовании освобождающейся энергии из АДФ и фосфата.
В процессе гликолиза происходит неполное окисление субстрата. В результате гликолиза глюкоза распадается до триоз, при этом тратятся 2 молекулы АТФ и синтезируются 4 молекулы АТФ. Так что в конечном результате клетка "зарабатывает" всего 2 молекулы АТФ. В энергетическом отношении этот процесс малоэффективен, поэтому из 680 ккал, заключающихся в связях 1 моля глюкозы, освобождается менее 10% энергии. Несмотря на низкий энергетический выход, анаэробное окисление, гликолиз, широко используется в живой природе. Он является основным поставляющим энергию процессом для многих микроорганизмов, некоторых кишечных паразитических анаэробных простейших, для клеток высших организмов на ранних стадиях эмбрионального развития, для многих опухолевых клеток, для клеток культуры ткани и др. Эритроциты млекопитающих, например, получают всю необходимую им энергию за счет гликолиза, так как у них нет митохондрий.
Образовавшиеся в результате гликолиза триозы, и в первую очередь пировиноградная кислота, вовлекаются в дальнейшее окисление, происходящее уже в самих митохондриях. При этом происходит использование энергии расщепления всех химических связей, что приводит к выделению СО2, к потреблению кислорода и синтезу большого количества АТФ. Эти процессы связаны с окислительным циклом трикарбоновых кислот и с дыхательной цепью переноса электронов, где происходит фосфорилирование АДФ и синтез клеточного "топлива", молекул АТФ (рис. 209).
В цикле трикарбоновых кислот (цикл Кребса, или цикл лимонной кислоты) образовавшийся в результате гликолиза пируват сначала теряет молекулу СО2 и, окисляясь до ацетата (двууглеродное соединение), соединяется с коферментом А. Затем ацетилкоэнзим А, соединяясь с оксалацетатом (четырехуглеродное соединение), образует шестиуглеродный цитрат (лимоную кислоту). Затем происходит цикл окисления этого шестиуглеродного соединения до четырехуглеродного оксалацетата, снова связывание с ацетилкоэнзимом А, и затем цикл повторяется. При этом окислении выделяются две молекулы СО2, а электроны, освободившиеся при окислении, переносятся на акцепторные молекулы коферментов (NAD-никотинамидадениндинуклеотид), которые вовлекают их далее в цепь переноса электронов. Следовательно, в цикле трикарбоновых кислот нет самого синтеза АТФ, а идет окисление молекул, перенос электронов на акцепторы и выделение СО2. Все описанные выше события внутри митохондрий происходят в их матриксе.
Выделенные митохондрии обладают способностью осуществлять окисление пирувата до СО2 и способны к синтезу АТФ. Если взвесь митохондрий подвергнуть воздействию ультразвука, то после разрыва митохондриальных мембран компоненты матрикса освобождаются и переходят в среду выделения. После такого разрушения можно осадить мембраны митохондрий и анализировать их функциональные активности.
Было обнаружено, что во фракции, свободной от мембран, представляющей собой компоненты матрикса, обнаруживаются ферменты, участвующие в цикле трикарбоновых кислот. Следовательно, в матриксе локализованы ферменты этого цикла, которые находятся в свободном, не связанном состоянии с митохондриальными мембранами, за исключением сукцинатдегидрогеназы. Кроме того, в состав матрикса входят ферменты окисления жирных кислот; основной продукт окисления жирных кислот - ацетилкоэнзим ? - тоже в матриксе поступает в цикл трикарбоновых кислот, в котором он подвергается дальнейшему окислению до СО2 и Н2О В матриксе митохондрий происходит также окисление некоторых аминокислот, поступающих в цикл трикарбоновых кислот.
Остальные события, связанные с дальнейшим переносом электронов и синтезом АТФ связаны с внутренней митохондриальной мембраной, с кристами митохондрий.
Освободившиеся в процессе окисления в цикле трикарбоновых кислот электроны, акцептированные на коферментах, переносятся затем в дыхательную цепь (цепь переноса электронов), где они соединяются с молекулярным кислородом, образуя молекулы воды.
Дыхательная цепь представляет собой ряд белковых комплексов, встроенных во внутреннюю митохондриальную мембрану (рис. 210). Существуют три главных ферментных комплекса. Первый, NADH-дегидрогеназный комплекс принимает электроны от NADH и переносит их во второй комплекс, комплекс в-С1, который в свою очередь, переносит их на цитохромоксидазный комплекс, а он их передает на кислород, в результате чего образуется вода. На этом окисление заканчивается.
Как и полагается, окисление исходного субстрата привело к выделению СО2 и воды, но при этом не выделилась тепловая энергия, как при горении, а образовались молекулы АТФ. Они были синтезированы другой группой белков, не связанных прямо с окислением. Было найдено, что во внутренних митохондриальных мембранах на поверхности мембран, смотрящих в матрикс, располагаются крупные белковые комплексы, ферменты, АТФ-синтетазы. В электронном микроскопе во фракции внутренних митохондриальных частиц видны так называемые "грибовидные" тельца сплошь выстилающие поверхность мембран, смотрящую в матрикс. Эти тельца имеют как бы ножку и головку. Диаметром 8-9 нм. Было обнаружено, что эти тельца представляют собой белковый комплекс, состоящий из 9 субъединиц - АТФ-синтетазу. Следовательно, во внутренних мембранах митохондрий локализованы ферменты как окислительной цепи, так и ферменты синтеза АТФ (рис. 201б).
Дыхательная цепь - это главная система превращения энергии в митохондриях. Здесь происходит последовательное окисление и восстановление элементов дыхательной цепи, в результате чего высвобождается небольшими порциями энергия. За счет этой энергии в трех точках цепи из АДФ и фосфата образуется АТФ. Поэтому говорят, что окисление (перенос электронов) сопряжено с фосфорилированием (АДФ + Фн >АТФ, т.е. происходит процесс окислительного фосфорилирования.
В результате многократной оборачиваемости субстратов в цикле Кребса происходит полное окисление поступивших продуктов первичного гликолитического окисления, и затем в цепи окислительного фосфорилирования происходит максимальное использование освободившейся при окислении энергии для синтеза АТФ.
Было высказано предположение, что выделяющаяся при транспорте электронов энергия запасается в виде градиента протонов на мембране. При этом на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий возникает повышенная концентрация положительно заряженных ионов водорода. Возникший при этом протонный градиент является движущей силой в синтезе АТФ (рис. 211).
Это предположение стало затем теорией, хемиосмотической теорией сопряжения окисления субстратов с синтезом АТФ. Как оказалось, при переносе электронов в митохондриальной мембране каждый комплекс дыхательной цепи направляет свободную энергию окисление на перемещение протонов (положительных зарядов) через мембрану, из матрикса в межмембранное пространство, что приводит к образованию разности потенциалов на мембране: положительные заряды преобладают в межмембранном пространстве, а отрицательные - со стороны матрикса митохондрий. При достижении определенной разности потенциалов (220 мВ) белковый комплекс АТФ-синтетазы начинает транспортировать протоны обратно в матрикс, при этом превращает одну форму энергии в другую: образует АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Так происходит сопряжение окислительных процессов с синтетическим, с фосфорилированием АДФ. Пока происходит окисление субстратов, пока происходит перекачка протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану - идет сопряженный с этим синтез АТФ, т.е. происходит окислительное фосфорилирование.
Эти два процесса могут быть разобщены. Можно снять разность потенциалов на митохондриальной мембране, или механически ее нарушить, или с помощью химических соединений (например, динитрофенола) сделать в ней диффузионные каналы. При этом будет продолжаться перенос электронов, будет продолжаться окисление субстрата, но синтеза АТФ уже происходить не будет. В этом случае энергия, освобождающаяся при окислении будет переходить в тепловую энергию.

Окислительное фосфорилирование у бактерий
У прокариотических клеток, способных к окислительному фосфорилированию, элементы цикла трикарбоновых кислот локализованы прямо в цитоплазме, а ферменты дыхательной цепи и фосфорилирования связаны с клеточной, плазматической мембраной. Это было вначале показано цитохимическими методами. Так, фермент сукцинатдегидрогеназа связан с плазматической мембраной и с ее выпячиваниями, выступающими внутрь цитоплазмы, с так называемыми мезосомами (рис. 212). Надо отметить, что такие бактериальные мезосомы могут быть связаны не только с процессами аэробного дыхания, но и у некоторых видов участвовать в делении клеток, в процессе распределения ДНК по новым клеткам, в образовании клеточной стенки и т.д. На плазматической мембране в мезосомах некоторых бактерий локализуются также факторы сопряжения окисления и синтеза АТФ. В электронном микроскопе во фракциях плазматических мембран бактерий обнаружены сферические частицы, аналогичные тем, которые были найдены в митохондриях эукариотических клеток. Таким образом, у бактериальных клеток, способных к окислительному фосфорилированию, плазматическая мембрана выполняет роль, аналогичную внутренней мембране митохондрий эукариотических клеток.
Увеличение числа митохондрий
Так же, как и другие органеллы цитоплазмы, митохондрии могут увеличиваться в числе, что особенно заметно при делении клеток или при увеличении функциональной нагрузки клетки, более того, происходит постоянное обновление митохондрий. Так, в печени средняя продолжительность жизни митохондрий составляет около 10 дней. Поэтому закономерно возникает вопрос, каким образом происходит это увеличение числа митохондрий, за счет каких процессов и каких структур образуются новые митохондрии.
Основная масса экспериментальных данных говорит о том, что увеличение числа митохондрий происходит путем роста и деления предшествующих митохондрий. Это предположение было впервые высказано Альтманом (1893), описавшим митохондрии под термином "биобласты". Позднее с помощью цейтраферной киносъемки удалось наблюдать прижизненно деление, фрагментацию длинных митохондрий на более короткие. Особенно отчетливо виден этот процесс при делении клеток некоторых одноклеточных водорослей и низших грибов, у которых деление митохондрий скоординировано с клеточным делением. В электронный микроскоп часто во многих клетках можно видеть деление митохондрий путем образования перетяжки (рис. 213), например в клетках печени (хотя без доказательств динамичности этого процесса такие наблюдения мало убедительны). Внешне все эти картины очень напоминают бинарный способ деления бактерий.
Реальность увеличения числа митохондрий путем деления были доказаны при изучении поведения митохондрий в живых клетках культуры ткани. Было обнаружено , что в течение клеточного цикла митохондрии могут вырастать до нескольких мкм, а затем фрагментироваться, делиться на более мелкие тельца.
Кроме того, митохондрии могут сливаться друг с другом. Так, в культуре клеток эндотелия сердца головастика ксенопуса наблюдали до 40 случаев слияния и деления митохондрий за 1 час. В клетках культуры почек эмбрионов наблюдали рост и ветвление митохондрий в S-периоде клеточного цикла. Однако уже в G2- периоде преобладали в числе мелкие митохондрии, образовавшиеся за счет деления при фрагментации длинных митохондрий.
Таким образом, размножение митохондрий идет по принципу: omnis mitochondrion e mitochondrion.
Интересны наблюдения за судьбой митохондрий в дрожжевых клетках. В аэробных условиях дрожжевые клетки имеют типичные митохондрии с четко выраженными кристами. При переносе клеток в анаэробные условия (например, при их пересеве или при перемещении в атмосферу азота) типичные митохондрии в их цитоплазме не обнаруживаются, и вместо них видны мелкие мембранные пузырьки. Оказалось, что в анаэробных условиях дрожжевые клетки не содержат полную дыхательную цепь (отсутствуют цитохрому b и a). При аэрации культуры наблюдается быстрая индукция биосинтеза дыхательных ферментов, резкое повышение потребления кислорода, а в цитоплазме появляются нормальные митохондрии. Эти наблюдения привели к представлению о том, что у дрожжей в анаэробных условиях в цитоплазме существуют промитохондриальные структуры с редуцированной системой окисления. Такие промитохондрии при переносе клеток в условия аэробной среды начинают перестраиваться, происходит включение в их мембраны элементов полной цепи окисления и фосфорилирования, что сопровождается изменением их морфологии. Так, из примитивных, неактивных промитохондрий путем их достройки и роста образуются обычные функционирующие митохондрии.
Вероятно, сходные процессы протекают и при делении митохондрий: происходит увеличение массы митохондриальных мембран со всеми специфическими компонентами за счет синтеза и включения в них отдельных белков - ферментов и липидов, нарастание массы белков матрикса, а затем происходит деление как бы удвоившейся или многократно увеличившейся структуры.
Эти представления получают поддержку со стороны фактов, касающихся организации и состава митохондриального матрикса или митоплазмы, в которой обнаружены ДНК, разные типы РНК и рибосомы.
Авторепродукция митохондрий
Исследования последних лет привели к удивительным открытиям: двумембранные органеллы обладают полной системой авторепродукции. Эта система полная в том смысле, что в митохондриях и пластидах открыта ДНК, на которой в них синтезируются информационные, трансферные и рибосомные РНК и рибосомы, осуществляющие синтез митохондриальных и пластидных белков. Однако, как оказалось, эти системы, хотя и автономны, очень ограничены по своим возможностям.
ДНК в митохондриях представлена циклическими молекулами, не образующими связь с гистонами, в этом отношении они напоминают бактериальные хромосомы. Размер их невелик, около 7 мкм, в одну циклическую молекулу митохондрий животных входит 16-19тыс. нуклеотидных пар ДНК. У человека митохондриальная ДНК содержит 16,5 тыс. н.п., она полностью расшифрована. Найдено, что митохондральная ДНК различных объектов очень однородна, отличие их заключается лишь в величине интронов и нетранскрибируемых участков. Все митохондриальные ДНК представлены множественными копиями, собранными в группы, кластеры. Так в одной митохондрии печени крысы может содержаться от 1 до 50 циклических молекул ДНК. Общее же количество митохондриальной ДНК на клетку составляет около одного процента. Синтез митохондриальных ДНК не связан с синтезом ДНК в ядре.
Так же как и у бактерий митохондральная ДНК собрана в отдельную зону - нуклеоид, его размер составляет около 0, 4 мкм в диаметре. В длинных митохондриях может быть от 1 до 10 нуклеоидов. При делении длинной митохондрии от нее отделяется участок, содержащий нуклеоид (сходство с бинарным делением бактерий). Количество ДНК в отдельных нуклеоидах митохондрий может колебаться в 10 раз в зависимости от типа клеток.
Прижизненно нуклеоиды митохондрий можно окрашиваться специальными флуорохромами. Оказалось, что в некоторых культурах в клетках от 6 до 60% митохондрий не имеют нуклеоида, что может объясняться тем, что деление этих органелл скорее связано с фрагментацией, а не с распределением нуклеоидов.
Как уже говорилось, митохондрии могут как делиться, так и сливаться друг с другом. В обычной культуре клеток человека Hela все митохондрии содержат нуклеоиды. Однако одна из мутантных линий этой культуры содержала митохондрии, в которых нуклеоиды с помощью флуорохромов не выявлялись. Но если эти мутантные клетки слить с цитопластами клеток исходного типа, то во всех митохондриях нуклеоиды были обнаружены. Это говорит о том, что при слиянии митохондрий друг с другом может происходить обмен их внутренними компонентами.
Важно подчеркнуть, что рРНК и рибосомы митохондрий резко отличны от таковых в цитоплазме. Если в цитоплазме обнаруживаются 80s рибосомы, то рибосомы митохондрий растительных клеток принадлежат к 70s рибосомам (состоят из 30s и 50s субъединиц, содержат 16s и 23s РНК, характерные для прокариотических клеток), а в митохондриях клеток животных обнаружены более мелкие рибосомы (около 50s).
Рибосомные РНК митохондрий синтезируются на митохондриальных ДНК. В митоплазме на рибосомах идет синтез белков. Он прекращается, в отличие от синтеза на цитоплазматических рибосомах, при действии антибиотика хлорамфеникола, подавляющего синтез белка у бактерий.
На митохондриальном геноме синтезируются и транспортные РНК, всего синтезируется 22 тРНК. Триплетный код митохондриальной синтетической системы отличен от такового, используемого в гиалоплазме. Несмотря на наличие казалось бы всех компонентов, необходимых для синтеза белков, небольшие молекулы митохондриальной ДНК не могут кодировать все митохондриальные белки, только лишь их небольшую часть. Так ДНК размером 15 тыс.н.п. может кодировать белки с суммарным молекулярным весом около 6х105. В это же время суммарный молекулярный вес белков частицы полного дыхательного ансамбля митохондрии достигает величины около 2х106. Если учесть, что кроме белков окислительного фосфорилирования в митохондрии входят ферменты цикла трикарбоновых кислот, ферменты синтеза ДНК и РНК, ферменты активации аминокислот и другие белки, то видно, что, для того чтобы кодировать эти многочисленные белки и рРНК и тРНК, количества генетической информации в короткой молекуле митохондриальной ДНК явно не хватает. Расшифровка нуклеотидной последовательности митохондриальной ДНК человека показала, что она кодирует всего лишь 2 рибосомные РНК, 22 трансферных РНК и всего 13 различных полипептидных цепей.
В настоящее время имеются убедительные доказательства, что большая часть белков митохондрий находится под генетическим контролем со стороны клеточного ядра и синтезируется вне митохондрий. Так, в частности цитохром с, образуется в гиалоплазме, а из девяти полипептидных цепей в составе АТФ-синтетазы только одна синтезируется в матриксе митохондрий животных. Митохондриальная ДНК кодирует лишь немногие митохондриальные белки, которые локализованы в мембранах и представляют собой структурные белки, ответственные за правильную интеграцию в митохондриальных мембранах отдельных функциональных компонентов.
Большинство митохондриальных белков синтезируется на рибосомах в цитозоле. Эти белки имеют специальные сигнальные последовательности, которые узнаются рецепторами на внешней мембране митохондрий. Эти белки могут встраиваться в них (см. аналогию с мембраной пероксисом), а затем перемещаться на внутреннюю мембрану. Этот перенос происходит в точках контакта наружной и внутренней мембран, где такой транспорт отмечен (рис. 214). Большинство липидов митохондрий так же синтезируются в цитоплазме.
Все эти открытия, показывающие относительно независимое строение и функционирование системы белкового синтеза митохондрий, возродили гипотезу о эндосимбиотическом происхождении митохондрий, о том, что митохондрии представляют собой организмы типа бактерий, находящиеся в симбиозе с эукариотический клеткой.
Хондриом
Хондриом - это совокупность всех митохондрий в одной клетке. Оказалось, что такая совокупность может быть различной в зависимости от типа клеток. Так, во многих клетках хондриом представлен разрозненными многочисленными митохондриями, разбросанными довольно равномерно по всей цитоплазме, как, например, во многих недифференцированных клетках (рис. 215а). В других случаях отдельные митохондрии локализуются группами в местах интенсивной траты АТФ, как например, в клетках анализаторов сетчатки. В обоих этих случаях митохондрии функционируют поодиночке, их кооперативная работа, возможно, координируется какими-то сигналами из цитоплазмы. Однако существует и совершенно иной тип хондриома, когда вместо мелких одиночных разрозненных митохондрий в клетке располагается одна гигантская разветвленная митохондрия (рис. 215в). Такие митохондрии часто встречаются у одноклеточных зеленых водорослей (например у Chlorella). В этих случаях мы видим не отдельные митохондрии, а сложную митохондриальную систему, сеть или, как ей дали название, митохондриальный ретикулум (Reticulum miyochondriale). Каков биологический смысл появления такой гигантской разветвленной митохондриальной структуры, объединенной в одно целое своими внешними и внутренними мембранами? Согласно хемоосмотической теории, возникший на поверхности внутренней мембраны электрохимический протонный градиент равномерно распределяется по поверхности внутренней мембраны митохондрий, она эквипотенциальна в любой своей точке. Поэтому в любой точке поверхности внутренней мембраны такой разветвленной митохондрии может идти синтез АТФ, который будет поступать в любую точку цитоплазмы, где в этом есть необходимость. Т.е. такие разветвленные митохондрии могут представлять собой "электрический кабель".
То, что это действительно имеет место, было доказано экспериментально. Были выбраны растущие в культуре ткани фибробласты, в цитоплазме которых имеются длинные нитчатые митохондрии, достигающие 60 мкм. В живых клетках их можно наблюдать с помощью флуорохрома этилродамина, который накапливается в матриксе только работающих, синтезирующих АТФ, митохондрий. Если снять разность потенциалов на внутренней мембране митохондрий, воздействуя на клетки динитрофенолом, то свечение этилродамина в митохондриях прекращается, параллельно падению синтеза АТФ. При этом гашение флуоресценции происходит во всех митохондрий. Это наблюдение показывает, что этилродамин, как протонный краситель, накапливается в матриксе митохондрий, только тогда, когда есть разность потенциалов на внутренней мембране митохондрий, т.е. когда происходит синтез АТФ.
Но динитрофенол, встраиваясь в мембрану, создает "пробой" на всех митохондриях данной клетки. А как "выключить" одну митохондрию? Для этого используется лазерный или ультрафиолетовый микролуч, который можно точно направить на избранную экспериментатором митохондрию (рис. 216). Делается это с помощью специальной оптической системы, которая позволяет одновременно рассматривать объект (в данном случае живые клетки с окрашенными родамином митохондриями) и навести на избранную деталь тонкий пучок лазера или ультрафиолетового света. При облучении отдельной митохондрии происходит в ней гашение флуоресценции родамина из-за того, что в результате пробоя внутренней мембраны митохондрии разность потенциалов на ней падает, и родамин как бы вытекает из матрикса митохондрии. При этом соседние митохондрии не меняют своего свечения и продолжают синтез АТФ. Что же произойдет, если облучить небольшой участок разветвленной или же очень длинной митохондрии? В эксперименте одна из протяженных светящихся митохондрий фибробласта была локально поражена узким (0,5 мкм) микролучом оптического лазера. В результате этого вся длинная митохондрия потухла, в то время как соседние оставались без изменений (рис. 216б). Поражение микролучом участков свободной от митохондрии цитоплазмы не приводило к тушению митохондрий. Это говорит о том, что точечный пробой мембраны митохондрии приводит к снятию разности потенциалов не только в точке пробоя, но по всей длине митохондрии, которая представляет собой проводник с эквипотенциальной поверхностью. Следовательно, такие длинные нитчатые митохондрии фибробластов могут представлять собой электрические проводники, могущие передавать разность потенциалов на митохондриальных мембранах на большие расстояния и объединять удаленные участки цитоплазмы.
Это значит, что и в случае гигантских разветвленных митохондрий в любой ее точке может на внутренней мембране накопиться потенциал, достаточный для того, чтобы начался синтез АТФ. С этих позиций митохондриальный ретикулум представляет собой как бы электрический проводник, кабель, соединяющий отдаленные точки такой системы. Митохондриальный ретикулум может оказаться очень полезным не только для мелких подвижных клеток, таких как хлорелла, но и для более крупных, там, где требуется кооперация и синхронизация в работе многих структурных единиц таких как, например, миофибриллы в скелетных мышцах.
Как известно, скелетные мышцы состоят из массы мышечных волокон, симпластов, содержащих множество ядер. Длина таких мышечных волокон достигает 40 мкм, при толщине 0,1 мкм - это гигантская структура, содержащая великое множество миофибрилл, все из которых сокращаются одновременно, синхронно. Для такого сокращения к каждой единице сокращения, к каждому саркомеру миофибрилл, должно быть доставлено большое количество АТФ. На продольных ультратонких срезах скелетных мышц в электронном микроскопе видны многочисленные округлые мелкие сечения митохондрий, располагающихся в соседстве с саркомерами (рис. 217). Если же исследовать поперечные срезы мышечных волокон на уровне z-дисков, то видно, что мышечные митохондрии представляют собой не мелкие шарики или палочки, а как бы паукообразные структуры, отростки которых могут ветвиться и простираться на большие расстояния, иногда через весь поперечник мышечного волокна. При этом разветвления митохондрий окружают каждую миофибриллу в мышечном волокне, снабжая их АТФ, необходимого для мышечного сокращения. Следовательно, в плоскости z-диска митохондрии представлены типичным митохондриальным ретикулумом - единой митохондриальной системой. Такой пласт или этаж митохондриального ретикулума повторяется дважды на каждый саркомер, а все мышечное волокно имеет тысячи поперечно расположенных "поэтажных" пластов митохондриального ретикулума. Было обнаружено, что между "этажами" вдоль миофибрилл располагаются нитчатые митохондрии, соединяющие эти митохондриальные пласты. Тем самым создается трехмерная картина митохондриального ретикулума, проходящего через весь объем мышечного волокна (рис. 218).
Здесь же было обнаружено, что как между ответвлениями митохондриального ретикулума, так и между ним и нитевидными продольными митохондриями существуют специальные межмитохондриальные соединения или контакты (ММК). Они образованы плотно прилегающими наружными митохондриальными мембранами контактирующих митохондрий, межмембранное пространство и мембраны в этой зоне имеют повышенную электронную плотность (рис. 219). Было сделано предположение, что через эти специальные образования может происходить функциональное объединение соседних митохондрий и митохондриальных ретикулумов в единую, кооперативную энергетическую систему. Все миофибриллы в мышечном волокне сокращаются синхронно по всей их длине, следовательно, и поступление АТФ на любом участке этой сложной машины тоже должно происходить синхронно, а это может происходить лишь в том случае, если огромное количество разветвленных митохондрий-проводников будет связано друг с другом клеммами-контактами (ММК).
Доказать то, что ММК действительно участвуют в энергетическом объединении митохондрий друг с другом удалось на другом типе поперечно-исчерченнных мышц - на кардиомиоцитах, клетках сердечных мышц.
Оказалось, что хондриом клеток сердечной мышцы не образует ветвящихся структур, а представлен множеством небольших вытянутых митохондрий, располагающихся без особого порядка между миофибриллами. Однако было найдено, что все соседние митохондрии стыкуются друг с другом с помощью митохондриальных контактов такого же типа, как в скелетной мышце, только их число очень велико: в среднем на одну митохондрию приходится 2-3 ММК, которые связывают митохондрии в единую цепь, где каждым звеном такой цепи (Streptio mitochondriale) является отдельная митохондрия (рис. 220). Такой тип хондриома также может служить целям синхронного сокращения всех саркомеров в миофибриллах кардиомиоцитов. Для такой кооперативной координации митохондрий должны служить множественные межмитохондриальные контакты (рис. 221, 222).
Для доказательства этой гипотезы были использованы кардиомиоциты эмбрионов крысы в культуре ткани. Эти клетке имеют гетерогенные по размеру и форме митохондрии, расположенные между миофибриллами (рис. 223). В электронном микроскопе было обнаружено, что между некоторыми митохондриями были видны ММК, объединяющие их в небольшие группы - кластеры. В дальнейшем были проведены эксперименты, аналогичные тем, которые были сделаны на культуре фибробластов: митохондрии живых кардиомиоцитов окрашивали этилродамином, а затем одну из митохондрий в группе облучали лазерным микропучком. Облучение одиночных митохондрий приводило к быстрому их гашению. В одних случаях погасала только облученная митохондрия, в других - теряла люминесценцию вся группа митохондрий (рис. 224). Электронная микроскопия показала, что в последнем случае митохондрии в кластере были связаны друг с другом с помощью ММК. Следовательно, если одиночные митохондрии теряют этилродамин после лазерного укола вследствие электрического пробоя митохондриальной мембраны, то гашение группы митохондрий, связанных ММК, доказывает, что ММК, как клеммы, объединяют в единую цепь потенциалы одиночных митохондрий. По всей вероятности, области ММК проницаемы для протонов, которые могут передаваться с внутренней митохондриальной мембраны одной митохондрии на внутреннюю мембрану другой, и тем самым объединять митохондрии в единую энергетическую систему.
Как оказалось, межмитохондриальные контакты (ММК), как обязательная структура сердечных клеток, встречаются не только у крыс. Они обнаружены в кардиомиоцитах как желудочков, так и предсердий всех позвоночных животных: млекопитающих, птиц, пресмыкающихся, амфибий и костистых рыб. Более того ММК были обнаружены (но в меньшем числе) в клетках сердца некоторых насекомых и моллюсков. Эти наблюдения говорят о чрезвычайно важной биологической роли этих структур, характеризующих митохондрии интенсивно и постоянно работающих клеток сердца.
Было обнаружено, что количество ММК в кардиомиоцитах изменяется в зависимости от функциональной нагрузки на сердце. Так, если у крыс вызвать экспериментальное усиление работы сердечной мышцы, например при компенсаторной гипертрофии миокарда (частичная перевязка аорты), то количество ММК увеличивается почти вдвое. Увеличивается число ММК и при повышении физических нагрузок животных. Наоборот, при ограничении подвижности животных, находящихся в тесных камерах более 4-х месяцев (как в космическом корабле), при падении нагрузки на сердечную мышцу, происходит резкое сокращение числа ММК.
Те же закономерности наблюдается и у других животных в естественных условиях их жизни. Так уменьшается число ММК у зимних спящих летучих мышей, у зимующих сурков. Резко возрастает число ММК в кардиомиоцитах летающих стрижей, по сравнению с их птенцами до вылета из гнезда. Из этих наблюдений можно сделать обобщение: чем выше функциональная нагрузка на кардиомиоциты, чем выше потребление энергии, тем большее количество ММК связывает отдельные митохондрии в единую кооперативную систему.
На рис. 225 представлены варианты организации хондриома в различных клетках. Хондриом может иметь различную композицию в зависимости от энергетических потребностей клетки. В простейшем (и чаще встречающемся ) случае он может быть представлен множеством разрозненных небольших митохондрий, функционирующих независимо друг от друга и снабжающих АТФ небольшие участки цитоплазмы. В другом случае длинные и разветвленные митохондрии могут энергетически обеспечивать отдаленные друг от друга участки клетки. Вариантом такой протяженной системы может быть хондриом типа митохондриального ретикулума, который встречается как у одноклеточных, так и у многоклеточных организмов. Особенно сложно этот вид хондриома выражен в скелетных мышцах млекопитающих, где группы гигантских разветвленных митохондрий связаны друг с другом с помощью ММК. Вообще же наличие ММК характерно для хондриомов сократимых структур. Особенно обильно ММК представлены в клетках сердечных мышц, где они функционально связывают множественные отдельные митохондрии в единую разветвленную цепь.
Глава 19. Пластиды
Пластиды - это мембранные органоиды, встречающиеся у фотосинтезирующих эукариотических организмов (высшие растения, низшие водоросли, некоторые одноклеточные организмы). Подобно митохондриям, пластиды окружены двумя мембранами, в их матриксе имеется собственная геномная система, функции пластид связаны с энергообеспечением клетки, идущим на нужды фотосинтеза. У высших растений найден целый набор различных пластид (хлоропласт, лейкопласт, амилопласт, хромопласт), представляющих собой ряд взаимных превращений одного вида пластиды в другой. Основной структурой, которая осуществляет фотосинтетические процессы, является хлоропласт (рис. 226а).
Хлоропласт
Как уже указывалось, строение хлоропласта в принципе напоминает строение митохондрии. Обычно это структуры удлиненной формы с шириной 2-4 мкм и протяженностью 5-10 мкм. У зеленых водорослей встречаются гигантские хлоропласты (хроматофоры), достигающие длины 50 мкм. Количество хлоропластов в клетках разных растений не стандартно. Так, у зеленых водорослей может быть по одному хлоропласту на клетку. Обычно на клетку высших растений приходится в среднем 10-30 хлоропластов. Встречаются клетки с огромным количеством хлоропластов. Например, в гигантских клетках палисадной ткани махорки обнаружено около 1000 хлоропластов.
Хлоропласты представляют собой структуры, ограниченные двумя мембранами - внутренней и внешней. Внешняя мембрана, как и внутренняя, имеет толщину около 7 мкм, они отделены друг от друга межмембранным пространством около 20-30 нм. Внутренняя мембрана хлоропластов отделяет строму пластиды, аналогичную матриксу митохондрий. В строме зрелого хлоропласта высших растений видны два типа внутренних мембран. Это - мембраны, образующие плоские, протяженные ламеллы стромы, и мембраны тилакоидов, плоских дисковидных вакуолей или мешков.
Ламеллы стромы (толщиной около 20 мкм) представляют собой плоские полые мешки или же имеют вид сети из разветвленных и связанных друг с другом каналов, располагающихся в одной плоскости. Обычно ламеллы стромы внутри хлоропласта лежат параллельно друг другу и не образуют связей между собой.
Кроме мембран стромы в хлоропластах обнаруживаются мембранные тилакоиды. Это плоские замкнутые мембранные мешки, имеющие форму диска. Величина межмембранного пространства у них также около 20-30 нм. Такие тилакоиды образуют стопки наподобие столбика монет, называемые гранами (рис. 227). Число тилакоидов на одну грану очень варьирует: от нескольких штук до 50 и более. Размер таких стопок может достигать 0,5 мкм, поэтому граны видны в некоторых объектах в световом микроскопе. Количество гран в хлоропластах высших растений может достигать 40-60. Тилакоиды в гране сближены друг с другом так, что внешние слои их мембран тесно соединяются; в месте соединения мембран тилакоидов образуется плотный слой толщиной около 2 нм. В состав граны кроме замкнутых камер тилакоидов обычно входят и участки ламелл, которые в местах контакта их мембран с мембранами тилакоидов тоже образуют плотные 2-нм слои. Ламеллы стромы, таким образом, как бы связывают между собой отдельные граны хлоропласта. Однако полости камер тилакоидов всезда замкнуты и не переходят в камеры межмембранного пространства ламелл стромы. Ламеллы стромы и мембраны тилакоидов образуются путем отделения от внутренней мембраны при начальных этапах развития пластид.
В матриксе (строме) хлоропластов обнаруживаются молекулы ДНК, рибосомы; там же происходит первичное отложение запасного полисахарида, крахмала, в виде крахмальных зерен.
Функции хлоропластов
Хлоропласты - это структуры, в которых происходят фотосинтетические процессы, приводящие в конечном итоге к связыванию углекислоты, к выделению кислорода и синтезу сахаров.
Характерным для хлоропластов является наличие в них пигментов, хлорофиллов, которые и придают окраску зеленым растениям. При помощи хлорофилла зеленые растения поглощают энергию солнечного света и превращают ее в химическую. Поглощение света с определенной длиной волны приводит к изменению в структуре молекулы хлорофилла, она переходит при этом в возбужденное, активированное состояние. Освобождающаяся энергия активированного хлорофилла через ряд промежуточных этапов передается определенным синтетическим процессам, приводящим к синтезу АТФ и к восстановлению акцептора электронов НАДФ (никотинамидадениндинуклеотид) до НАДФ-Н, которые тратятся на реакции связывания СО2 и синтез сахаров.
Суммарная реакция фотосинтеза может быть выражена следующим образом:
nСО2 + nН2О свет ?==> (СН2О) n + nО2 (I)
хлорофилл

Таким образом, главный итоговый процесс здесь - связывание двуокиси углерода с использование воды для образования различных углеводов и выделение кислорода. Молекулы кислорода, который выделяется в процессе фотосинтеза у растений, образуется за счет гидролиза молекулы воды. Следовательно, процесс фотосинтеза включает в себя процесс гидролиза воды, которая служит одним из источников электронов или атомов водорода. Биохимические исследования показали, что процесс фотосинтеза представляет собой сложную цепь событий, заключающую в себе две фазы: световую и темновую. Первая, протекающая только на свету, связана с поглощением света хлорофиллами и с проведением фотохимической реакции (реакция Хилла). Во второй фазе, которая может идти в темноте, происходит фиксация и восстановление СО2 , приводящие к синтезу углеводов.
В результате световой фазы происходит фотофосфорилирование, синтез АТФ из АДФ и фосфата с использованием цепи переноса электронов, а также восстановление кофермента НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат) в НАДФ-Н, происходящего при гидролизе и ионизации воды. В этой фазе фотосинтеза энергия солнечного света возбуждает электроны в молекулах хлорофилла, которые расположены в мембранах тилакоидов. Эти возбужденные электроны переносятся по компонентам окислительной цепи в тилакоидной мембране, подобно тому как электроны транспортируются по дыхательной цепи в мембране митохондрий. Энергия, освобождающаяся при таком переносе электронов, используется для перекачивания протонов через тилакоидную мембрану внутрь тилакоидов, что приводит к возрастанию разности потенциалов между стромой и пространством внутри тилакоида. Также как и в мембранах крист митохондрий в мембранах тилакоидов встроены молекулярные комплексы АТФ-синтетазы, которые начинают затем транспортировать протоны обратно в матрикс хлоропласта, или строму, и параллельно этому фосфорилировать АДФ, т.е. синтезировать АТФ (рис. 228, 229).
Таким образом, в результате световой фазы происходит синтез АТФ и восстановление НАДФ, которые затем используются при восстановлении СО2, в синтезе углеводов уже в темновой фазе фотосинтеза.
В темновой (независящей от потока фотонов) стадии фотосинтеза за счет восстановленного НАДФ и энергии АТФ происходит связывание атмосферного СО2, что приводит к образованию углеводов. Этот процесс фиксации СО2 и образования углеводов состоит из многих этапов, в которых участвует большое число ферментов (цикл Кальвина). Биохимическими исследованиями было показано, что ферменты, участвующие в темновых реакциях, содержатся в водорастворимой фракции хлоропластов, содержащей компоненты матрикса-стромы этих пластид.
Процесс восстановления СО2 начинается с его присоединения к рибулозодифосфату, углеводу, состоящему из 5 атомов углерода с образованием короткоживущего С6-соединения, которое сразу распадается на два С3-соединения, на две молекулы глицерид-3-фосфата.
Именно на этом этапе при карбоксилировании рибулозодифосфата и происходит связывание СО2. Дальнейшие реакции превращения глицерид-3-фосфата приводят к синтезу различных гексоз и пентоз, к регенерации рибулозодифосфата и к его новому вовлечению в цикл реакций связывания СО2. В конечном счете в хлоропласте из шести молекул СО2 образуется одна молекула гексозы, для этого процесса требуется 12 молекул НАДФ-Н и 18 молекул АТФ, поступающих из световых реакций фотосинтеза. Образовавшийся в результате темновой реакции фруктоза-6 -фосфат дает начало сахарам, полисахаридам (крахмал) и галактолипидам. В строме хлоропластов кроме того из части глицерид-3-фосфата образуются жирные кислоты, аминокислоты и крахмал. Синтез сахарозы завершается в цитоплазме.
В строме хлоропластов происходит восстановление нитритов до аммиака, за счет энергии электронов, активированных светом; в растениях этот аммиак служит источником азота при синтезе аминокислот и нуклеотидов.
Онтогенез и функциональные перестройки пластид
Многих исследователей занимал вопрос о происхождении пластид и о путях их образования.
Еще в конце позапрошлого столетия было найдено, что у нитчатой зеленой водоросли спирогиры деление клеток при вегетативном размножении сопровождается делением их хроматофора путем перетяжки. Подробно исследована судьба хлоропласта у зеленой водоросли хламидомонады (рис. 230). Оказалось, что при бесполом, вегетативном размножении сразу вслед за делением ядра наступает перешнуровка гигантского хроматофора на две части, каждая из которых попадает в одну из дочерних клеток, где дорастает до исходной величины. Такое же равное разделение хлоропласта происходит и при формировании зооспор. При образовании зиготы после слияния гамет, каждая из которых содержала хлоропласт, после объединения ядер хлоропласты сначала соединяются тонкой перемычкой, а затем их содержимое сливается в одну крупную пластиду.
У высших растений также встречается деление зрелых хлоропластов, но очень редко. Увеличение числа хлоропластов и образование других форм пластид (лейкопластов и хромопластов) следует рассматривать как путь превращения структур-предшественников, пропластид. Весь же процесс развития различных пластид можно представить в виде монотропного (идущего в одном направлении) ряда смены форм:

Пропластида ? лейкопласт ? хлоропласт ? хромопласт
?
амилопласт???????????
Многими исследованиями был установлен необратимый характер онтогенетических переходов пластид. У высших растений возникновение и развитие хлоропластов происходят через изменения пропластид (рис. 231).
Пропластиды представляют собой мелкие (0,4-1 мкм) двумембранные пузырьки, не имеющие отличительных черт их внутреннего строения. Они отличаются от вакуолей цитоплазмы более плотным содержимым и наличием двух отграничивающих мембран, внешней и внутренней (наподобие промитохондриям у дрожжевых клеток). Внутренняя мембрана может давать небольшие складки или образовывать мелкие вакуоли. Пропластиды чаще всего встречаются в делящихся тканях растений (клетки меристемы корня, листьев, в точки роста стеблей и др.). По всей вероятности, увеличение их числа происходит путем деления или почкования, отделения от тела пропластиды мелких двумембранных пузырьков.
Судьба таких пропластид будет зависеть от условий развития растений. При нормальном освещении пропластиды превращаются в хлоропласты. Сначала они растут, при этом происходит образование продольно расположенных мембранных складок от внутренней мембраны. Одни из них простираются по всей длине пластиды и формируют ламеллы стромы; другие образуют ламеллы тилакоидов, которые выстраиваются в виде стопки и образуют граны зрелых хлоропластов.
Несколько иначе развитие пластид происходит в темноте. У этиолированных проростков происходит в начале увеличение объема пластид, этиопластов, но система внутренних мембран не строит ламеллярные структуры, а образует массу мелких пузырьков, которые скапливаютсяя в отдельные зоны и даже могут формировать сложные решетчатые структуры (проламеллярные тела). В мембранах этиопластов содержится протохлорофилл, предшественник хлорофилла желтого цвета. Под действие света из этиопластов образуются хлоропласты, протохлорофилл превращается в хлорофилл, происходит синтез новых мембран, фотосинтетических ферментов и компонентов цепи переноса электронов.
При освещении клеток мембранные пузырьки и трубочки быстро реорганизуются, из них развивается полная система ламелл и тилакоидов, характерная для нормального хлоропласта.
Лейкопласты отличаются от хлоропластов отсутствием развитой ламеллярной системы (рис. 226 б). Встречаются они в клетках запасающих тканей. Из-за их неопределенной морфологии лейкопласты трудно отличить от пропластид, а иногда и от митохондрий. Они, как и пропластиды, бедны ламеллами, но тем не менее способны к образованию под влиянием света нормальных тилакоидных структур и к приобретению зеленой окраски. В темноте лейкопласты могут накапливать в проламеллярных телах различные запасные вещества, а в строме лейкопластов откладываются зерна вторичного крахмала. Если в хлоропластах происходит отложение так называемого транзиторного крахмала, который присутствует здесь лишь во время ассимиляции СО2, то в лейкопластах может происходить истинное запасание крахмала. В некоторых тканях (эндосперм злаков, корневища и клубни) накопление крахмала в лейкопластах приводит к образованию амилопластов, сплошь заполненных гранулами запасного крахмала, расположенных в строме пластиды (рис. 226в).
Другой формой пластид у высших растений является хромопласт, окрашивающийся обычно в желтый свет в результате накопления в нем каротиноидов (рис. 226г). Хромопласты образуются из хлоропластов и значительно реже их лейкопластов (например, в корне моркови). Процесс обесцвечивания и изменения хлоропластов легко наблюдать при развитии лепестков или при созревании плодов. При этом в пластидах могут накапливаться окрашенные в желтый цвет капельки (глобулы) или в них появляются тела в форме кристаллов. Эти процессы сопряжены с постепенным уменьшением числа мембран в пластиде, с исчезновением хлорофилла и крахмала. Процесс образования окрашенных глобул объясняется тем, что при разрушении ламелл хлоропластов выделяются липидные капли, в которых хорошо растворяются различные пигменты (например, каротиноиды). Таким образом, хромопласты представляют собой дегенерирующие формы пластид, подвернутые липофанерозу - распаду липопротедных комплексов.
Фотосинтезирующие структуры низших эукариотических и
прокариотических клеток
Строение пластид у низших фотосинтезирующих растений (зеленые , бурые и красные водоросли) в общих чертах сходно с хлоропластами клеток высших растений. Их мембранные системы также содержат фоточувствительные пигменты. Хлоропласты зеленых и бурых водорослей (иногда их называют хроматофорами) имеют также внешнюю и внутреннюю мембраны; последняя образует плоские мешки, располагающиеся параллельными слоями, граны у этих форм не встречаются (рис. 232). У зеленых водорослей в состав хроматофора входят пиреноиды, представляющие собой окруженные мелкими вакуолями зону, вокруг которой происходит отложение крахмала (рис. 233).
Форма хлоропластов у зеленых водорослей очень разнообразна - это или длинные спиральные ленты (Spirogira), сети (Oedogonium), или мелкие округлые, похожие на хлоропласты высших растений (рис. 234).
Среди прокариотических организмов многие группы обладают фотосинтетическими аппаратами и имеют в связи с этим особое строение. Для фотосинтезирующих микроорганизмов (синезеленые водоросли и многие бактерии) характерно, что их фоточувствительные пигменты локализуются в плазматической мембране или в её выростах, направленных вглубь клетки.
В мембранах синезеленых водорослей кроме хлорофилла находятся пигменты фикобилины. Фотосинтезирующие мембраны синезеленых водорослей образуют плоские мешки (ламеллы), которые располагаются параллельно друг над другом, иногда образуя стопки или спирали. Все эти мембранные структуры образуются за счет инвагинаций плазматической мембраны.
У фотосинтезирующих бактерий (Chromatium) мембраны образуют мелкие пузырьки, число которых так велико, что они заполняют практически большую часть цитоплазмы. Можно видеть, как эти пузырьки образуются за счет впячивания и последующего роста плазматической мембраны. Эти мембранные пузырьки (их также называют хроматофорами) содержат фоточувствительный пигмент бактериохлорофилл, каратиноиды, компоненты фотосинтетической системы переноса электронов и фотофосфорилирования. Некоторые пурпурные бактерии содержат систему мембран, образующих правильные стопки, наподобие тилакоидов в гранах хлоропластов (рис. 235).
Геном пластид
Подобно митохондриям, хлоропласты имеют собственную генетическую систему, обеспечивающую синтез ряда белков внутри самих пластид. В матриксе хлоропластов обнаруживаются ДНК, разные РНК и рибосомы. Оказалось, что ДНК хлоропластов резко отличается от ДНК ядра. Она представлена циклическими молекулами длиной до 40-60 мкм, имеющими молекулярный вес 0,8-1,3х108 дальтон. В одном хлоропласте может быть множество копий ДНК. Так, в индивидуальном хлоропласте кукурузы присутствует 20-40 копий молекул ДНК. Длительность цикла и скорость репликации ядерной и хлоропластной ДНК, как было показано на клетках зеленых водорослей, не совпадают. ДНК хлоропластов не состоит в комплексе с гистонами. Все эти характеристики ДНК хлоропластов близки к характеристикам ДНК прокариотических клеток. Более того, сходство ДНК хлоропластов и бактерий подкрепляется еще и тем, что основные регуляторные последовательности транскрипции (промоторы, терминаторы) у них одинаковы. На ДНК хлоропластов синтезируются все виды РНК (информационная, трансферная, рибосомная). ДНК хлоропластов кодирует рРНК, входящую в состав рибосом этих пластид, которые относятся к прокариотическому 70S типу (содержат 16S и 23S рРНК). Рибосомы хлоропластов чувствительны к антибиотику хлорамфениколу, подавляющему синтез белка у прокариотических клеток.
Так же как в случае хлоропластов мы вновь сталкиваемся с существованием особой системы синтеза белка, отличной от таковой в клетке.
Эти открытия вновь пробудили интерес к теории симбиотического происхождения хлоропластов. Идея о том, что хлоропласты возникли за счет объединения клеток-гетеротрофов с прокариотическими синезелеными водорослями, высказанная на рубеже XIX и XX вв. (А.С. Фоминцин, К.С.Мережковский) вновь находит свое подтверждение. В пользу этой теории говорит удивительное сходство в строении хлоропластов и синезеленых водорослей, сходство с основными их функциональными особенностями, и в первую очередь со способностью к фотосинтетическим процессам.
Известны многочисленные факты истинного эндосимбиоза синезеленых водорослей с клетками низших растений и простейших, где они функционируют и снабжают клетку-хозяина продуктами фотосинтеза. Оказалось, что выделенные хлоропласты могут также отбираться некоторыми клетками и использоваться ими как эндосимбионты. У многих беспозвоночных (коловратки, моллюски), питающихся высшими водорослями, которые они переваривают, интактные хлоропласты оказываются внутри клеток пищеварительных желез. Так, у некоторых растительноядных моллюсков в клетках найдены интактные хлоропласты с функционирующими фотосинтетическими системами, за активностью которых следили по включению С14О2.
Как оказалось, хлоропласты могут быть введены в цитоплазму клеток культуры фибробластов мыши путем пиноцитоза. Однако они не подвергались атаке гидролаз. Такие клетки, включившие зеленые хлоропласты, могли делиться в течение пяти генераций, а хлоропласты при этом оставались интактными и проводили фотосинтетические реакции. Были предприняты попытки культивировать хлоропласты в искусственных средах: хлоропласты могли фотосинтезировать, в них шел синтез РНК, они оставались интактными 100 ч, у них даже в течение 24 ч наблюдались деления. Но затем происходило падение активности хлоропластов, и они погибали.
Эти наблюдения и целый ряд биохимических работ показали, что те черты автономии, которыми обладают хлоропласты, еще недостаточны для длительного поддержания их функций и тем более для их воспроизведения.
В последнее время удалось полностью расшифровать всю последовательность нуклеотидов в составе циклической молекулы ДНК хлоропластов высших растений. Эта ДНК может кодировать до 120 генов, среди них: гены 4 рибосомных РНК, 20 рибосомных белков хлоропластов, гены некоторых субъединиц РНК-полимеразы хлоропластов, несколько белков I и II фотосистем, 9 из 12 субъединиц АТФ-синтетазы, части белков комплексов цепи переноса электронов, одной из субъединиц рибулозодифосфат-карбоксилазы (ключевой фермент связывания СО2), 30 молекул тРНК и еще 40 пока неизвестных белков. Интересно, что сходный набор генов в ДНК хлоропластов обнаружен у таких далеко отстоящих представителей высших растений как табак и печеночный мох.
Основная же масса белков хлоропластов контролируется ядерным геномом. Оказалось, что ряд важнейших белков, ферментов, а соответственно и метаболические процессы хлоропластов находятся под генетическим контролем ядра. Так, клеточное ядро контролирует отдельные этапы синтеза хлорофилла, каротиноидов, липидов, крахмала. Под ядерным контролем находятся многие энзимы темновой стадии фотосинтеза и другие ферменты, в том числе некоторые компоненты цепи транспорта электронов. Ядерные гены кодируют ДНК-полимеразу и аминоацил-тРНК-синтетазу хлоропластов. Под контролем ядерных генов находится большая часть рибосомных белков. Все эти данные заставляют говорить о хлоропластах, так же как и о митохондриях, как о структурах с ограниченной автономией.
Транспорт белков из цитоплазмы в пластиды происходит в принципе сходно с таковым у митохондрий. Здесь также в местах сближения внешней и внутренней мембран хлоропласта располагаются каналообразующие интегральные белки, которые узнают сигнальные последовательности хлоропластных белков, синтезированных в цитоплазме, и транспортируют их в матрикс-строму. Из стромы импортируемые белки согласно дополнительным сигнальным последовательностям могут включаться в мембраны пластиды (тилакоиды, ламеллы стромы, внешняя и внутренняя мембраны) или локализоваться в строме, входя в состав рибосом, ферментных комплексов цикла Кальвина и др.
Удивительное сходство структуры и энергетических процессов у бактерий и митохондрий, с одной стороны, и у синезеленых водорослей и хлоропластов - с другой, служит веским аргументом в пользу теории симбиотического происхождения этих органелл. Согласно этой теории, возникновение эукариотической клетки прошло через несколько этапов симбиоза с другими клетками. На первой стадии клетки типа анаэробных гетеротрофных бактерий включили в себя аэробные бактерии, превратившиеся в митохондрии. Параллельно этому в клетке-хозяине прокариотический генофор формируется в обособленное от цитоплазмы ядро. Так могли возникнуть гетеротрофные эукариотические клетки. Повторные эндосимбиотические взаимоотношения между первичными эукариотическими клетками и синезелеными водорослями привели к появлению в них структур типа хлоропластов, позволяющих клеткам осуществлять автосинтетические процессы и не зависеть от наличия органических субстратов (рис. 236). В процессе становления такой составной живой системы часть генетической информации митохондрий и пластид могла изменяться, перенестись в ядро. Так, например две трети из 60 рибосомных белков хлоропластов кодируется в ядре и синтезируются в цитоплазме, а потом встраивается в рибосомы хлоропластов, имеющие все свойства прокариотических рибосом. Такое перемещение большой части прокариотических генов в ядро привело к тому, что эти клеточные органеллы, сохранив часть былой автономии, попали под контроль клеточного ядра, определяющего в большей степени все главные клеточные функции.
Часть VI. Цитоплазма: Опорно-двигательная система (цитоскелет)
В предыдущих главах уже много и часто говорилось о движении: движутся хромосомы к полюсам клетки во время митоза, перемещаются вакуоли клеточных органелл, движется клеточная поверхность. Кроме того, в клетках растений и животных наблюдаются токи цитоплазмы (например, в растительных клетках или у амебы). Более того, отдельные клетки (свободноживущие одноклеточные организмы или специфические типы клеток в многоклеточных животных организмах) обладают способностью активно перемещаться, ползать (рис. 237). Некоторые клетки имеют специализированные структуры, реснички или жгутики, которые позволяют им или самым перемещаться, или перемещать окружающую их жидкость. Наконец, у многоклеточных животных организмов есть специализированные клетки, мышечная работа которых позволяет производить различные движения органов, отдельных его частей и всего организма. Было найдено, что в основе всех этих многочисленных двигательных реакций лежат общие молекулярные механизмы. Кроме того, было показано, что наличие каких-либо двигательных аппаратов должно сочетаться и структурно связываться с существованием опорных, каркасных или скелетных внутриклеточных образований. Поэтому можно говорить (описывать и изучать) об опорно-двигательной системе клеток.
Само понятие о цитоскелете или скелетных компонентах цитоплазмы разных клеток было высказано Н.К.Кольцовым, выдающимся русским цитологом еще в начале ХХ века. К сожалению, они были забыты и только уже в конце 50-х годов с помощью электронного микроскопа эта скелетная система было переоткрыта.
Огромный вклад в изучение цитоскелета внес метод иммунофлуоресценции, который помог разобраться в химии и динамике этого чрезвычайно важного компонента клетки. Цитоскелетные компоненты представлены нитевидными, неветвящимися белковыми комплексами или филаментами (тонкими нитями).
Существуют три системы филаментов, различающихся как по химическому составу, так и по своей ультраструктуре, так и по функциональным свойствам. Самые тонкие нити - это микрофиламенты; их диаметр составляет около 8 нм и состоят они в основном из белка актина. Другую группу нитчатых структур составляют микротрубочки, которые имеют диаметр 25 нм и состоят в основном из белка тубулина, и, наконец, промежуточные филаменты с диметром около 10 нм (промежуточный по сравнению с 6 нм и 25 нм), образующиеся из разных, но родственных белков (рис. 238, 239).
Все эти фибриллярные структуры могут участвовать в качестве составных частей в процессе физического перемещения клеточных компонентов или даже целых клеток, кроме того они же в ряде случаев выполняют сугубо каркасную скелетную роль. Элементы цитоскелета встречаются во всех без исключения эукариотических клетках; аналоги этих фибриллярных структур встречаются и у прокариот. Степень выраженности их в разных клетках может быть различной. Так, например, клетки эпидермиса кожи особенно богаты промежуточными филаментами, мышечные клетки - актиновыми микрофиламентами, особенно многих микротрубочек в пигментных клетках, меланоцитах, в отростках нервных клеток и т.д.
Общими свойствами элементов цитоскелета является то, что это белковые, неветвящиеся фибриллярные полимеры, нестабильные, способные к полимеризации и деполимеризации. Такая нестабильность может приводить к некоторым вариантам клеточной подвижности, например, к изменению формы клетки. Некоторые компоненты цитоскелета при участии специальных дополнительных белков могут стабилизироваться или образовывать сложные фибриллярные ансамбли, и играть только каркасную роль. При взаимодействии с другими специальными белками-транслокаторами (или моторными белками) они могут участвовать в разнообразных клеточных движениях.
По своим свойствам и функциям элементы цитоскелета можно разделить на две группы: только каркасные фибриллы - промежуточные филаменты, и опорно-двигательные - как, например, актиновые микрофиламенты, взаимодействующие с моторными белками - миозинами, и тубулиновые микротрубочки, взаимодействующие с моторными белками динеинами и кинезинами.
Причем во второй группе фибрилл цитоскелета (микрофиламенты и микротрубочки) могут происходить два принципиально различных способа движения. Первый из них основан на способности основного белка микрофиламентов - актина и основного белка микротрубочек - тубулина к полимеризации и деполимеризации, что может при связи этих белков с плазматической мембраной вызывать ее морфологические изменения в виде образования выростов (псевдоподий и ламеллоподий) на краю клетки. Псевдоподии и тонкие выросты (филоподии) могут или втягиваться обратно в клетку, или закрепляться на поверхности клетки и затем участвовать в перемещении клетки по субстрату.
При другом способе передвижения фибриллы актина (микрофиламенты) или тубулина (микротрубочки) являются направляющими структурами, по которым перемещаются специальные подвижные белки - моторы. Последние могут связываться с мембранными или фибриллярными компонентами клетки и тем самым участвовать в их перемещении.

Глава 20. Промежуточные филаменты
Промежуточные филаменты (ПФ) строятся из фибриллярных мономеров. Поэтому основная конструкция промежуточных филаментов напоминает канат, имеющий толщину около 8-10 нм. Они локализуются главным образом в околоядерной зоне и в пучках фибрилл, отходящих к периферии клеток и располагающихся под плазматической мембраной (рис. 238, 240, 241). Встречаются промежуточные филаменты во всех типах клеток животных, но особенно обильны в тех, которые подвержены механически воздействиям: клетки эпидермиса, нервные отростки, гладкие и исчерченные мышечные клетки. В клетках растений ПФ не обнаружены.
В состав промежуточных филаментов входит большая группа изобелков, родственных белков, которую можно разделить на четыре типа. Первый - кератины, кислые и нейтральные, встречающиеся в эпителиальных клетках; они образуют гетерополимеры из этих двух подтипов. Кератины, кроме того, имеют некоторую гетерогенность, зависящую от тканевого источника. Так, в эпителиях встречается до 20 форм кератинов, 10 форм других кератинов найдено в волосах и ногтях. Молекулярный вес кератинов колеблется от 40 до 70 тыс.
Второй тип белков ПФ включает в себя три вида белков, имеющих сходный молекулярный вес (45-53 тыс.). Это - виментин, характерный для клеток мезенхимного происхождения, входящий в состав цитоскелета клеток соединительной ткани, эндотелия, клеток крови. Десмин - характерен для мышечных клеток, как гладких, так и исчерченных. Глиальный фибриллярный белок входит в состав ПФ некоторых клеток нервной глии - в астроциты и некоторые Шванновские клетки. Периферин - входит в состав периферических и центральных нейронов.
Третий тип - белки нейрофиламентов (мол. вес от 60 до 130 тыс.) встречается в аксонах нервных клеток.
И наконец, четвертый тип - белки ядерной ламины. Хотя эти последние имеют ядерную локализацию, они сходны по строению и свойствам со всеми белками промежуточных филаментов.
Как уже говорилось, промежуточные филаменты, построены из фибриллярных белков наподобие каната. При этом некоторые белки могут образовывать сополимеры, например виментин с десмином, или виментин с глиальными белками.
Все белки промежуточных филаментов обладают сходной аминокислотной последовательностью из 130 остатков в центральной части фибриллярной молекулы, которая обладает ?-спиральным строением. Концевые же участки молекул имеют разные последовательности аминокислот, разную длину, и не имеют ?-спирального строения. Наличие протяженных ?-спиральных участков позволяет двум молекулам образовывать двойную спираль, подобно тому, что приводит к образованию палочковидного димера, длиной около 48 нм. Два димера, объединяясь бок о бок, образуют короткий протофиламент, тетрамер, толщиной около 3 нм. Такие протофиламенты могут объединяться в более толстые и длинные фибриллы и в конечном итоге в промежуточный полный филамент, состоящий из 8 продольных протофиламентов (рис. 242).
Иначе полимеризуются белки ядерной ламины: они образуют димеры с головками на одном конце и полимеризуются, образую рыхлую прямоугольную решетку. Такие слои ламины быстро разрушаются во время митоза при фосфорилировании ламинов.
Цитоплазматические промежуточные филаменты относятся к самым стабильным и долгоживущим элементам цитоскелета. Однако in vivo наблюдается включение инъецированных меченых молекул кератина в состав ПФ эпителиальных клеток. ПФ устойчивы к действию солей низкой и высокой концентрации, разрушаются только после воздействия денатурирующих растворов, таких как мочевина.
Такая структура и химическая устойчивость промежуточных филаментов, вероятно, определяет и их физическую устойчивость. Они служат как бы истинно опорной системой в клетках подвергающихся значительным физическим нагрузкам. В клетках кожного эпидермиса промежуточные филаменты образуют пучки (тонофиламенты), связанные с десмосомами, и создают жесткую внутриклеточную сеть (рис. 243). Так, в нервных аксонах, простирающихся на многие десятки сантиметров, ПФ или нейрофиламенты создают жесткую основу, обеспечивающую гибкость и целостность тонких цитоплазматических отростков нервных клеток. В поперечно исчерченных мышечных клеток десминовые филаменты входят в состав z-дисков и связывают их друг с другом как в составе саркомера, так и в соседних миофибриллах, а также с плазматической мембраной.
Специфических ингибиторов полимеризации белков промежуточных филаментов пока еще не найдено. Поэтому остается неясным сам процесс сборки и разборки этих элементов цитоскелета в живой клетке. Вероятнее всего, что они подобно ламинам деполимеризуются при действии цитоплазматических киназ, приводящих к их фосфорилированию. Выделенные промежуточные филаменты под действием фосфорилаз могут распадаться на мономеры, деполимеризоваться.
Топографически в клетке расположение промежуточных филаментов повторяет расположение микротрубочек, они как бы идут бок о бок. При разрушении микротрубочек колхицином, происходит т.н. колапс промежуточных филаментов: они собираются в плотные пучки или кольца вокруг ядра. Восстановление новой сети промежуточных филаментов начинается от зоны клеточного центра. Это наводит на мысль, что центром их полимеризации или нуклеации могут быть центры, общие с микротрубочками.
Глава 21.Микрофиламенты
Общие свойства микрофиламентов.

Микрофиламенты встречаются во всех клетках эукариот. Особенно они обильны в мышечных волокнах и клетках - высокоспециализированных клетках, выполняющих функции сокращения мышц. Микрофиламенты (МФ) входят также в состав специальных клеточных компонентов, таких как микроворсинки, ленточные соединения эпителиальных клеток, в состав стереоцилий чувствительных клеток. МФ образуют пучки в цитоплазме подвижных клеток животных, и образуют слой под плазматической мембраной - кортикальный слой (рис. 244а, 245). У многих растительных клеток и клеток низших грибов они располагаются в слоях движущейся цитоплазмы.
Основным белком микрофиламентов является актин. Актин - неоднородный белок, в различных клетках могут быть разные его варианты или изоформы, каждая из которых кодируется своим геном. Так, у млекопитающих есть 6 различных актинов: один в скелетных мышцах, один в сердечной мышце, два типа - в гладких мышцах (один из них в сосудах), и два, немышечных, цитоплазматических актина, являющихся универсальным компонентом любых клеток млекопитающих. Все эти изоформы актина очень сходны по аминокислотным последовательностям, вариантными в них являются концевые участки, которые определяют скорость полимеризации, но не влияют на сокращение. Такое сходство актинов, несмотря на некоторые отличия, определяет их общие свойства. Актин имеет молекулярный вес около 42 тыс. и в мономерной форме имеет вид глобулы (G-актин), содержащей в своем составе молекулу АТФ. При его полимеризации образуется тонкая фибрилла (F-актин) толщиной 8 нм, представляющая собой пологую спиральную ленту (рис. 246). Актиновые микрофиламенты полярны по своим свойствам. При достаточной концентрации G-актин начинает самопроизвольно полимеризоваться. При такой спонтанной полимеризации актина на образовавшейся нити микрофиламента один из ее концов быстро связывается с G-актином (+)- конец микрофиламента) и поэтому растет быстрее, чем противоположный (минус-конец). Если концентрация G-актина будет недостаточной, то образовавшиеся фибриллы F-актина начинают разбираться. В растворах, содержащих т.н. критическую концентрацию G-актина, будет устанавливаться динамическое равновесие между полимеризацией и деполимеризацией, в результате чего фибрилла F-актина будет иметь постоянную длину (рис. 247). Из этого следует, что актиновые микрофиламенты представляют собой очень динамичные структуры, которые могут возникать и расти или же, наоборот, разбираться и исчезать в зависимости от наличия глобулярного актина. На растущем конце нити актина встраиваются мономеры, содержащие АТФ. По мере нарастания полимера происходит гидролиз АТФ, и мономеры остаются связанными с АДФ. Молекулы актина, связанные с АТФ, прочнее взаимодействуют друг с другом, чем мономеры, связанные с АДФ.
В клетках такая, казалось бы, неустойчивая фибриллярная система, стабилизируется массой специфических белков, ассоциирующих с F-актином. Так, белок тропомиозин, взаимодействуя с микрофиламентами, придает им необходимую жесткость. Целый ряд белков, например филамин и ?-актинин образуют поперечные скрепки между нитями F-актина, что приводит к образованию сложной трехмерной сети, придающей гелеобразное состояние цитоплазме. Другие дополнительные белки могут связывать филаменты в пучки (фимбрин) и т.д. Кроме того, существуют белки, взаимодействующие с концами микрофиламентов и предотвращая их разборку, стабилизируют их. Взаимодействие F-актина со всей этой группой белков регулирует агрегатное состояние микрофиламентов, их рыхлое или наоборот тесное расположение, связь их с другими компонентами. Особую роль при взаимодействии с актином играют белки миозинового типа, которые образуют вместе с актином комплекс, способный к сокращению при расщеплении АТФ (см. ниже) (рис. 262).
Таким образом, МФ представляют собой фибриллы полимеризованного актина, связанного с многими другими белками. В принципе микрофиламенты во всех немышечных клетках могут осуществлять по крайней мере два ряда функций: быть частью сократительного аппарата, взаимодействуя с моторными белками (миозин), или участвовать в формировании скелетных структур, способных к собственному движению за счет процессов полимеризации и деполимеризации актина.
Особенно много сведений о цитоскелете, и о микрофиламентах получено при изучении фибробластов в культуре ткани, обладающих способностью к амебоидному движению. Эти клетки не имеют ответственных за движение постоянных фибриллярных структур, их фибриллярный аппарат все время находится в реорганизации: часть фибриллярных элементов разбирается в одних участках клетки и новообразуется в других.
Обычно ползущий по поверхности субстрата фибробласт поляризован: у него есть движущийся конец и "хвостовой" отдел. (рис. 248, 249 ) На движущемся конце, который часто более распластан по субстрату, чем боковые и хвостовые участки фибробласта, постоянно возникают и убираются тонкие нитевидные или пластинчатые выросты - ламеллоподии. Это - ведущий край клетки (ламеллоплазма). Который и обеспечивает движение фибробласта вперед. В таком движущемся фибробласте с помощью антител можно узнать места расположения актина. Он будет распределяться по трем основным частям клетки: он в виде тонкого слоя (1) располагается по всему периметру клетки под плазматической мембраной. Это кортикальный (cortex - кора) слой. Обильно актин выявляется в выростах цитоплазмы ведущего края клетки (2) и (3) в пучках актиновых филаментов, отходящих от ведущего края вглубь клетки (рис. 245).
Кортикальный слой состоит из плотной трехмерной сети актиновых филаментов, ассоциированных с плазматической мембраной (таб. ). Он обеспечивает механическую устойчивость поверхностному слою цитоплазмы и создает условия, позволяющие клетке изменять свою форму и двигаться. Этот слой постоянно меняет свое агрегатное состояние, переходя из состояния структурированного геля в жидкий золь. Такие переходы гель-золь связаны с изменениями в структуре кортикального слоя. Здесь в ассоциации с актиновыми филаментами находятся фибриллярные белки-стабилизаторы (например, филамин), которые образуют сшивки в местах пересечения филаментов, что придает жесткость всему кортикальному слою. Однако эта жесткость может быть легко снята за счет взаимодействия с другими белками, такими как гельзолин, которые вызывают фрагментацию и разборку филаментов и тем разжижают гель. Такая перестройка подмембранного слоя особенно выражена в ведущем крае, что позволяет быстро менять форму его поверхности, образовывать ламеллоподии и двигаться вперед. С другой стороны сеть актиновых филаментов способна к сокращению, т.к. в ней обнаружены короткие миозиновые агрегаты. Это приводит или к втягиванию ламеллоподий или же к подтаскиванию клеток вперед. Сеть актиновых филаментов в ведущем крае организована более определенно, чем в остальном кортексе. Здесь от небольших начальных выростов плазмалеммы внутрь клетки отходят пучки актиновых филаментов, оканчивающихся своими (+)-концами на плазматической мембране.
Сам процесс образования актиновых филаментов и их роста в зоне ламеллоплазмы зависит от ряда регуляторных белков. Один из них белок WASp/Scar связывается с плазматической мембраной. В его составе есть участки, связывающиеся с актином, другой специальный белковый комплекс Arp2/3, который связывается с (-)-концом растущей цепи полимера, препятствуя его деполимеризации. Такие сложные взаимодействия двух групп регуляторных белков приводят к тому, что на границе с плазматической мембраной происходит надстраивание растущих филаментов, которые могут прогибать плазматическую мембрану так, что возникает тонкий вырост - филоподия (рис. 250).
Иначе происходит полимеризация актина при образовании ламеллоподий. Здесь также ведущую роль играют белки WASp/Scar, которые закрепляются на плазматической мембране и связываются с комплексом Arp2/3и прикрепляют его к боковой поверхности уже готовой актиновой фибриллы. Комплекс Arp2/3 инициирует полимеризацию новой актиновой фибриллы, которая начинает расти под углом около 700 по отношению к первичной нити актина и закрепляется на плазматической мембране. Таких новых белковых цепей возникает несколько, и они как бы веером простираются к плазматической мембране и толкают ее вперед. Так образуется псевдоподия или ламеллоподия (рис. 251) За счет наращивания актиновых филаментов на (+) концах. Одновременно с этим происходит деполимеризация тех (-) концов филаментов, которые не заблокированы комплексами Arp2/3 и подвергаются воздействию белков, способствующих деполимеризации МФ.
Таким образом сложный процесс роста МФ приводит к перемещению в пространстве края движущейся клетки. По мере возникновения ламеллоподий их плазматическая мембрана с помощью белков интегринов образует с субстратом фокальные контакты, от которых отходят пучки актиновых филаментов, участвующие уже в другой форме подвижности, связанной со взаимодействиями между актиновыми филаментами и моторными белками-миозинами.
Миозины являются одним из составных компонентов МФ. Основная работа по перемещению клеток или их внутренних компонентов с помощью МФ происходит за счет работы акто-миозинового комплекса, где актиновые фибриллы играют роль направляющих ("рельсы"), а миозины - транслокаторы. Весь акто-миозиновый комплекс представляет собой АТФ-азу, и движение происходит за счет энергии гидролиза АТФ.
Миозины представляют собой семейство сходных белков. У всех из них есть головная (моторная ) часть, отвечающая за АТФ-азную активность комплекса, шейка, которая связана с несколькими регуляторными белковыми субъединицами и хвост, характерный для каждого типа миозина, определяющего специфичность функции в клетке. Существуют три основных типа миозинов. Миозин II и миозин V являются димерами, у которых ?-спиральный участок хвоста образует сверхспиральный палочковидный участок. Миозин I представляет собой мономерную молекулу (рис. 252). Две молекулы миозина II могут ассоциировать друг с другом, образуя биполярную толстую фибриллу, участвующую в мышечном сокращении, при сокращении внутриклеточных пучков МФ и при делении клетки. Миозины I и V типа участвуют во взаимодействиях между элементами цитоскелета и мембранами, например в транспорте везикул.
Механизмы работы актомиозиновых комплексов очень сходен, независимо от типа миозина: он начинается со связи миозиновой головки с актиновым филаментом, ее изгибанием и последующим откреплением. За каждый цикл миозиновая головка перемещается в направлении (+)-конца актинового филамента на 5-25 нм при гидролизе одной молекулы АТФ. Таким образом происходит однонаправленное смещение или скольжение МФ относительно молекул миозина (рис. 253).
Акто-миозиновые комплексы немышечных клеток
Акто-миозиновые комплексы участвуют в движении ламеллоплазмы. Так молекулы миозина I были выявлены на ведущем краю движущихся амебных форм диктиостелиума, в то время как миозин II типа обнаруживался в теле и конце клетки. Миозин I типа участвует в движении микроворсинок энтероцитов. Микроворсинки представляют собой тонкие (0,1 мкм) и длинные (около 1 мкм) выросты, тесно расположенные друг около друга, наподобие густой щетки, покрывающей всю поверхность клетки, смотрящую в просвет кишечника. На каждой клетки кишечного эпителия насчитывается несколько тысяч микроворсинок, которые увеличивают всасывающую поверхность в десятки раз (рис. ). Внутри каждой микроворсинки располагается плотный пучок из 20-30 актиновых микрофиламентов. Актиновые нити закреплены своими (+)-концами в вершине микроворсинки. Жесткость всего пучка определяется рядом белков, связывающих актин поперечными связками, фимбрином и фасцином (рис. 254). Нижняя часть актинового пучка вплетена в сеть из молекул спектрина, примембранного белка. Такая фибриллярная арматура делает тонкие микроворсинки жесткими и прочными. В этом проявляется каркасная, скелетная роль микрофиламентов. Но оказалось, что в составе микроворсинок обнаруживается также миозин, относящийся к миозину I, содержащему только одну головку и короткий хвост, которым он связан с плазматической мембраной. Головки миозина I связываются с актиновыми филаментами и могут вызывать укорачивание или удлинение микроворсинок по принципу скользящих нитей.
Миозин I также вовлекается в транспорт вакуолей. Например, в клетках кишечного эпителия миозин I связан с некоторыми везикулами аппарата Гольджи. С везикулами аппарата Гольджи в клетках мозга позвоночных связан миозин V типа.
Наиболее широко представлен в актомиозиновых комплексах миозин II типа. Так он входит в состав пучков МФ как в ведущем крае фибробластов, так и в пучках МФ в теле клетки. Считается, что сокращение этих комплексов приводит к подтягиванию клетки вперед (рис. 255). Актиновые пучки в комплексе с миозином II особенно хорошо выявляются в остановившихся фибробластах, где они исполняют совсем другую роль. Эти фибриллярные пучки (они носят название напряженных нитей или стресс-фибрилл) тоже содержат все компоненты мышечных тканей (рис. 256, 257). Они крепятся с помощью фокальных контактов на плазматической мембране и при сокращении их вызывают вне клетки натяжение на фибриллах матрикса (коллагеновые волокна), что, вероятно, способствует ориентированной полимеризации компонентов внеклеточного матрикса. Это доказывается тем, что если фибробласты посадить на тонкие пленочные подложки, то после образования стресс-фибрилл пленка около клеток начинает морщиться, собираться в складки.
Другие примеры связи актиновых микрофиламентов с плазматической мембраной были приведены при описании клеточных контактов, таких как адгезионный поясок в клетках кишечного эпителия и фокальный контакт фибробластов. Адгезивный поясок контактирует с циркулярным пучком микрофиламентов, в составе которых кроме актина есть и миозиновые молекулы. При акте сокращения этот циркулярный периферический пучок может сжимать клетку, изменять её форму.
Во время митоза в нормальных условиях клетки животных делятся путем образования перетяжки или борозды деления. Это происходит вследствие того, что в делящейся клетке в её кортикальном слое образуется скопление паралелльно идущих актиновых фибрилл, образующих под плазмалеммой сократимое кольцо. В состав кольца кроме актина входит миозин II и другие мышечные белки; сокращение кольца приводит к возникновению перетяжки на исходной клетке , что в конце концов приводит к делению клетки надвое (рис. 258).
Цитохалазин - ингибитор полимеризации актина вызывает деполимеризацию актина в сократимом кольце, цитотомии не происходит, и в результате возникает двуядерная клетка, т.к. при этом расхождение хромосом не нарушается.
Актиновые микрофиламены являются одним из динамичных элементов цитоскелета, который подвержен быстрым перестройкам, особенно в движущихся клетках.
Мышечные клетки
Специализированные мышечные клетки многоклеточных животных организмов имеют в цитоплазме сократимые фибриллы, миофибриллы. Особенно много миофибрилл в скелетных мышечных клетках и клетках сердечной мышцы, в гладкомышечных клетках. Скелетные мышцы состоят не из отдельных клеток, а из мышечных волокон, симпластов, образовавшихся за счет слияния мышечных клеток - миобластов. В скелетной и сердечной мускулатуре миофибриллы имеют характерную особенность - они выглядят исчерченными или поперечнополосатыми (отсюда и название - поперечнополосатая мышечная ткань) (рис. 259, 260). В световой микроскоп видно, что пучки миофибрилл окрашиваются неравномерно: через равные промежутки длины в них видно чередование темных и светлых участков. Темные участки называются анизотропными дисками (А-дисками), а светлые - изотропные (I-диски). Светлый I-диск пересекается полоской z. Таким образом, миофибрилла представляет собой нить (толщиной 1-2 мкм) с чередующимися участками:
А + 1\2 I+ z+ 1\2 I + А + 1\2 I.... и т.д.
Оказалось, что единицей строения и функционирования является саркомер - участок между двумя Z- дисками. Величина саркомеров в расслабленном состоянии всегда одинакова (1,8-2,8 мкм в зависимости от вида животных). Подробности строения саркомера были получены только при изучении миофибрилл в электронном микроскопе. Оказалось, что миофибрилла подразделяется на ряд более тонких - протофибрилл. Их диаметр в разных частях саркомера различный. В I-дисках встречаются тонкие (около 8 нм) нити длиной около 1 мкм, а в А-дисках кроме тонких присутствуют толстые (около 16 нм толщиной) нити длиной до 1,5 мкм. Все эти нити, протофибриллы, располагаются паралелльно друг другу и в друг друга не переходят. Если рассматривать строение саркомера более подробно, то видно, что вдоль него располагаются три участка протофибрилл: тонкие, связанные с z-диском, затем толстые и снова тонкие, связанные со следующим Z -диском (рис. ). В зоне А-дисков кроме толстых фибрилл располагаются концы тонких, идущих от двух Z -дисков.
Была выяснена химическая природа всех компонентов миофибрилл. Оказалось, что тонкие нити состоят в основном из белка актина, а толстые - из белка миозина II. Z -диски имеют в своем составе белок ?- актинин и десмин. В тонких нитях кроме актина находятся белки тропомиозин и тропонин.
Миозин, входящий в состав толстых нитей, - очень крупный белок (мол. вес 500 тыс.), состоящий из шести цепей: двух длинных, спирально обвивающихся одна вокруг другой (тяжелые цепи), и четырех коротких (легкие цепи), которые связываются с глобулярными головками длинных цепей. Последние обладают АТФ-азной активностью, могут реагировать с фибриллярным актином, образуя актомиозиновый комплекс, способный к сокращению. Толщина миозиновых фибрилл связана с тем, что длинные (150 нм) молекулы миозина агрегируют так, что образуют пучки, в которые входит около 300 таких молекул. В миозиновых толстых (16 нм) протофибриллах длинные молекулы лежат "хвост к хвосту" так, что головки миозина располагаются на концах таких нитей, в средней их части головок нет (рис. 261). Головки образуют поперечные мостики, связывающие между собой актиновые и миозиновые нити.
За счет такой связи головок миозина с актином возникают актомиозиновые комплексы, активность которых в сотни раз выше, чем АТФ-азная активность одних миозинов.
Актиновые протофибриллы связаны на одном конце с Z -диском, который состоит из палочковидных, биполярных молекул белка ?-актинина, который связывает актиновые фибриллы в пучки. С двух сторон к Z-диску прикрепляются (+)-концы актиновых нитей соседних саркомеров. Функция Z-дисков заключается как бы в связывании соседних саркомеров друг с другом; Z -диски не являются сократимыми структурами.
Толстые, миозиновые, протофиламенты также связаны с Z-диском: концы толстых протофиламентов также заякорены в Z-диске с помощью длинных и гибких фибриллярных белков - титинов. Миозиновые нити в поперечнике миофибриллы располагаются в гексагональном порядке, так, что каждая миозиновая нить окружается шестью актиновыми нитями (рис. 262). Вообще говоря, в мыщце нет сокращающихся, уменьшающих свою длину молекул. Сокращение происходит за счет уменьшения расстояния между Z-дисками, т.е. за счет уменьшения длины саркомеров примерно на 20%. Механизм мышечного сокращения заключается в кооперативном укорачивании всех саркомеров по всей длине миофибриллы. Г.Хаксли показал, что в основе сокращения лежит перемещение относительно друг друга тонких и толстых нитей. При этом толстые миозиновые нити как бы входят в пространства между актиновыми нитями, приближая друг к другу Z-диски. Эта модель скользящих нитей может объяснить не только сокращение поперечнополосатых мышц, но и любых сократимых структур (рис. 263).
В гладких мышечных клетках также имеются актиновые и миозиновые нити, но они не так правильно расположены, как в исчерченных мышцах. Здесь нет саркомеров, а среди пучков актиновых протофибрилл без особого порядка располагаются миозиновые молекулы, которые не образуют толстых агрегатов как в случае соматических мышц, а представляют собой комплексы из 15-20 миозиновых молекул (рис. 264).
Глава 21. Микротрубочки
Общая характеристика мкротрубочек
Одним из обязательных компонентов цитоскелета эукариот являются микротрубочки (рис. 265). Это нитчатые неветвящиеся структуры, толщиной 25 нм, состоящие из белков-тубулинов и ассоциированных с ними белков. Тубулины микротрубочек при полимеризации образуют полые трубки, откуда и их название. Длина их может достигать нескольких мкм; самые длинные микротрубочки встречаются в составе аксонемы хвостов спермиев.
Микротрубочки встречаются в цитоплазме интерфазных клеток, где они располагаются поодиночке или небольшими рыхлыми пучками, или в виде плотноупакованных микротрубочек в составе центриолей, базальных телец и в ресничках и жгутиках. При делении клеток большая часть микротрубочек клетки входит в состав веретена деления.
В морфологическом отношении микротрубочки представляют собой длинные полые цилиндры с внешним диаметром 25 нм (рис. 266). Стенка микротрубочек состоит из полимеризованных молекул белка тубулина. При полимеризации молекулы тубулина образуют 13 продольных протофиламентов, которые скручиваются в полую трубку (рис. 267). Размер мономера тубулина составляет около 5 нм, равного толщине стенки микротрубочки, в поперечном сечении которой видны 13 глобулярных молекул.
Молекула тубулина представляет собой гетеродимер, состоящий из двух разных субъедниц, из ?-тубулина и ?- тубулина, которые при ассоциации образуют собственно белок тубулин, изначально поляризованный. Обе убъединицы мономера тубулина связаны с ГТФ, однако на ?-субъдинице ГТФ не подвергается гидролизу, в отличие от ГТФ на ?-субъединице, где при полимеризации происходит гидролиз ГТФ до ГДФ. При полимеризации молекулы тубулина объединяются таким образом, что с ?-субъединицей одного белка ассоциирует ?-субъединица следующего белка и т.д. Следовательно, отдельные протофибриллы возникают как полярные нити, и соответственно вся микротрубочка тоже является полярной структурой, имеющей быстро растущий (+)-конец и медленно растущий (-) конец (рис. 268).
При достаточной концентрации белка полимеризация происходит спонтанно. Но при спонтанной полимеризации тубулинов происходит гидролиз одной молекулы ГТФ, связанной с ?-тубулином. Во время наращивания длины микротрубочки связывание тубулинов происходит с большей скоростью на растущем (+)-конце. Но при недостаточной концентрации тубулина микротрубочки могут разбираться с обоих концов. Разборке микротрубочек способствует понижение температуры и наличие ионов Са ++.
Существует ряд веществ, которые влияю на полимеризацию тубулина. Так, алкалоид колхицин, содержащийся в безвременнике осеннем (Colchicum autumnale) , связывается с отдельными молекулами тубулина и предотвращает их полимеризацию. Это приводит к падению концентрации свободного тубулина, способного к полимеризации, что вызывает быструю разборку цитоплазматических микротрубочек и микротрубочек веретена деления. Таким же действие обладают колцемид и нокодозол, при отмывании которых происходит полное восстановление микротрубочек.
Стабилизирующим действие на микротрубочки обладает таксол, который способствует полимеризации тубулина даже при его низких концентрациях.
Все это показывает, что микротрубочки являются очень динамичными структурами, которые могут достаточно быстро возникать и разбираться.
В составе выделенных микротрубочек обнаруживаются ассоциированные с ними дополнительные белки, т.н. МАР-белки (МАР- microtubule accessory proteins). Эти белки, стабилизируя микротрубочки, ускоряют процесс полимеризации тубулина (рис. 269).
В последнее время процесс сборки и разборки микротрубочек стали наблюдать в живых клетках. После введения в клетку меченых флуорохромами антител к тубулину и при использовании электронных систем усиления сигнала в световом микроскопе, можно видеть, что в живой клетке микротрубочки растут, укорачиваются, исчезают, т.е. постоянно находятся в динамической нестабильности. Оказалось, что среднее время полужизни цитоплазматических микротрубочек составляет всего лишь 5 минут. Так за 15 минут около 80% всей популяции микротрубочек обновляется. При этом отдельные микротрубочки могут на растущем конце медленно (4-7 мкм\мин) удлиняться, а затем достаточно быстро (14-17 мкм\мин) укорачиваться. В живых клетках микротрубочки в составе веретена деления имеют время жизни около 15-20 сек. Считается, что динамическая нестабильность цитоплазматических микротрубочек связана с задержкой гидролиза ГТФ, это приводит к тому, что на (+)-конце микротрубочки образуется зона, содержащая негидролизованные нуклеотиды ("ГТФ-колпачок"). В этой зоне молекулы тубулина связываются с большим сродством друг к другу, и, следовательно, скорость роста микротрубочки возрастает. Наоборот, при потере этого участка, микротрубочки начинают укорачиваться.
Однако 10-20% микротрубочек остаются относительно стабильными достаточно долгое время (до нескольких часов). Такая стабилизация наблюдается в большой степени в дифференцированных клетках. Стабилизация микротрубочек связана или с модификацией тубулинов или с их связыванием с дополнительными (МАР) белками микротрубочек и с другими клеточными компонентами.
Ацетилирование лизина в составе тубулинов значительно увеличивает стабильность микротрубочек. Другим примером модификации тубулинов может быть удаление терминального тирозина, что также характерно для стабильных микротрубочек. Эти модификации обратимы.
Сами микротрубочки не способны к сокращению, однако они являются обязательными компонентами многих движущихся клеточных структур, таких как реснички и жгутики, как веретено клетки во время митоза, как микротрубочки цитоплазмы, которые обязательны для целого ряда внутриклеточных транспортов, таких как экзоцитоз, движение митохондрий и др.
В целом же роль цитоплазматических микротрубочек может быть сведена к двум функциям: скелетной и двигательной. Скелетная, каркасная, роль заключается в том, что расположение микротрубочек в цитоплазме стабилизирует форму клетки; при растворении микротрубочек клетки, имевшие сложную форму, стремятся приобрести форму шара. Двигательная роль микротрубочек заключается не только в том, что они создают упорядоченную, векторную, систему движения. Микротрубочки цитоплазмы в ассоциации со специфическими ассоциированными моторными белками образуют АТФ-азные комплексы, способные приводить в движение клеточные компоненты.
Практически во всех эукариотических клетках в гиалоплазме можно видеть длинные неветвящиеся микротрубочки. В больших количествах они обнаруживаются в цитоплазматических отростках нервных клеток, в отростках меланоцитов, амеб и других изменяющих свою форму клетках (рис. 270). Они могут быть выделены сами или же можно выделить их образующие белки: это те же тубулины со всеми их свойствами.
Центры организации микротрубочек.
Рост микротрубочек цитоплазмы происходит полярно: наращивается (+)-конец микротрубочки. Так как время жизни микротрубочек очень коротко, то должно постоянно происходить образование новых микротрубочек. Процесс начала полимеризации тубулинов, нуклеация, происходит в четко ограниченных участках клетки, в т.н. центрах организации микротрубочек (ЦОМТ). В зонах ЦОМТ происходит закладка коротких микротрубочек, обращенных своими (-)-концами к ЦОМТ. Считается, что в зонах ЦОМТ (--)-концы заблокированы специальными белками, предотвращающими или ограничивающими деполимеризацию тубулинов. Поэтому при достаточном количестве свободного тубулина будет происходить наращивание длины микротрубочек, отходящих от ЦОМТ. В качестве ЦОМТ в клетках животных участвуют главным образом клеточные центры, содержащие центриоли, о чем будет сказано позже. Кроме того в качестве ЦОМТ может служить ядерная зона, и во время митоза полюса веретена деления.
Наличие центров организации микротрубочек доказывается прямыми экспериментами. Так, если в живых клетках полностью деполимеризовать микротрубочки или с помощью колцемида или путем охлаждения клеток, то после снятия воздействия первые признаки появления микротрубочек будут появляться в виде радиально расходящихся лучей, отходящих от одного места (цитастер). Обычно у клеток животного происхождения цитастер возникает в зоне клеточного центра. После такой первичной нуклеации микротрубочки начинают отрастать от ЦОМТ и заполнять всю цитоплазму. Следовательно, растущие периферические концы микротрубочек будут всегда (+)-концами, а (-)-концы будут располагаться в зоне ЦОМТ (рис. 271, 272).
Цитоплазматические микротрубочки возникают и расходятся от одного клеточного центра, с которым многие теряют связь, могут быстро разбираться, или, наоборот, могут стабилизироваться при ассоциации с дополнительными белками.
Одно из функциональных назначений микротрубочек цитоплазмы заключается в создании эластичного, но одновременно устойчивого внутриклеточного скелета, необходимого для поддержания формы клетки. Найдено, что у дисковидных по форме эритроцитов амфибий по периферии клетки лежит жгут циркулярно уложенных микротрубочек; пучки микротрубочек характерны для различных выростов цитоплазмы (аксоподии простейших, аксоны нервных клеток и т.д.).
Действие колхицина, вызывающего деполимеризацию тубулинов, сильно меняет форму клетки. Так, если отросчатую и плоскую клетку в культуре фибробластов обработать колхицином, то она теряет полярность. Точно таким же образом ведут себя другие клетки: колхицин прекращает рост клеток хрусталика, отростков нервных клеток, образование мышечных трубок и т.д. Так как при этом не исчезают элементарные формы присущего клеткам движения, такие, как пиноцитоз, ундулирующие движения мембран, образование мелких псевдоподий, то, роль микротрубочек заключается в образовании каркаса для поддержания клеточного тела, для стабилизации и укрепления клеточных выростов. Кроме того, микротрубочки участвуют в процессах роста клеток. Так, у растений в процессе растяжения клеток, когда за счет увеличения центральной вакуоли происходит значительный рост объема клеток, большие количества микротрубочек появляются в периферических слоях цитоплазмы. В этом случае микротрубочки, так же как и растущая в это время клеточная стенка, как бы армируют, механически укрепляют цитоплазму.
Создавая такой внутриклеточный скелет, микротрубочки могут быть факторами ориентированного движения внутриклеточных компонентов, задавать своим расположением пространства для направленных потоков разных веществ и для перемещения крупных структур. Так, в случае меланофоров (клетки, содержащие пигмент меланин) рыб при росте клеточных отростков гранулы пигмента передвигаются вдоль пучков микротрубочек. Разрушение микротрубочек колхицином приводит к нарушению транспорта веществ в аксонах нервных клеток, к прекращению экзоцитоза и блокаде секреции. При разрушении микротрубочек цитоплазмы происходит фрагментация и разбегание по цитоплазме аппарата Гольджи, разрушение митохондриального ретикулума.
Долгое время считалось, что участие микротрубочек в движении цитоплазматических компонентов заключается лишь в том, что они создают систему упорядоченного движения. Иногда в популярной литературе цитоплазматические микротрубочки сравнивают с железнодорожными рельсами, без которых движение поездов невозможно, но которые сами по себе ничего не двигают. Одно время предполагали, что двигателем, локомотивом, может быть система актиновых филаментов, но оказалось, что механизм внутриклеточного перемещения различных мембранных и немембранных компонентов связан с группой иных белков.
Прогресс был достигнут при изучении т.н. аксонального транспорта в гигантских нейронах кальмара. Аксоны, отростки нервных клеток, могут иметь большую длину и заполнены большим числом микротрубочек и нейрофиламентов. В аксонах живых нервных клеток можно наблюдать перемещение различных мелких вакуолей и гранул, которые двигаются как от тела клетки к нервному окончанию (антероградный транспорт), так и в противоположном направлении (ретроградный транспорт). Если аксон перетянуть тонкой лигатурой, то такой транспорт приведет к скоплению мелких вакуолей по обе стороны от перетяжки. Вакуоли, двигающиеся антероградно, содержат различные медиаторы, в том же направлении могут двигаться и митохондрии. Ретроградно двигаются вакуоли, образовавшиеся в результате эндоцитоза при рециклировании мембранных участков. Эти движения происходят с относительно высокой скоростью: от тела нейрона - 400 мм в сутки, в направлении к нейрону -200-300 мм в сутки (рис. 273).
Оказалось, что из отрезка гигантского аксона кальмара можно выделить аксоплазму, содержимое аксона. В капле выделенной аксоплазмы продолжается движение мелких вакуолей и гранул. С помощью видеоконтрастного устройства можно видеть, что движение мелких пузырьков происходит вдоль тонких нитчатых структур, вдоль микротрубочек. Из этих препаратов были выделены белки, ответственные за движение вакуолей. Один из них кинезин, белок с молекулярным весом около 300 тыс. Он состоит из двух сходных тяжелых полипептидных цепей и нескольких легких. Каждая тяжелая цепь образует глобулярную головку, которая при ассоциации с микротрубочкой обладает АТФ-азной активностью, в то время как легкие цепи связываются с мембраной пузырьков или других частиц (рис. 274). При гидролизе АТФ изменяется конформация молекулы кинезина и генерируется перемещение частицы в направлении к (+)-концу микротрубочки. Оказалось возможным приклеить, иммобилизовать молекулы кинезина на поверхности стекла; если к такому препарату в присутствии АТФ добавить свободные микротрубочки, то последние начинают двигаться. Наоборот, можно иммобилизовать микротрубочки, но добавить к ним мембранные пузырьки, связанные с кинезином - пузырьки начинают двигаться вдоль микротрубочек.
Существует целое семейство кинезинов, обладающих сходными моторными головками, но отличающихся хвостовыми доменами. Так, цитозольные кинезины участвуют в транспорте по микротрубочкам везикул, лизосом и других мембраных органелл. Многие из кинезинов связываются специфически со своими грузами. Так некоторые участвуют в переносе только митохондрий, другие - только синаптических пузырьков. Кинезины связываются с мембранами через мембранные белковые комплексы - кинектины. Кинезины веретена деления участвуют в образовании этой структуры и в расхождении хромосом.
За ретроградный транспорт в аксоне отвечает другой белок - цитоплазматический динеин (рис. 275).
Он состоит из двух тяжелых цепей - головок, взаимодействующих с микротрубочками, нескольких промежуточных и легких цепей, которые связываются с мембранными вакуолями. Цитоплазматический динеин является моторным белком, переносящим грузы к минус-концу микротрубочек. Динеины также делятся на два класса: цитозольные - участвующие в переносе вакуолей и хромосом, и аксонемные - отвечающие за движение ресничек и жгутиков.
Цитоплазматические динеины и кинезины были обнаружены практически во всех типах клеток животных и растений.
Таким образом, и в цитоплазме движение осуществляется по принципу скользящих нитей, только вдоль микротрубочек перемещаются не нити, а короткие молекулы - движетели, связанные с перемещающимися клеточными компонентами. Сходство с актомиозиновым комплексом этой системы внутриклеточного транспорта заключается в том, что образуется двойной комплекс (микротрубочка + движетель), обладающий высокой АТФ-азной активностью.
Как мы видим, микротрубочки образуют в клетке радиально расходящиеся поляризованные фибриллы, (+)-концы которых направлены от центра клетки к периферии. Наличие же (+) и (-)-направленных моторные белков (кинезинов и динеинов) создает возможность для переноса в клетке её компонентов как от периферии к центру (эндоцитозные вакуоли, рециклизация вакуолей ЭР и аппарата Гольджи и др), так и от центра к периферии (вакуоли ЭР, лизосомы, секреторные вакуоли и др) (рис. 276). Такая полярность транспорта создается за счет организации системы микротрубочек, возникающих в центрах их организации, в клеточном центре.
Глава 23. Клеточный центр
Итак, в клетках животных, растений и одноклеточных микротрубочки поляризованы, так что большей частью их растущие (+)-концы направлены к периферии клетки. Это связано с тем, что МТ начинают свой рост от специальных участков в клетке, от центров организации микротрубочек (ЦОМТ). Некоторые из ЦОМТ имеют сложную морфологическую организацию, другие устроены иначе. Различные ЦОМТ можно разделить на несколько групп: центросомные клеточные центры, и центры организации микротрубочек, не имеющие четкой локализации.
Так например, в клетках высших растений полимеризация МТ происходит по периферии клеточного ядра, от которого МТ расходятся радиально. Сходная картина наблюдается при регенерации МТ в гигантских клетках слюнных желез двукрылых. В ряде случаев новообразование МТ, их закладка, нуклеация, может происходить в цитоплазме вне связи со специальными зонами или структурами.
Но в большинстве случаев в интерфазных клетках животных организмов образование и рост МТ происходит от клеточного центра, содержащего специальные образования - центросомы, которые большей частью могут содержать сложно организованные центриоли, или же не иметь их.
Центросомы и центриоли
Центросомы были обнаружены и описаны сто лет назад (Флемминг, 1875; Бенеден, 1876) - это очень мелкие тельца, размер которых находится на границе разрешающей способности светового микроскопа, обычно располагающиеся в геометрическом центре клетки, откуда и их название. В некоторых объектах удавалось видеть, что мелкие плотные тельца (центриоли), обычно в паре (диплосома), окружены зоной более светлой цитоплазмы (собственно центросома), от которой отходят радиально тонкие фибриллы (центросфера) (рис. 277).
Центросомы характерны и обязательны для клеток животных, и нет у высших растений, у низших грибов и некоторых простейших. Было замечено, что центросомы в делящихся клетках принимают участие в формировании веретена деления и располагаются на его полюсах. В неделящихся клетках центросомы часть определяют полярность клеток эпителия и располагаются вблизи аппарата Гольджи. Такая связь центросом с аппаратом Гольджи характерна для многих клеток, в том числе для клеток крови и нервных клеток. Часто центросомы лежат рядом с ядром, располагаясь в зонах его впячивания. Например, в полиморфных лейкоцитах (нейрофилы) центросома лежит внутри подкововидного впячивания ядра (рис. 278).
Типичное строение клеточный центр имеет в клетках животных. Он представляет собой зону, состоящую из центриолей и окружающей их аморфной фибриллярной массы или матрикса. В ряде случаев в состав клеточного центра или центросомы входит только эта фибриллярная масса, от которой отходят микротрубочки (см. ниже).
Наиболее же часто кроме матрикса в состав клеточного центра входят центриоли, как мелкие тельца, с трудом наблюдаемые в световом микроскопе.
Тонкое строение центриолей удалось изучить только с помощью электронного микроскопа. Основу строения центриолей составляют расположенные по окружности девять триплетов микротрубочек, образующие таким образом полый цилиндр (рис. 279). Его ширина около 0, 15 мкм, а длина такого цилиндра 0,3-0,5 мкм (хотя встречаются центриоли, достигающие в длину несколько микрон) (рис. 280).
Первая микротрубочка триплета (А-микротрубочка) имеет диаметр около 25 нм и толщину стенки 5 нм, которая состоит из 13 глобулярных субъединиц. Длина каждого триплета равна длине центриоли. Вторая и третья (В и С) микротрубочки отличаются от А-микротрубочки тем, что они являются неполными, содержат 11 субъединиц и вплотную примыкают к своим соседям. Каждый триплет располагается к радиусу такого цилиндра под углом около 400. Кроме микротрубочек в состав центриоли входит ряд дополнительных структур. От А-микротрубочки отходят так называемые "ручки", выросты, один из которых (внешний) направлен к С- микротрубочке соседнего триплета, а другой (внутренний) - к центру цилиндра.
Обычно в интерфазных клетках всегда присутствуют две центриоли, располагающиеся рядом друг с другом, образуя дуплет центриолей, или диплосому (рис. 281). В диплосоме центриоли располагаются под прямым углом по отношению друг к другу. Из двух центриолей различают "материнскую" и "дочернюю", продольная ось последней перпендикулярна продольной оси материнской центриоли. Обе центриоли сближены своими концами так, что проксимальный конец дочерней центриоли как бы смотрит на поверхность материнской. В дистальном участке материнской центриоли располагается аморфный материал в виде выростов или шпор - это придатки. Их нет на дочерней центриоли (рис. ).
Дочерняя центриоль несколько отличается от материнской. Центральная часть цилиндра центриоли занята структурой, напоминающей тележное колесо; она имеет центральную "втулку" диаметром около 25 нм и 9 спиц, направленных по одной к А-микротрубочке каждого из триплетов. Такие структуры внутри центриоли расположены в одном из её концов, проксимальном, что делает строение цилиндра центриоли полярным. На дистальном конце центриоли внутри её нет таких структур. Объем, занимаемый внутри центриоли втулкой со спицами, может составлять у разных клеток от 3\4 до 1\5 длины центриоли. У некоторых видов втулка отсутствует или заменена скоплением аморфного материала. Торцы центриолярного цилиндра, кроме системы втулки и спиц на проксимальном конце, ничем не закрыты.
Систему микротрубочек центриоли обычно описывают формулой 9 + 0, или (9х3) + 0, подчеркивая отсутствие микротрубочек в её центральной части.
Вокруг каждой центриоли расположен бесструктурный, или тонковолокнистый матрикс. Сами микротрубочки триплетов погружены в аморфный материал т.н. муфты или оправы. Если выделенные центриоли обработать 0,6М раствором NaCl, то произойдет полная экстракция микротрубочек, но центриоль как таковая не растворится: вместо нее останется цилиндрическая структура, имеющая девять полых отверстий, некогда занимавшихся триплетами микротрубочек. Поэтому все схемы центриолей в этой книге, как и во многих других значительно упрощены и не включают материал муфты центриолярного цилиндра.
Часто около центриолей и в связи с ним можно обнаружить несколько дополнительных структур: сателлиты, фокусы схождения микротрубочек, исчерченные волокнистые корешки, дополнительные микротрубочки, образующие особую зону - центросферу вокруг центриоли (рис. 282).
При исследовании в электронном микроскопе интерфазных центриолей было найдено, что лучистое сияние центросферы, обнаруживаемое в световом микроскопе, представляет собой большое число микротрубочек, радиально расходящихся от зоны диплосомы. В диплосоме лишь одна из центриолей, материнская, содержит ряд дополнительных структур. Одни из них, перицентриолярные сателлиты, состоят из имеющей тонкое фибриллярное строение конусовидной ножки, расположенной на стенке центриоли, и головки, заканчивающейся на этой ножке. Ножки сателлитов часто имеют поперечную исчерченность (рис. 284). Количество таких перицентриолярных сателлитов непостоянно, они могут располагаться на разных уровнях по длине центриоли. Кроме этих структур рядом с диплосомой, но не связанные с ней структурно, могут располагаться плотные мелкие (20-40 нм) тельца, к которым подходят одна или несколько микротрубочек (фокусы схождения микротрубочек). Микротрубочки отходят и от головок сателлитов. Эти центросомные микротрубочки не отходят непосредственно от микротрубочек цилиндров центриолей, а связаны или с сателлитами, или с матриксом. Такие микротрубочки и образуют как бы лучистую сферу (центросферу) вокруг центриоли, где (-)-концы МТ связаны с ЦОМТ, а (+)-концы радиально расходятся на периферию клетки. При образовании центросферы в интерфазной клетке только специальные структуры центриоли, сателлиты и матрикс, каким-то образом связаны с образованием микротрубочек; микротрубочки самих центриолей в этом процессе не участвуют. Было найдено, что восстановление прицентриолярных микротрубочек после их деполимеризации на холоду происходит за счет появления новых микротрубочек, отходящих от головок сателлитов. Таким образом, можно считать, что эти дополнительные структуры являются центрами, на которых происходит сборка микротрубочек из тубулинов ( центры организации микротрубочек - ЦОМТ).
Химия центриолей изучена слабо, потому что еще не разработаны методы получения этой структуры в виде чистой фракции. Трудности биохимического изучения центриолей связаны с тем, что это одиночная клеточная структура, имеющая объем всего 0, 03 мкм3. Для сравнения, вспомним, что в клетке имеется: около тысячи штук митохондрий, около миллиона рибосом, около сотни хромосом, около 1 мм2 мембран.
Есть все основания говорить о том, что в состав микротрубочек центриолей входят тубулины. Это доказывается тем, что колхицин прекращает рост микротрубочек в процентриолях, возникающих вблизи материнской центриоли. Предположения о возможной химической природе остальных элементов центриоли основаны главным образом на данных, полученных из химии ресничек и жгутиков, имеющих много сходных черт строения с центриолями.
Данные о химическом строении центриолей получены главным образом с помощью иммунохимических методов. В изолированных базальных тельцах простейшего хламидомонады обнаружено более 200 различных белков, среди которых выявлены четыре вида тубулинов, в том числе ?- тубулин, центрин, перицентрин, белок р210 и многие другие.
В интерфазных клетках центриоли оказываются связаны с ядром и с ядерной мембраной. При выделении ядер практически все центриоли клеток печени и селезенки крыс оказываются в этой фракции. Связь центриолей с ядром осуществляется главным образом промежуточными филаментами. Если живые клетки подвергнуть ультрацентрифугированию, то центриоли опускаются к центробежному полюсу вместе с ядрами.
Центросомный цикл
Было обнаружено, что строение и активность центросом меняются в зависимости от периода клеточного цикла, в течение которого клеточный центр претерпевает тоже циклические изменения (рис. 283).
Целесообразнее начать рассмотрение циклических изменений в структуре центросом с митоза. Начиная с профазы и кончая телофазой, центросомы имеют сходное строение, несмотря на то, что за время митоза происходит ряд существенных клеточных перестроек: конденсация хромосом, разрушение ядерной оболочки, образование веретена деления, расхождение хромосом. В митозе в клеточных центрах (их два, по одному на каждый полюс клетки) находится по диплосоме. Как полагается, дочерняя центриоль своим концом направлена на материнскую. Материнская центриоль на всех стадиях митоза окружена довольно широкой (до 0,3 мкм) зоной тонких фибрилл - центриолярное фибриллярное гало (рис. 279). От этого гало радиально отходят микротрубочки. Важно подчеркнуть, что у дочерних центриолей ни гало, ни отходящих от центриолей микротрубочек нет. В это время происходит формирование веретена митотического аппарата, состоящего из микротрубочек. Эта структура действительно имеет форму веретена, где на концах его на полюсах клетки располагаются диплосомы, окруженные радиальными микротрубочками (центросфера). В данном случае можно говорить о том, что зоны диплосом, клеточные центры, являются центрами организации (полимеризации) микротрубочек. В пользу этого говорят следующие факты: после исчезновения микротрубочек веретена и центросферы, которые происходят при действии холода или колхицина, новые микротрубочки возникают главным образом в районе материнских центриолей, диплосом, в каждом из полюсов клетки. Интересно, что рост новых микротрубочек не связан с микротрубочками триплетов центриолярного цилиндра, они начинают отрастать от зоны гало, расположенной на материнской центриоли. Важно отметить, что в это время на материнских центриолях (как и на дочерних) нет сателлитов, и в это же время цитоплазма теряет микротрубочки: микротрубочки цитоплазмы разбираются, а пул освободившихся тубулиновых мономеров идет на образование микротрубочек веретена и центросферы, которые образуются на фибриллярном гало, как на ЦОМТ. Этот процесс полимеризации митотических микротрубочек отражает первую форму активности центриолярного аппарата (рис. ). Если в профазе облучить центриоль лазерным микролучем, то образование веретена останавливается.
Примерно сходное строение имеют клеточные центры на всех стадиях митоза, но к телофазе толщина фибриллярного гало уменьшается.
К концу телофазы, когда произошло разделение клетки надвое, а хромосомы начали деконденсироваться и образовывать новые интерфазные ядра, происходит разрушение веретена деления, его микротрубочки деполимеризуются. Клеточные центры при этом меняют свою структуру. Материнская и дочерняя центриоли теряют взаимно перпендикулярное расположение и отходят друг от друга на небольшие (0,5-2мкм) расстояния, но все же держатся в одном месте. Вокруг материнской центриоли гало и микротрубочки не выявляются. В это время микротрубочек в цитоплазме также практически нет.
В начале G1-периода на поверхности материнской центриоли возникают сателлиты, имеющие ножку и головку, от которой радиально отходят микротрубочки, которые начинают расти в длину и заполнять собой цитоплазму (рис. 284а). Следовательно, вторая форма активности клеточного центра - образование цитоплазматических микротрубочек в интерфазных клетках. Надо подчеркнуть, что активной здесь является только материнская центриоль, которую легко узнать по придаткам в ее дистальной части.
Если считать клеточные центры основными (если не единственными) местами образования цитоплазматических микротрубочек, то общее количество последних должно быть равно числу микротрубочек, отходящих от центриолей. При исследовании в электронном микроскопе оказалось, что от клеточных центров в интерфазе отходит всего лишь несколько десятков микротрубочек, а в цитоплазме их так много, что с помощью иммунофлуоресцентного метода их трудно подсчитать. Это дает основание предполагать, что по мере роста микротрубочек часть из них теряет связь с областью центриолей и может находиться в цитоплазме долгое время. Центросомы же индуцируют полимеризацию новых микротрубочек, которые приходят на смену постепенно деполимеризующимся старым. Вероятно, в цитоплазме есть несколько генераций микротрубочек: "старые", не связанные с клеточным центром, и новые, растущие от центросом. Таким образом, в клетке происходит как бы конвейерная смена и репродукция цитоплазматических микротрубочек.
Если клеткам запретить переходить в S-период, они могут существовать в фазе клеточного покоя (Go-период) (рис. 285). В это время материнская центриоль продолжает функционировать, как центр образования микротрубочек цитоскелета. Но одновременно она может проявить еще одну форму активности - образовать ресничку, вырост плазматической мембраны, заполненный аксонемой (осевой нитью), состоящей из девяти дублетов микротрубочек. Эти микротрубочки отрастают, как от затравок, от А- и В-микротрубочек триплетов материнской центриоли в дистальной ее части. Это - третья форма активности центриолей как центров организации микротрубочек (см. ниже).
При наступлении S-периода (или в середине его) клеточный центр приступает к четвертой форме своей активности: происходит удвоение числа центриолей. В это время около каждой из разошедшихся еще в конце телофазы центриолей, материнской и дочерней, происходит закладка новых центриолярных цилиндров - процентриолей (рис. 284б). В районе проксимальных концов каждой центриоли перпендикулярно длинной оси закладывается сначала девять синглетов (одиночных) микротрубочек, затем они преобразуются в девять дуплетов, а потом - в девять триплетов растущих микротрубочек новых центриолярных цилиндров.
Закладка процентриолей происходит на проксимальных концах центриолей; в этом месте растут новые поколения центриолей, тоже с проксимального конца. Во время роста процентриолей здесь можно видеть центральную "втулку" со спицами.
Благодаря такому росту структур образуется сначала короткая дочерняя центриоль - процентриоль - которая затем дорастает до размера материнской. Этот способ увеличения числа центриолей был назван дупликацией. Важно отметить, что размножение центриолей не связано с их делением, почкованием или фрагментацией, а происходит путем образования зачатка, процентриоли, вблизи и перпендикулярно к исходной центриоли. Правда, последнее условие соблюдается не во всех объектах, у некоторых оомицетов при дупликации центриоли происходит сначала расхождение центриолей, рост втулки, затем рост микротрубочек вдоль продолжения оси исходной центриоли, и центриоли располагаются конец в конец. Интересно, что триплеты в таких новых центриолях имеют угол наклона, противоположный таковому в материнской центриоли.
Факт удвоения центриолей привел некоторых исследователей к предположению, что центриоли, так же как митохондрии и пластиды, принадлежат к саморедуплицирующимся компонентам цитоплазмы, хотя прямых данных о наличии ДНК в составе центриолей нет.
В S-периоде во время удвоения (дупликации) центриолей материнская продолжает проявлять вторую форму активности: она продолжает быть центром образования цитоплазматических микротрубочек.
В результате процесса дупликации около каждой центриоли вырастает новая дочерняя центриоль (первая материнская центриоль и дочерняя на бывшей дочерней центриоли могут считаться как бы бабушкой и внучкой). Поэтому в клетке после завершения S-периода находятся уже две диплосомы (а всего четыре центриолярных цилиндра) (рис. 286).
После этого наступает следующий период клеточного цикла, постсинтетический (G2-период), когда в клетке начинается подготовка к очередному делению. В это время исчезают сателлиты на материнской диплосоме (так можно назвать старую материнскую центриоль с новой дочерней), а обе материнские центриоли в обеих диплосомах покрываются фибриллярным гало, от которого в профазе начинают отрастать митотические микротрубочки. Параллельно этому в цитоплазме происходит исчезновение микротрубочек, и клетка стремится приобрести шаровидную форму. Вся такая последовательность событий повторяется от цикла к циклу у клеток, способных к длительному размножению. В большинстве случаев клетки организма находятся в G0-периоде, поэтому у них центриоль участвует в полимеризации цитоплазматических микротрубочек и в образовании реснички (или множества ресничек). В последнем случае она входит в состав так называемого базального тельца.
Обычно в клетку после деления попадают два центриолярных цилиндра в составе диплосомы. В различных экспериментальных условиях можно запретить разделение клетки надвое и получить клетки с удвоенным числом хромосом (полиплоидные клетки). Совершенно очевидно, что в таких клетках будет и удвоенное число центриолей. Клетки могут снова вступать в клеточный цикл, при этом будет удваиваться как количество ДНК, так и число центриолей. Было обнаружено, что у тетраплоидных (с четырехкратным набором хромосом) клеток печени в G0-периоде в цитоплазме видны не два, а четыре центриолярных цилиндра, а в полюсах при делении таких клеток было обнаружено по две диплосомы в каждом. Аналогичная ситуация замечена и у других полиплоидных клеток (мегакариоциты костного мозга, полиплоидные гибридные клетки и др.). В связи с этим предположили, что между числом плоидности клетки (числом хромосомных наборов) и числом центриолей существует прямая связь.
Нарушения центриолярного цикла могут вызвать ряд патологических изменений клеток, в первую очередь появление многополюсных митозов. Так, при действии ?-меркаптоэтанола происходит блокада нормального митоза, при этом диплосомы расходятся на отдельные центриоли. При отмывании от этого вещества клетка снова приступает к делению, но в этом случае каждая центриоль активируется и образует полюс веретена. Таким образом, возникают трех- или четырехполюсные митозы, приводящие к неравномерному распределению хромосом между дочерними клетками. Это в свою очередь приводит к изменению числа хромосом (анэуплоидия), которое часто вызывает гибель клетки. Иногда при образовании многополюсных митозов в некоторых полюсах отсутствуют центриоли: в полюсе располагается только фибриллярный материал центросомы (бесцентриолярные полюса).
Итак, в подавляющем большинстве клеток млекопитающих центросомы участвуют в полимеризации тубулинов и являются структурами, играющими роль центров организации микротрубочек. Микротрубочки самих центриолей являются затравками для полимеризации тубулинов только в одном случае - при росте аксонемы реснички, когда центриоль становится базальным тельцем. Это временное состояние: при переходе клеток к делению реснички могут исчезать, а базальное тельце снова может выполнять роль центриоли, участвуя в организации цитоплазматических микротрубочек или микротрубочек митотического веретена. Только в этих случаях центрами организации микротрубочек являются не сами центриолярные цилиндры, а перицентриолярный материал (головка сателлитов, околоцентриолярный матрикс, гало и т.д.). Следовательно, центриоль как таковую нужно рассматривать как один из компонентов более сложной структуры - клеточного центра или центросомы. Эта оговорка связана с тем, что у всех высших растений ЦОМТ не содержит центриолей. Более того, в раннем эмбриогенезе позвоночных животных образуются веретена деления, не имеющие центриолей в полюсах. По всей вероятности в последних случаях центриоли возникают позже заново, а не образуются путем "репликации". Вопрос о процессе образования центриолей далек от решения. Остается неясным процесс появления процентриолей. В процессе эмбриогенеза отмечены случаи возникновения центриолей de novo у морского ежа, у моллюсков, у мышей. Так, в эмбриогенезе мыши центриоли появляются только после 1-2 делений клеток бластулы, несмотря на то, что сами клеточные деления происходят нормально, за исключением того, что в полюсах деления в зоне бесструктурной центросомы центриоли отсутствуют. С другой стороны, если в соматических клетках культуры ткани уничтожить центросому с центриолью с помощью микрооблучения, то новые центриоли не возникают.
Базальные тельца. Строение и движение ресничек и жгутиков.
Как уже указывалось, у многих клеток животных, вышедших из клеточного цикла, в G0-стадии центриоли принимают участие в образовании аппарата движения - ресничек. Их две группы: кинетоцилии, характерные для специальных эпителиев (ресничные эпителии трахеи, яйцеводов) или свободно плавающих клеток (сперматозоиды, простейшие), и так называемые первичные реснички, встречающиеся во многих клетках, не обладающих способностью к движению.
Вначале рассмотрим строение кинетоцилей - подвижных ресничек и жгутиков. В световом микроскопе эти структуры видны как тонкие выросты клетки, в их основании в цитоплазме видны хорошо красящиеся мелкие гранулы - базальные тельца, аналоги центриолей (рис. 287). Клетки, имеющие реснички или жгутики, обладают способностью двигаться, будучи в свободном состоянии, или же перемещать жидкости в случае, если клетки неподвижны. Свободноживущие одноклеточные организмы, снабженные одним или несколькими жгутиками, обычно движутся тем концом вперед, который несет жгутики. Иной способ движения можно видеть у спермиев некоторых животных: жгутик, располагаясь сзади, толкает тело клетки вперед. Скорость движения клеток за счет работы жгутиков может достигать очень большой величины (до 5 мм / мин).
Множественные реснички также могут обеспечивать движение свободноживущих клеток, таких как инфузории или некоторые жгутиконосцы. Реснички эпителиальных клеток многих беспозвоночных и позвоночных животных обеспечивают поток жидкостей вдоль поверхности таких клеток. Число ресничек на клетку может достигать 300 в эпителии трахеи; у инфузории туфельки на клетку приходится 10-14 тыс. рядами расположенных ресничек.
При движении ресничек и жгутиков не происходит уменьшения их длины, поэтому неправильно называть это движение сокращением. Траектория движения ресничек очень разнообразна (рис. 288). В различных клетках это движение может быть маятникообразным, крючкообразным, воронкообразным или волнообразным.
У многоресничных клеток (инфузории, клетки ресничного эпителия) движение ресничек не хаотично, а строго упорядочено. В этом случае реснички расположены рядами. В продольном ряду отдельные реснички начинают движение и проходят отдельные его фазы по очереди, метахронно. В поперечном же ряду все реснички находятся в одной фазе движения (синхронны). Это создает движущую волну по поверхности клетки (рис. )289.
Общая архитектура реснички представлена на рис. 290, 291. Ресничка представляет собой тонкий цилиндрический вырост цитоплазмы с постоянным диаметром 300 нм. Этот вырост от основания до самой его верхушки покрыт плазматической мембраной. Внутри выроста расположена аксонема, сложная структура, состоящая в основном из микротрубочек. Нижняя, проксимальная часть реснички, базальное тельце, погружена в цитоплазму. Диаметры аксонемы и базального тельца одинаковы (около 200 нм).
На поперечном сечении реснички видна плазматическая мембрана, окружающая аксонему. Аксонема в своем составе имеет девять дублетов микротрубочек, образующих внешнюю стенку цилиндра аксонемы. Дублеты микротрубочек слегка повернуты (около 100) по отношению к радиусу аксонемы. Кроме периферических дублетов микротрубочек в центре аксонемы располагается пара центральных микротрубочек. В целом систему микротрубочек реснички описывают как (9х2)+2. В дублетах микротрубочек также различают А-микротрубочку, состоящую из 13 субъединиц, и В-микротрубочку, неполную, содержащую 11 субъединиц. А-микротрубочка несет на себе ручки, которые направлены к В-микротрубочке соседнего дуплета. От А-микротрубочки к центру аксонемы отходит радиальная связка, или спица, оканчивающаяся головкой, присоединяющейся к центральной муфте, имеющей диаметр около 70 нм, окружающей две центральные микротрубочки. Последние лежат отдельно друг от друга на расстоянии около 25 нм. Таким образом, в аксонеме располагается 20 продольных микротрубочек, в то время как в базальном тельце их 27 (рис. 291, 292).
Базальное тельце состоит из 9 триплетов микротрубочек (как и центриоль), имеет ручки, втулку и спицы, расположенные в проксимальной (нижней) ее части. На участке базального тельца, примыкающем к плазматической мембране, есть девять придатков, выступов, идущих от каждого триплета микротрубочек к плазматической мембране и связывающих его с клеточной поверхностью.
Базальное тельце и аксонема структурно связаны друг с другом и составляют единое целое: А- и В-микротрубочки триплетов базального тельца продолжаются в А- и В-микротрубочках дуплетов аксонемы. Однако внутренние части аксонемы и базального тельца значительно отличны друг от друга. Часто в зоне перехода базального тела в аксонему наблюдают аморфную поперечную пластинку, которая как бы отделяет эти две части. Центральные микротрубочки аксонемы начинаются от этой пластинки так же, как в этом месте начинается и центральная муфта (капсула) (рис. 290).
В основании ресничек и жгутиков часто встречаются исчерченные корешки, или кинетодесмы, представляющие собой пучки тонких (6 нм) фибрилл, обладающих поперечной исчерченностью (рис. 293). Часто такие исчерченные кинетодесмы простираются от базальных телец вглубь цитоплазмы по направлению к ядру. Роль этих структур не ясна. Они не изменяются при действии колхицина, могут встречаться и в составе центриолей интерфазных клеток, не принимающих участия в образовании ресничек.
При движении ресничек не происходит изменения их длины, они не "сокращаются", а изгибаются, бьются. Оказалось, что механически отделенные реснички способны к биению в присутствии АТФ. При отделении ресничек базальные тельца остаются в теле клетки. Это означает, что для механической работы ресничек базальное тело не нужно, а только аксонема участвует в генерации движения. Удалось показать, что за движение ресничек отвечают "ручки", сидящие на А-микротрубочках. При экстракции компонентов ручек реснички перестают биться в присутствии АТФ.
Было найдено, что в состав ручек входят белки динеины. Это большие белковые компоненты, состоящие из 9-12 полипептидных цепей, содержащие 2-3 глобулярные головки, связанные в общий корешок гибкими хвостами (рис. 294). Каждая головка динеина обладает АТФ-азной активностью, которая возрастает примерно в 6 раз при ассоциации с микротрубочками. В состав каждой ручки входит один белковый комплекс, одна молекула динеина. Так как экстракция ручек прекращает биение ресничек, то можно считать, что именно динеин ответственен за это движение, то есть динеин является мотором или двигателем при биении ресничек. Но каков механизм этого движения?
Этот вопрос был решен при использовании выделенных ресничек, лишенных плазматической мембраны, радиальных спиц и связок после частичной обработки аксонем протеазами. Оказалось, что такие аксонемы, содержащие динеиновые ручки, при добавлении к ним АТФ начинают увеличиваться в длину почти до девяти раз и одновременно утончаются. В электронном микроскопе видно, что такая аксонема увеличилась в длину за счет смещения пар микротрубочек одна относительно другой (рис. 295). Другими словами, произошло продольное скольжение дуплетов один относительно другого, аналогично тому, что происходит при сокращении саркомеров в мышце: скольжение миозиновых нитей относительно актиновых. В случае динеина повторные циклы ассоциации с субъединицами тубулина, изменения конформации при связывании АТФ и его гидролизе, вызывают перемещение головок вдоль микротрубочки от (+)-конца к (-)-концу. При этом соседний дуплет двигается к верхушке реснички. Когда ресничка содержит все компоненты, и дуплеты микротрубочек связаны друг с другом и с центральной парой микротрубочек, такие кооперативные смещения дуплетов микротрубочек приводят не к удлинению реснички, а к ее изгибу (рис. 296). Как регулируется последовательное перемещение дуплетов один относительно другого, еще не ясно.
Рост ресничек, удлинение микротрубочек их аксонем происходит на вершине реснички. Следовательно, там локализованы (+)-концы микротрубочек.
Образование аксонемы ресничек происходит за счет роста А- и В-микротрубочек центриолей, которые в этом случае становятся базальным тельцем. В простейшем случае при образовании одиночных ресничек или так называемых первичных ресничек материнская центриоль подходит к плазматической мембране своим дистальным торцом, связывается с ней своими придатками. В это время начинается рост микротрубочек на (+)- концах А- и В-микротрубочек триплетов. Возникают девять дублетов микротрубочек аксонемы, которые, наращиваясь с (+)-концов на верхушке аксонемы как бы вытягивают плазматическую мембрану, образуя вырост - ресничку. Две центральные микротрубочки возникают в связи с плотным веществом, лежащим на границе бывшей центриоли и выроста плазматической мембраны (рис. 290а).
При образовании многоресничных клеток происходит многочисленная репликация центриолей и образование многочисленных ресничек.
В ресничном эпителии позвоночных множественные базальные тельца возникают вокруг так называемых дейтеросом - аморфных электронноплотных структур размером от 60 до 700 нм, по периферии которых происходит закладка множественных зачатков базальных телец. Вокруг одной дейтеросомы образуются до десятка новых базальных телец. Они затем мигрируют к плазматической мембране и принимают участие в образовании аксонем (рис. 298).
Необходимо отметить, что клетки с множеством ресничек теряют способность к делению и не могут выходить из G0-стадии клеточного цикла. На смену им из эпителиального пласта приходят стволовые недифференцированные клетки, которые могут делиться и давать новые поколения многоресничных клеток.
Микротрубочки аксонемы устойчивы к действию колхицина, но при росте реснички колхицин полностью прекращает включение новых молекул тубулина, что приводит к торможению роста ресничек.
Вторая категория ресничных клеток - клетки с так называемыми первичными ресничками, не обладающими способностью к движению. Практически все типы клеток, за исключением клеток крови, мышц и кишечного эпителия, в G0-периоде образуют первичные реснички, которые отличаются от настоящих ресничек, или киноцилий, тем, что они не имеют пары центральных микротрубочек и не способны к движению. Они образуются в результате того, что диплосома подходит к плазматической мембране и от материнской центриоли начинается рост аксонемы, но без двух центральных микротрубочек. Если клетки культуры фибробластов, обладающих в G0-периоде такими ресничками, стимулировать к делению, то эти реснички исчезают, а базальное тельце-центриоль начинает свой цикл как обычная центриоль в клетках, способных к делению.
Функциональное значение этих первичных ресничек не ясно. Но интересно отметить, что при развитии сенсорных клеток сетчатки их наружные сегменты палочек и колбочек возникают сначала за счет образования первичных ресничек. Возможно, что у нерецепторных клеток, имеющих такие первичные реснички, последние выполняют функции внешних анализаторов, являются как бы "антеннами", на поверхности которых рецепторные молекулы плазматической мембраны могут регистрировать механические и химические сигналы, поступающие из внешней межклеточной среды.
Двигательный аппарат бактерий
Многие бактерии способны к быстрому движению с помощью своеобразных бактериальных жгутиков или флагелл.
Основная форма движения бактерий - с помощью жгутика. Жгутики бактерий принципиально отличны от жгутиков эукариотических клеток. По числу жгутиков их делят на: монотрихи - с одним жгутиком, политрихи - с пучком жгутиков, перитрихи - с множеством жгутиков в разных участках поверхности (рис. 299).
Жгутики бактерий имеют очень сложное строение; они состоят из трех основных частей: внешняя длинная волнистая нить (собственно жгутик), крючок, базальное тельце (рис. 300).
Жгутиковая нить построена из белка флагеллина. Его молекулярный вес колеблется в зависимости от вида бактерий (40-60 тыс.). Глобулярные субъединицы флагеллина полимеризуются в спирально закрученные нити так, что образуется трубчатая структура (не путать с микротрубочками эукариот!) с диаметром 12-25 нм, полая изнутри. Флагеллины не способны к движению. Они могут спонтанно полимеризоваться в нити с постоянным шагом волны, характерным для каждого вида. В живых бактериальных клетках нарастание жгутиков происходит на их дистальном конце; вероятно, транспорт флагеллинов происходит через полую середину жгутика.
Вблизи клеточной поверхности жгутиковая нить, флагелла, переходит к более широкому участку, так называемому крючку. Он имеет длину около 45 нм и состоит из другого белка.
Бактериальное базальное тельце не имеет ничего общего с базальным тельцем эукариотической клетки (рис. 290 б, в). Оно состоит из стержня, связанного с крючком и четырех колец - дисков. Два верхних кольца диска, имеющихся у грамотрицательных бактерий, локализованы в клеточной стенке: одно кольцо (L) погружено в липосахаридную мембрану, а второе (P) - в муреиновый слой. Два других кольца - белковый комплекс "S"-статор и "M"-ротор, локализованы в плазматической мембране. К этому комплексу со стороны плазматической мембраны примыкает кольцевой ряд белков Mot A и B.
В базальных тельцах грамположительных бактерий имеется только два нижних кольца, связанных с плазматической мембраной.
Базальные тельца вместе в крючками можно выделить, оказалось, что они содержат в своем составе около 12 различных белков.
Принцип движения бактериальных жгутиков совершенно иной, чем у эукариот. Если у эукариот жгутики движутся за счет продольного скольжения дуплетов микротрубочек, то у бактерий движение жгутиков происходит за счет вращения базального тельца (а именно "S"- и "М"- дисков) вокруг своей оси в плоскости плазматической мембраны.
Это было доказано рядом красивых экспериментов. Так, закрепляя жгутики на подложке с помощью антител к флагеллину, исследователи наблюдали вращение бактерий. Было найдено, что многочисленные мутации по флагеллинам (изменение изгиба нити, "курчавость" и т. д.) не сказываются на способности клеток к движению. Мутации же по белкам базального комплекса часто приводят к потере движения.
Движение бактериальных жгутиков не зависит от АТФ, а осуществляется благодаря трансмембранному градиенту ионов водорода на поверхности плазматической мембраны. При этом происходит вращение М-диска.
В окружении М-диска Mot-белки способны к переносу ионов водорода из периплазматического пространства в цитоплазму (за один оборот переносится до 1000 ионов водорода). При этом происходит вращение жгутика с огромной скоростью, от 5-100 об/сек., что дает возможность бактериальной клетке перемещаться на 25-100 мкм в секунду.
Часть VII. Механизмы клеточного деления.
Глава 24. Митотическое деление клеток. Общая организация митоза
Как постулирует клеточная теория, увеличение числа клеток происходит исключительно за счет деления исходной клетки, предварительно удвоившей свой генетический материал. Это - главное событие в жизни клетки как таковой, а именно завершение воспроизведения себе подобного. Вся "интерфазная" жизнь клеток направлена на полное осуществление клеточного цикла, заканчивающегося клеточным делением. Само же деление клетки - процесс неслучайный, строго генетически детерминированный, где в последовательный ряд выстроена целая цепочка событий.
Как уже указывалось, деление прокариотических клеток протекает без конденсации хромосом, хотя должен существовать ряд метаболических процессов и, в первую очередь, синтезов ряда специфических белков, участвующих в "простом" делении бактериальной клетки надвое.
Деление всех эукариотических клеток связано с конденсацией удвоенных (реплицированных) хромосом, которые приобретают вид плотных нитчатых структур. Эти нитчатые хромосомы переносятся в дочерние клетки специальной структурой - веретеном деления. Такой тип деления эукариотических клеток - митоз (от греч. mitos - нити), или кариокинез, или непрямое деление - является единственным полноценным способом увеличения числа клеток. Прямое деление клеток или амитоз достоверно описано только при делении полиплоидных макронуклеусов инфузорий, их микронуклеусы делятся только митотическим путем.
Деление всех эукариотических клеток связано с образованием специального аппарата клеточного деления. При удвоении клеток происходят два события: расхождение реплицированных хромосом и разделение клеточного тела, цитотомия. Первая часть события у эукариот осуществляется с помощью так называемого веретена деления, состоящего из микротрубочек, а вторая часть происходит за счет участия акто-миозиновых комплексов, вызывающих образование перетяжки у клеток животного происхождения или за счет участия микротрубочек и актиновых филаментов в образовании фрагмопласта, первичной клеточной перегородки у клеток растений.
В образовании веретена деления у всех эукариотических клеток принимают участие два рода структур: полярные тельца (полюса) веретена и кинетохоры хромосом. Полярные тельца, или центросомы, являются центрами организации (или нуклеации) микротрубочек. От них своими "+"-концами отрастают микротрубочки, образующие пучки, тянущиеся к хромосомам. У клеток животных центросомы включают в свой состав и центриоли. Но у многих эукариот центриолей нет, а центры организации микротрубочек присутствуют в виде бесструктурных аморфных зон, от которых отходят многочисленные микротрубочки. Как правило, при организации аппарата деления участвуют две центросомы или два полярных тельца, находящиеся на противоположных концах сложного, веретенообразного тела, состоящего из микротрубочек. Второй структурой, характерной для митотического деления клеток, связывающей микротрубочки веретена с хромосомой, являются кинетохоры. Именно кинетохоры, взаимодействуя с микротрубочками, ответственны за перемещение хромосом при клеточном делении.
Все эти компоненты, а именно, полярные тельца (центросомы), микротрубочки веретена и кинетохоры хромосом встречаются у всех эукариотических клеток, начиная с дрожжей и кончая млекопитающими, и обеспечивают сложный процесс расхождения реплицированных хромосом.
Различные типы митоза эукариот
Описанное выше деление клеток животных и растений - не единственная форма непрямого деления клеток (рис. 301). Наиболее простой тип митоза - плевромитоз. Он в какой-то степени напоминает бинарное деление прокариотических клеток, у которых нуклеоиды после репликации остаются связанными с плазматической мембраной, которая начинает как бы расти между точками связывания ДНК и тем самым как бы разносит хромосомы в разные участки клетки (о делении прокариот см. ниже). После этого при образовании клеточной перетяжки каждая из молекул ДНК окажется в новой отдельной клетке.
Как уже говорилось, характерным для деления эукариотических клеток является образование веретена, построенного из микротрубочек (рис. 302). При закрытом плевромитозе (закрытым он называется потому, что расхождение хромосом происходит без нарушения ядерной оболочки) в качестве центров организации микротрубочек (ЦОМТ) участвуют не центриоли, а другие структуры, находящиеся на внутренней стороне ядерной мембраны. Это так называемые полярные тельца неопределенной морфологии, от которых отходят микротрубочки. Этих телец два, они расходятся друг от друга, не теряя связи с ядерной оболочкой, и в результате этого образуются два полуверетена, связанные с хромосомами. Весь процесс образования митотического аппарата и расхождения хромосом происходит в этом случае под ядерной оболочкой. Такой тип митоза встречается среди простейших, он широко распространен у грибов (хитридиевые, зигомицеты, дрожжи, оомицеты, аскомицеты, миксомицеты и др.). Встречаются формы полузакрытого плевромитоза, когда на полюсах сформированного веретена ядерная оболочка разрушается.
Другой формой митоза является ортомитоз. В этом случае ЦОМТ располагаются в цитоплазме, с самого начала идет образование не полуверетен, а двухполюсного веретена. Существуют три формы ортомитоза: открытый (обычный митоз), полузакрытый и закрытый. При полузакрытом ортомитозе образуется бисимметричное веретено с помощью расположенных в цитоплазме ЦОМТ, ядерная оболочка сохраняется в течение всего митоза, за исключением полярных зон. В качестве ЦОМТ здесь могут обнаруживаться массы гранулярного материала или даже центриоли. Эта форма митоза встречается у зеленых водорослей, грегарин, бурых, красных водорослей, у некоторых низших грибов. При закрытом ортомитозе полностью сохраняется ядерная оболочка, под которой образуется настоящее веретено. Микротрубочки формируются в кариоплазме, реже отрастают от внутриядерного ЦОМТ, не связанного (в отличие от плевромитоза) с ядерной оболочкой. Такого типа митозы характерны для деления микронуклеусов инфузорий, но встречаются и у других простейших. При открытом ортомитозе ядерная оболочка полностью распадается. Этот тип деления клеток характерен для животных организмов, некоторых простейших и для клеток высших растений. Эта форма митоза в свою очередь представлена астральным и анастральным типами (рис. 303).
Из этого краткого рассмотрения видно, что главной особенностью митоза вообще является возникновение структур веретена деления, образующегося в связи с разнообразными по своему строению ЦОМТ.
Морфология митотической фигуры
Как уже говорилось, митотический аппарат наиболее подробно изучен у клеток высших растений и животных. Особенно хорошо он бывает выражен на стадии метафазы митоза (рис. 302). В живых или фиксированных клетках в метафазе в экваториальной плоскости клетки располагаются хромосомы, от которых в противоположных направлениях тянутся т.н. нити веретена, сходящиеся на двух разных полюсах митотической фигуры. Так что митотическое веретено - это совокупность хромосом, полюсов и волокон. Волокна веретена представляют собой одиночные микротрубочки или их пучки. Начинаются микротрубочки от полюсов веретена и часть из них направляется к центромерам, где расположены кинетохоры хромосом (кинетохорные микротрубочки), часть проходит дальше по направлению к противоположному полюсу, но до него не доходит - "межполюсные микротрубочки". Кроме того от полюсов отходит группа радиальных микротрубочек, образуя вокруг них как бы "лучистое сияние" - это астральные микротрубочки.
По общей морфологии митотические фигуры делятся на два типа: астральный и анастральный (рис. 303).
Астральный тип веретена (или конвергентный) характеризуется тем, что его полюса представлены небольшой зоной, к которой сходятся (конвергируют) микротрубочки. Обычно в полюсах астральных веретен располагаются центросомы, содержащие центриоли. Хотя известны случаи бесцентриолярных астральных митозов (при мейозе некоторых беспозвоночных). От полюсов кроме того расходятся радиальные микротрубочки, не входящие в состав веретена, а образующие звездчатые зоны - цитастеры. В целом же такой тип митотического веретена напоминает скорее гантель (рис. 303а).
Анастральный тип митотической фигуры не имеет на полюсах цитастеров. Полярные области веретена здесь широкие, их называют полярными шапочками, в их состав не входят центриоли. Волокна веретена в данном случае не отходят от одной точки, а расходятся широким фронтом (дивергируют) от всей зоны полярных шапочек. Этот тип веретена характерен для делящихся клеток высших растений, хотя иногда встречается и у высших животных. Так, например, в раннем эмбриогенезе млекопитающих при делении созревания ооцита и при I и II делении зиготы наблюдаются бесцентриолярные (дивергентные) митозы. Но уже начиная с третьего клеточного деления и во всех последующих, клетки делятся при участии астральных веретен, в полюсах которых всегда обнаруживаются центриоли.
В целом же для всех форм митоза общими структурами остаются хромосомы с их кинетохорами, полярные тельца (центросомы) и волокна веретена.
Центромеры и кинетохоры
Центромеры, как участки связывания хромосом с микротрубочками, могут иметь различную локализацию по длине хромосом. Так встречаются голоцентрические центромеры, когда микротрубочки связываются по длине всей хромосомы (некоторые насекомые, нематоды, некоторые растения) и моноцентрические центромеры, где микротрубочки связаны с хромосомами в одном участке (рис. 304). Моноцентрические центромеры могут быть точечными (например у некоторых почкующихся дрожжей), когда к кинетохору подходит всего лишь одна микротрубочка, и зональными, где к сложному кинетохору подходит пучок микротрубочек. Несмотря на разнообразие зон центромер, все они связаны со сложной структурой кинетохора, имеющего принципиальное сходство строения и функций у всех эукариот.
Проще всего строение моноцентрического кинетохора у клеток пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae). Он связан со специальным участком ДНК на хромосоме (центромерный или СЕN-локус). Этот участок состоит из трех элементов ДНК: СDЕ I, СDЕ II, СDЕ III. Интересно, что последовательности нуклеотидов в СDЕ I и СDЕ III - очень консервативны и сходны с таковыми у дрозофиллы. Участок СDЕ II - может быть разной величины, и обогащен А-Т парами. За связь с микротрубочками у S. cerevisia отвечает участок СDЕ III , взаимодействующий с целым рядом белков.
Зональные центромеры состоят из многократно повторяющихся СЕN-локусов, обогащенных участками конститутивного гетерохроматина, содержащего сателлитную ДНК, связанную с кинетохорами.
Кинетохоры - специальные белковые структуры, большей частью располагающиеся в зонах центромер хромосом (рис. 304). Кинетохоры лучше изучены у высших организмов. Кинетохоры - это сложные комплексы, состоящие из многих белков. Морфологически они очень сходны, имеют одинаковое строение, начиная от диатомовых водорослей, кончая человеком. Кинетохоры представляют собой трехслойные структуры (рис. 305): внутренний плотный слой, примыкающий к телу хромосомы, средний рыхлый слой, и внешний плотный слой. От внешнего слоя отходят множество фибрилл, образуя т.н. фиброзную корону кинетохора (рис. 306).
В общей форме кинетохоры имеют вид пластинок или дисков, лежащих в зоне первичной перетяжки хромосомы, в центромере. На каждую хроматиду (хромосому) обычно приходится по одному кинетохору. До анафазы кинетохоры на каждой сестринской хроматиде располагаются оппозитно, связываясь каждый со своим пучком микротрубочек. У некоторых растений кинетохор имеет вид не пластинок, а полусфер.
Кинетохоры представляют собой сложные комплексы, где кроме специфической ДНК участвует множество кинетохорных белков (СЕNР-белки) (рис. 307). В участке центромеры хромосомы под трехслойным кинетохором расположен участок гетерохроматина, обогащенного ?-сателлитной ДНК. Здесь же обнаруживается ряд белков : СЕNР-В, который связывается с ?- ДНК, МСАК - кинезино подобный белок и белки, ответственные за спаривание сестринских хромосом (когезины). Во внутреннем слое кинетохора обнаружен также ряд белков: СЕNР-А, вариант гистона Н3, который, вероятно, связывается с СDЕ II участком ДНК, СЕNР-G, связывающийся с белками ядерного матрикса, консервативный белок СЕNР-С, с неизвестной пока функцией. В среднем рыхлом слое обнаружен белок 3F3/2, который , вероятно, как-то регистрирует натяжение пучков микротрубочек.
Во внешнем плотном слое кинетохора обнаружены белки СЕNР-Е и СЕNР- F, участвующие в связывании микротрубочек. Кроме того, здесь обнаружены белки семейства цитоплазматических динеинов.
Функциональная роль кинетохоров заключается в связывании между собой сестринских хроматид, в закреплении митотических микротрубочек, в регуляции разъединения хромосом и в собственно движении хромосом во время митоза при участии микротрубочек.
К кинетохорам подходят микротрубочки, растущие от полюсов, от центросом. Минимальное их число у дрожжей - одна микротрубочка на каждую хромосому. У высших растений это число достигает 20-40. В последнее время удалось показать, что сложные кинетохоры высших организмов представляют собой структуру, состоящую из повторяющихся субъединиц, каждая из которых способна образовывать связи с микротрубочками (рис. 308). По одной из моделей строения центромерного участка хромосомы (Зинковски, Мейне, Бринкли, 1991) предложено, что в интерфазе на специфических участках ДНК расположены субъединицы кинетохора, содержащие все характерные белки. По мере конденсации хромосом в профазе эти субъединицы группируются таким образом, что создается зона, обогащенная этими белковыми комплексами - кинетохор.
Кинетохоры, белковые в общем структуры, удваиваются в S-периоде, параллельно удвоению хромосом. Но их белки присутствуют на хромосомах во всех периодах клеточного цикла (таб. ).
Динамика митоза
Во многих разделах данной книги мы уже касались поведения различных клеточных компонентов (хромосом, ядрышек, ядерной оболочки и др.) при клеточном делении. Но вернемся кратко к этим важнейшим процессам, чтобы разобраться в них уже в целом.
У клеток, вступивших в цикл деления, фаза собственно митоза, непрямого деления, занимает относительно короткое время, всего около 0,1 времени клеточного цикла. Так, у делящихся клеток меристемы корней интерфаза может составлять 16-30 ч, а митоз занимать всего 1-3 ч. Цикл эпителиальных клеток кишечника мыши длится около 20-22ч, на митоз же приходится всего 1 ч. При дроблении яйцеклеток весь клеточный период, включая митоз, может быть меньше часа.
Процесс митотического деления клеток принято подразделять на несколько основных фаз: профаза, прометафаза, метафаза, анафаза, телофаза (рис. 309-314). Границы между этими фазами установить точно очень трудно, потому что сам митоз представляет собой непрерывный процесс и смена фаз происходит очень постепенно: одна их них незаметно переходит в другую. Единственная фаза, которая имеет реальное начало, это анафаза - начало движения хромосом к полюсам. Длительность отдельных фаз митоза различна, наиболее короткая по времени анафаза (табл. ).
Длительность фаз митоза
Объект
Продолжительность (в мин)

профаза
метафаза
анафаза
телофаза
Клетки саркомы Иосида
14
31
4
21
Клетки культуры селезенки мыши
20-35
6-15
8-14
9-26
Клетки эндосперма гороха
40
20
12
110
Клетки эндосперма ириса
40-65
10-30
12-22
40-75

Определяется время отдельных фаз митоза лучше всего при прямом наблюдении за делением живых клеток в специальных камерах. Зная время митоза, можно рассчитать длительность отдельных фаз по проценту их встречаемости среди делящихся клеток.
Профаза. Уже в конце G2-периода в клетке начинают происходить значительные перестройки. Точно определить, когда наступает профаза невозможно. Лучшим критерием для начала этой фазы митоза может служить появление в ядрах нитчатых структур - митотических хромосом. Этому событию предшествует повышение активности фосфорилаз, модифицирующих гистоны, и, в первую очередь, гистон Н1. В профазе сестринские хроматиды связаны друг с другом бок о бок с помощью белков-когезинов, которые образуют эти связи еще в S-периоде, во время удвоения хромосом. К поздней профаза связь между сестринскими хроматидами сохраняется только в зоне кинетохоров. В профазных хромосомах уже можно наблюдать зрелые кинетохоры, которые не имеют никаких связей с микротрубочками.
Конденсация хромосом в профазном ядре совпадает с резким уменьшением транскрипционной активности хроматина, которая полностью исчезает к середине профазы. В связи с падением синтеза РНК и конденсацией хроматина происходит инактивация и ядрышковых генов. При этом отдельные фибриллярноые центры сливаются так, что превращаются в ядрышко-образующие участки хромосом, в ядрышковые организаторы. Большая часть ядрышковых белков диссоциирует и в свободном виде встречается в цитоплазме клетки или связывается с поверхностью хромосом.
Одновременно с этим происходит фосфорилирование ряда белков ламины, ядерной оболочки, которая распадается. При этом теряется связь ядерной оболочки с хромосомами. Затем ядерная оболочка фрагментируется на мелкие вакуоли, а поровые комплексы исчезают.
Параллельно этим процессам происходит активация клеточных центров. В начале профазы разбираются микротрубочки в цитоплазме и начинается бурный рост множества астральных микротрубочек вокруг каждой из удвоившиеся диплосом (рис. 310). Скорость роста микротрубочек в профазе почти в два раза выше роста интерфазных микротрубочек, но лабильность их в 5-10 раз выше цитоплазматических. Так если время полужизни микротрубочек в цитоплазме составляет около 5 мин, то во время первой половины митоза - всего лишь 15 секунд. Здесь еще в большей степени проявляется динамическая нестабильность микротрубочек. Все микротрубочки, отходящие от центросом, растут вперед своими (+)-концами.
Активированные центросомы - будущие полюса веретена деления - начинают расходиться друг от друга на некоторое расстояние. Механизм такого профазного расхождения полюсов заключается в следующем: идущие навстречу друг другу антипараллельные микротрубочки взаимодействуют между собой, что приводит к их большей стабилизации и расталкиванию полюсов (рис. 315). Это происходит за счет взаимодействия с микротрубочками динеино-подобных белков, которые в центральной части веретена выстраивают межполюсные микротрубочки параллельно друг другу. Одновременно с этим продолжается их полимеризация и рост, которые сопровождаются одновременно с их расталкиванием в направлении к полюсам за счет работы кинезино-подобных белков (рис. 316). В это время при образовании веретена микротрубочки с кинетохорами хромосом еще не связаны.
В профазе одновременно с разборкой цитоплазматических микротрубочек происходит дезорганизация эндоплазматического ретикулума (он распадается на мелкие вакуоли, лежащие по периферии клетки) и аппарата Гольджи, который теряет свою околоядерную локализацию, распадается на отдельные диктиосомы, без порядка разбросанные в цитоплазме.
Прометафаза. После разрушения ядерной оболочки митотические хромосомы без особого порядка лежат в зоне бывшего ядра. В прометафазе начинается их движение и перемещение, которое в конечном итоге приведет к образованию экваториальной хромосомной "пластинки", к упорядоченному расположению хромосом в центральной части веретена уже в метафазе. В прометафазе наблюдается постоянное движение хромосом или метакинез, при котором они то приближаются к полюсам, то уходят от них к центру веретена, пока не займут среднее положение, характерное для метафазы (конгрессия хромосом).
В начале прометафазы хромосомы, лежащие ближе к одному из полюсов образующегося веретена, начинают быстро к нему приближаться. Это происходит не одномоментно, но занимает определенное время. Было найдено, что такой первичный асинхронный дрейф хромосом к разным полюсам происходит с помощью микротрубочек. Используя видео-электронное усиление фазового контраста в световом микроскопе, удалось на живых клетках наблюдать, что отдельные отходящие от полюсов микротрубочки случайно достигают одного из кинетохоров хромосомы и связываются с ним, "захватываются" кинетохором. После этого происходит быстрое, со скоростью около 25 мкм\мин, скольжение хромосомы вдоль микротрубочки по направлению к её (-)-концу. Это приводит к тому, что хромосома приближается к полюсу, от которого произошла эта микротрубочка (рис. 317). Важно отметить, что кинетохоры могут контактировать с боковой поверхностью таких микротрубочек. Во время такого движения хромосомы микротрубочки не разбираются. Вероятнее всего, что за такое быстрое перемещение хромосом отвечает моторный белок, аналогичный цитоплазматическому динеину, обнаруженному в короне кинетохоров.
В результате такого первичного прометафазного движения хромосомы оказываются случайным образом приближены к полюсам веретена, где продолжает происходить образование новых микротрубочек. Очевидно, что чем ближе к центросоме будет находиться хромосомный кинетохор, тем будет выше случайность его взаимодействия с другими микротрубочками. В этом случае новые, растущие (+)-концы микротрубочек "захватываются" зоной короны кинетохора; теперь с кинетохором оказывается связанным пучок из микротрубочек, рост которых продолжается на их (+)-конце. При росте такого пучка кинетохор, а вместе с ним и хромосома, должен перемещаться к центру веретена, удаляться от полюса. Но к этому времени от противоположного полюса ко второму кинетохору другой сестринской хроматиды подрастают свои микротрубочки, пучок которых начинает тянуть хромосому к противоположному полюсу. Наличие такой тянущей силы доказывается тем , что если лазерным микролучом перерезать пучок микротрубочек у одного из кинетохоров, то хромосома начинает двигаться к противоположному полюсу (рис. 318). В нормальных же условиях хромосома, совершая небольшие перемещения в сторону то одного, то другого полюса, в результате постепенно занимает срединное положение в веретене. В процессе прометафазного дрейфа хромосом происходит удлинение, наращивание микротрубочек на (+)-концах, когда кинетохор движется от полюса, и разборка , укорачивание микротрубочек тоже на (+)-конце, когда сестринский кинетохор движется по направлению к полюсу.
Эти переменные движения хромосом то туда, то сюда приводят к тому, что они в конце концов оказываются в экваторе веретена и выстраиваются в метафазную пластинку (см. рис. 317).
Метафаза (рис. 311). В метафазе, также как и в других фазах митоза, несмотря на некоторую стабилизацию пучков микротрубочек, продолжается их постоянное обновление за счет сборки и разборки тубулинов. Во время метафазы хромосомы располагаются так, что их кинетохоры обращены к противоположным полюсам. В это же время происходит постоянная переборка и межполюсных микротрубочек, число которых в метафазе достигает максимума. Если на метафазную клетку посмотреть со стороны полюса, то можно видеть, что хромосомы располагаются так, что их центромерные участки обращены к центру веретена, а плечи - к периферии. Такое расположение хромосом носит название "материнской звезды" и характерно для клеток животных (рис. 319). У растений часто в метафазе хромосомы лежат в экваториальной плоскости веретена без строгого порядка.
К концу метафазы завершается процесс обособления друг от друга сестринских хроматид. Их плечи лежат параллельно друг другу, между ними хорошо видна их разделяющая щель. Последним местом, где контакт между хроматидами сохраняется, является центромера; вплоть до самого конца метафазы хроматиды во всех хромосомах остаются связанными в центромерных участках.
Анафаза начинается внезапно, что хорошо можно наблюдать при витальном исследовании. Анафаза начинается с разъединения всех сразу хромосом в центромерных участках. В это время происходит одновременная деградация центромерных когезинов, которые связывали до этого времени сестринские хроматиды. Такое одновременное отделение хроматид позволяет начать их синхронное расхождение. Хромосомы все вдруг теряют центромерные связки и синхронно начинают удаляться друг от друга по направлению к противоположным полюсам веретена (рис. 312, 320). Скорость движения хромосом равномерная, она может достигать 0,5-2 мкм/мин. Анафаза - самая короткая стадия митоза (несколько % от всего времени), но за это время происходит целый ряд событий. Главными из них являются сегрегация двух идентичных наборов хромосом и транспорт их в противоположные концы клетки.
При движении хромосом они меняют свою ориентацию и часто принимают V-образную форму. Вершина их направлена в сторону полюсов деления, а плечи как бы откинуты к центру веретена. Если перед анафазой произошел разрыв плеча хромосомы, то во время анафазы оно не будет участвовать в движении хромосом и останется в центральной зоне. Эти наблюдения показали, что именно центромерный участок вместе с кинетохором отвечает за движение хромосом. Создается впечатление, что за центромеру хромосома оттягивается к полюсу. У некоторых высших растений (ожика) нет выраженной центромерной перетяжки, и волокна веретена контактируют со многими точками на поверхности хромосом (полицентрические и голоцентрические хромосомы). В этом случае хромосомы располагаются поперек волокон веретена.
Собственно расхождение хромосом слагается из двух процессов: 1- расхождение хромосом за счет кинетохорных пучков микротрубочек, 2 - расхождение хромосом вместе с полюсами за счет удлинения межполюсных микротрубочек. Первый из этих процессов носит название "анафаза А", второй - "анафаза В" (рис. 320).
Во время анафазы А, когда группы хромосом начинают двигаться по направлению к полюсам, происходит укорачивание кинетохорных пучков микротрубочек. Можно было ожидать, что в этом случае деполимеризация микротрубочек должна происходить на их (-)-концах, концах ближайших к полюсу. Однако было доказано, что микротрубочки действительно разбираются, но большей частью (80%) с (+)-концов, прилежащих к кинетохорам. В эксперименте в живые клетки культуры ткани с помощью метода микроинъекции был введен тубулин, связанный с флуорохромом. Это позволяло витально видеть микротрубочки в составе веретена деления. В начале анафазы пучок веретена одной из хромосом был облучен световым микролучом примерно посередине между полюсом и хромосомой. При таком воздействии исчезает флуоресценция в облученном месте. Наблюдения показали, что облученный участок к полюсу не приближается, но хромосома достигает его при укорачивании кинетохорного пучка (рис. 321). Следовательно, разборка микротрубочек кинетохорного пучка происходит в основном с (+)-конца, в месте его соединения с кинетохором, а хромосома движется по направлению к (-)-концу микротрубочек, который расположен в зоне центросомы. Оказалось, что такое движение хромосом зависит от присутствия АТФ и от наличия достаточной концентрации ионов Са++. То, что в составе короны кинетохора, в которую вмонтированы (+)-концы микротрубочек, обнаружен белок динеин, позволило считать, что именно он является мотором, который подтягивает хромосому к полюсу. Одновременно с этим происходит деполимеризация кинетохорных микротрубочек на (+)-конце (рис. 322).
После остановки хромосом у полюсов происходит дополнительное их расхождение за счет удаления полюсов друг от друга (анафаза В). Показано, что при этом происходит наращивание (+)-концов межполюсных микротрубочек, которые могут значительно увеличиваться в длину. Взаимодействие между этими антипараллельными микротрубочками, приводящее к их скольжению друг относительно друга, определяется другими моторными кинезин-подобными белками. Кроме того, полюса дополнительно подтягиваются к периферии клетки за счет взаимодействия с астральными микротрубочками динеино-подобных белков на плазматической мембране.
Последовательность анафаз А и В и их вклад в процесс расхождения хромосом может быть различным у разных объектов. Так, у млекопитающих стадии А и В протекают практически одновременно. У простейших В анафаза может приводить к 15-кратному увеличению длины веретена. В растительных клетках стадия В отсутствует.
Телофаза начинается с остановки хромосом (ранняя телофаза, поздняя анафаза) (рис. 313, 314) и кончается началом реконструкции нового интерфазного ядра (ранний G1-период) и разделением исходной клетки на две дочерние (цитокинез) (таб. ).
В ранней телофазе хромосомы, не меняя своей ориентации (центромерные участки - к полюсу, теломерные - к центру веретена), начинают деконденсироваться и увеличиваться в объеме. В местах их контактов с мембранными пузырьками цитоплазмы начинает строиться новая ядерная оболочка, которая раньше всего образуется на латеральных поверхностях хромосом и позже - в центромерных и теломерных участках. После замыкания ядерной оболочки начинается формирование новых ядрышек. Клетка переходит в G1-период новой интерфазы.
В телофазе начинается и заканчивается процесс разрушения митотического аппарата - разборка микротрубочек. Он идет от полюсов к экватору бывшей клетки: именно в средней части веретена микротрубочки сохраняются дольше всего (остаточное тельце).
Одно из главных событий телофазы - разделение клеточного тела, цитотомия или цитокинез. Выше уже говорилось, что у растений деление клетки происходит путем внутриклеточного образования клеточной перегородки, а у клеток животных - путем перетяжки, впячивания плазматической мембраны внутрь клетки.
Митоз не всегда заканчивается разделением тела клетки. Так, в эндосперме многих растений могут некоторое время идти множественные процессы митотического деления ядер без деления цитоплазмы: образуется гигантский многоядерный симпласт. Так же без цитотомии синхронно делятся многочисленные ядра плазмодиев миксомицетов. На ранних этапах развития зародышей некоторых насекомых также происходит неоднократное деление ядер без деления цитоплазмы.
В большинстве случаев закладка перетяжки при делении клеток животных происходит строго в экваториальной плоскости веретена. Здесь в конце анафазы, в начале телофазы, образуется кортикальное скопление микрофиламентов, которые образуют сократимое кольцо (рис. 258). В состав микрофиламентов кольца входят актиновые фибриллы и короткие палочковидные молекулы из полимеризованного миозина II. Взаимное скольжение этих компонентов приводит к уменьшению диаметра кольца и к появлению вдавления плазматической мембраны, что в конце приводит к перетяжке исходной клетки надвое.
После цитотомии две новые (дочерние) клетки переходят в стадию G1 клеточного периода. К этому времени возобновляются цитоплазматические синтезы, происходит реставрация вакуолярной системы, диктиосомы аппарата Гольджи снова концентрируются в околоядерной зоне в ассоциации с центросомой. От центросомы начинается отрастание цитоплазматических микротрубочек и восстановление интерфазного цитоскелета.
Самоорганизация системы микротрубочек
Обзор становления митотического аппарата показывает, что для процесса сборки сложного ансамбля микротрубочек необходимо наличие как центров организации микротрубочек, так и хромосом.
Однако существует ряд примеров, показывающих, что образование цитастеров и веретен может идти независимо, путем самоорганизации. Было обнаружено, что если с помощью микроманипулятора отрезать часть цитоплазмы фибробласта, в которой не была бы расположена центриоль, то происходит спонтанная реорганизация системы микротрубочек. Вначале они в отрезанном фрагменте располагаются хаотически, но через некоторое время они собираются своими концами в звездоподобную структуру - цитастер , где на периферии клеточного фрагмента находятся (+)-концы микротрубочек (рис. 323). Сходная картина происходит с бесцентриолярными фрагментами меланофоров - пигментных клеток, несущих гранулы пигменты меланина. В этом случае происходит не только самосборка цитастера, но и рост микротрубочек от гранул пигмента, собранного в центре клеточного фрагмента.
В других случаях самосборка микротрубочек может приводить к образованию митотических веретен. Так, в одном из экспериментов был выделен цитозоль из делящихся яиц ксенопуса. Если в такой препарат поместить мелкие шарики, облепленные фаговой ДНК, то возникает митотическая фигура, где место хромосом занимают эти шарики ДНК, не имеющие кинетохорных последовательностей, а к ним примыкают два полуверетена, в полюсах которых нет никаких ЦОМТ.
Сходные картины наблюдаются и в естественных условиях. Так, например, при делении яйцеклетки дрозофилы при отсутствии центриолей вокруг группы прометафазных хромосом начинают хаотически полимеризоваться микротрубочки, которые затем перестраиваются в биполярное веретено и связываются с кинетохорами. Аналогичная картина наблюдается во время мейотического деления яйцеклетки ксенопуса. Здесь также вначале происходит спонтанная организация не ориентированных микротрубочек вокруг группы хромосом, а позже образуется нормальное биполярное веретено, в полюсах которого также отсутствуют центросомы (рис. 324).
Эти наблюдения привели к выводам, что в самоорганизации микротрубочек принимают участие моторные белки, кинезинопободные и динеиноподобные. Были обнаружены моторные (+)-концевые белки, хромокинезины, которые связывают хромосомы с микротрубочками и заставляют последние двигаться в направлении (-)-конца, что приводит к образованию конвергентной структуры типа полюса веретена. С другой стороны, динеин-подобные моторы, связанные с вакуолями или гранулами также могут перемещать микротрубочек так, что их (-)-концы будут стремиться образовывать конусовидные пучки, будут сходиться в центре полуверетен (рис. 325).
Похожие процессы происходят при образовании митотических веретен в растительных клетках.
Митоз растительной клетки
Митотическое деление клеток высших растений имеет ряд характерных особенностей, которые касаются начала и конца этого процесса.
В интерфазных клетках различных меристем растений микротрубочки располагаются в кортикальном подмембранном слое цитоплазмы, образуя кольцевые пучки микротрубочек (рис. 326). Периферические микротрубочки контактируют с ферментами, образующими фибриллы целлюлозы, с целлюлозосинтетазами, которые являются интегральными белками плазматической мембраны. Они синтезируют целлюлозу на поверхности плазматической мембраны. Считается, что в процессе роста целлюлозной фибриллы эти ферменты передвигаются вдоль подмембранных микротрубочек.
Митотическая перестройка элементов цитоскелета происходит в начале профазы. При этом исчезают микротрубочки в периферических слоях цитоплазмы, но в примембранном слое цитоплазмы в экваториальной зоне клетки возникает кольцевидный пучок микротрубочек - препрофазное кольцо, в которое входит более 100 микротрубочек (рис. 327). Иммунохимически в этом кольце обнаружен также актин. Важно отметить, что препрофазное кольцо микротрубочек располагается там, где в телофазе будет образовываться клеточная перегородка, разделяющая две новые клетки. Позднее в профаза это кольцо начинает исчезать, и новые микротрубочки появляются по периферии профазного ядра. Их число больше в полярных зонах ядер, они как бы оплетают всю ядерную периферию. При переходе к прометафазе возникает биполярное веретено, микротрубочки которого подходят к т.н. полярным шапочкам , в составе которых наблюдаются лишь мелкие вакуоли и неопределенной морфологии тонкие фибриллы; никаких признаков центриолей в этих полярных зонах не обнаруживается. Так формируется анастральное веретено.
В прометафазе при делении растительных клеток также наблюдается сложный дрейф хромосом, их осцилляция и перемещение такого же типа, какие встречаются в прометафазе клеток животных. События в анафазе также схожи с таковыми в астральном митозе. После расхождения хромосом возникают новые ядра, также за счет деконденсации хромосом и образования новой ядерной оболочки.
Процесс же цитотомии растительных клеток резко отличается от деления перетяжкой клеток животного происхождения (рис. 328). В данном случае в конце телофазы также происходит разборка микротрубочек веретена в полярных областях. Но микротрубочки основной части веретена между двумя новыми ядрами остаются, более того здесь происходит образование новых микротрубочек. Так образуются пучки микротрубочек, с которыми связаны многочисленные мелкие вакуоли. Эти вакуоли произошли от вакуолей аппарата Гольджи и содержат пектиновые вещества. С помощью микротрубочек многочисленные вакуоли движутся к экваториальной зоне клетки, где сливаются друг с другом и образуют в середине клетки плоскую вакуоль - фрагмопласт, который разрастается к периферии клетки, включая все новые и новые вакуоли (рис. 326, 327, 329).
Так происходит образование первичной клеточной стенки. В конце концов, мембраны фрагмопласта сливаются с плазматической мембраной: происходит обособление двух новых клеток, разделенных новообразованной клеточной стенкой. По мере расширения фрагмопласта пучки микротрубочек перемещаются все больше к периферии клетки. Вероятно, что процессу растяжения фрагмопласта, отодвигания на периферию пучков микротрубочек способствуют пучки актиновых филаментов, отходящих от кортикального слоя цитоплазмы в том месте, где было препрофазное кольцо.
После разделения клетки микротрубочки, участвовавшие в транспорте мелких вакуолей, исчезают. Новое поколение интерфазных микротрубочек образуется на периферии ядра, а затем располагается в кортикальном примембранном слое цитоплазмы.
Таково общее описание деления растительных клеток, однако этот процесс изучен крайне недостаточно. В полярных зонах веретен не обнаружены белки, входящие в состав ЦОМТ животных клеток. Было обнаружено, что в растительных клетках в этой роли может выступать ядерная оболочка, от которой (+)-концы микротрубочек направлены к периферии клетки, а (-)-концы к ядерной оболочке. При образовании же веретена кинетохорные пучки ориентированы (-)-концом к полюсу, и (+)-концом к кинетохорам. Как происходит такая переориентация микротрубочек остается не выясненным.
При переходе к профазе вокруг ядра появляется плотная сеть микротрубочек, напоминающая корзинку, которая затем по форме начинает напоминать веретено. При этом микротрубочки образуют ряд сходящихся пучков, направленных в сторону полюсов. Позднее в прометафазе происходит связь микротрубочек с кинетохорами. В метафазе кинетохорные фибриллы могут формировать общий центр схождения - миниполюса веретена, или центры конвергенции микротрубочек. Вероятнее всего, образование таких миниполюсов происходит за счет объединения (-)-концов микротрубочек, связанных с кинетохорами. Можно предположить, что в клетках высших растений процесс реорганизации цитоскелета, в том числе и образование митотического веретена, связан с самоорганизацией микротрубочек, которая, как и в клетках животных, происходит при участии моторных белков.
Деление бактериальных клеток
Обычно деление бактериальных клеток описывается как "бинарное": после удвоения нуклеоиды, связанные с плазматической мембраной, расходятся за счет растяжения мембраны между нуклеоидами, а затем образуется перетяжка или септа, делящая клетку надвое. Этот тип деления приводит к очень точному распределению генетического материала, практически без ошибок (менее 0,03 % дефектных клеток). Напомним, что ядерный аппарат бактерий, нуклеоид, представляет собой циклическую гигантскую (1,6 мм) молекулу ДНК, образующую многочисленные петлевые домены в состоянии сверхспирализации, порядок укладки петлевых доменов не известен.
Среднее время между делениями бактериальных клеток составляет 20-30 мин. А это период должен произойти целый ряд событий: репликация ДНК нуклеоида, сегрегация, отделение сестринских нуклеоидов, их дальнейшее расхождение, цитотомия за счет образования септы, делящей исходную клетку ровно пополам.
Весь ряд этих процессов находится под интенсивным вниманием исследователей последних лет, в результате были получены важные и неожиданные наблюдения. Так оказалось, что в начале синтеза ДНК, который начинается с точки репликации (origin), обе растущие молекулы ДНК изначально остаются связанными с плазматической мембраной (рис. 330). Одновременно с синтезом ДНК происходит процесс снятия сверхспирализации как старых, так и реплицирующихся петлевых доменов за счет целого ряда ферментов (топоизомеразы, гиразы, лигазы и др), что приводит к физическому обособлению двух дочерних (или сестринских) хромосом-нуклеоидов, которые еще находятся в тесном контакте друг с другом. После такой сегрегации нуклеоидов происходит их расхождение от центра клетки, от места их бывшего расположения. Причем это расхождение очень точное: на четверть длины клетки в двух противоположных направлениях. В результате этого в клетке располагаются два новых нуклеоида. Каков механизм этого расхождения? Делались предположения (Деламатер, 1953), что деление бактериальных клеток аналогично митозу эукариот, однако данных в пользу этого предположения долгое время не появлялось.
Новые сведения о механизмах деления бактериальных клеток были получены при изучении мутантов, в которых происходили нарушения клеточного деления.
Было обнаружено, что в процессе расхождения нуклеоидов принимают участие несколько групп специальных белков. Один из них, белок Muk В, представляет собой гигантский гомодимер (мол.масса около 180 кДа, длина 60 нм), состоящий из центрального спирального участка, и концевых глобулярных участков, напоминающий по структуре нитевидные белки эукариот (цепь миозина II, кинезина). На N-конце Muk В связывается с ГТФ и АТФ, а на С-конце - с молекулой ДНК. Эти свойства Muk В дают основания считать его моторным белком, участвующим в расхождении нуклеоидов. Мутации этого белка приводят к нарушениям расхождения нуклеоидов: в мутантной популяции появляется большое количество безъядерных клеток.
Кроме белка Muk В в расхождении нуклеоидов, по-видимому, участвуют пучки фибрилл, содержащих белок Caf A, который может связываться с тяжелыми цепями миозина, подобно актину (рис. 331).
Образование перетяжки, или септы также в общих чертах напоминает цитотомию животных клеток. В данном случае в образовании септ принимают участие белки семейства Fts (фибриллярные термочувствительные). Это группа из нескольких белков, среди которых наиболее изучен белок FtsZ. Этот белок сходен у большинства бактерий, архибактерий, обнаружен в микоплазмах и хлоропластах. Это глобулярный белок, сходный по своей аминокислотной последовательности с тубулином. При взаимодействии с ГТФ in vitro он способен образовывать длинные нитчатые протофиламенты. В интерфазе FtsZ диффузно локализуется в цитоплазме, его количество очень велико (5-20 тыс. мономеров на клетку). Во время деления клетки весь этот белок локализуется в зоне септы, образуя сократимое кольцо, очень напоминающее акто-миозиновое кольцо при делении клеток животного происхождения (рис. 332). Мутации по этому белку приводят к прекращению деления клеток: возникают длинные клетки, содержащие множество нуклеоидов. Эти наблюдения показывают прямую зависимость деления бактериальных клеток от наличия Fts-белков.
Относительно механизма образования септ существует несколько гипотез, постулирующих сокращение кольца в зоне септы, приводящее к разделению исходной клетки надвое. По одной из них протофиламенты должны скользить один относительно другого с помощью неизвестных еще моторных белков, по другой - сокращение диаметра септы может происходить за счет деполимеризации заякоренных на плазматической мембране FtsZ (рис. 333).
Параллельно образованию септы происходит наращивание муреинового слоя бактериальной клеточной стенки за счет работы полиферментативного комплекса РВР-3, синтезирующего пептидогликаны.
Таким образом, при делении бактериальных клеток участвуют процессы во многом сходные с делением эукариот: расхождение хромосом (нуклеоидов) за счет взаимодействия моторных и фибриллярных белков, образование перетяжки за счет фибриллярных белков, образующих сократимое кольцо. У бактерий в отличие от эукариот в этих процессах принимают участие совсем иные белки, но принципы организации отдельных этапов клеточного деления очень сходны.
Глава 25. Мейоз
Мейоз (от греч. meiosis - уменьшение) - особый способ деления клеток, деление созревания, в результате которого происходит редукция (уменьшение) числа хромосом и переход клеток их диплоидного состояния в гаплоидное. Мейоз - это особый тип дифференцировки, специализации клеток, который приводит к образованию половых клеток. Этот процесс занимает два клеточных цикла при отсутствии синтеза ДНК во втором мейотическом делении. Необходимо отметить, что мейоз представляет собой универсальное явление, характерное для всех эукариотических организмов. При мейозе происходит не только редукция числа хромосом до гаплоидного их числа, но происходит чрезвычайно важный генетический процесс - обмен участками между гомологичными хромосомами, процесс, получивший название кроссинговера.
Существует несколько разновидностей мейоза. При зиготном (характерном для аскомицетов, базимицетов, некоторых водорослей, споровиков и др.), для которых в жизненном цикле преобладает гаплоидная фаза, две клетки - гаметы сливаются, образуя зиготу с двойным (диплоидным) набором хромосом. В таком виде диплоидная зигота (покоящаяся спора) приступает к мейозу, дважды делиться, и образуется четыре гаплоидные клетки, которые продолжают размножаться.
Споровый тип мейоза встречается у высших растений, клетки которых имеют диплоидный набор хромосом. В данном случае в органах размножения растений, образовавшиеся после мейоза гаплоидные клетки еще несколько раз делятся. Другой тип мейоза, гаметный, происходит во время созревания гамет - предшественников зрелых половых клеток. Он встречается у многоклеточных животных, среди некоторых низших растений.
В случае гаметного мейоза характерно при развитии организма выделение клонов герминативных клеток, которые впоследствии будут дифференцироваться в половые клетки. И только клетки этих клонов будут при созревании подвергаться мейозу и превращаться в половые клетки. Следовательно, все клетки развивающихся многоклеточных животных организмов можно разделить на две группы: соматические - из которых будут образовываться клетки всех тканей и органов, и герминативные, которые дадут начало половым клеткам.
Такое выделение герминативных клеток (гоноцитов) обычно происходит на ранних стадиях эмбрионального развития (рис. 334). Так, детерминация гоноцитов у рачка циклопа происходит уже на первом делении зиготы: одна из двух клеток дает начало герминальным клеткам. У аскариды герминативные клетки или клетки "зародышевого пути" (А.Вейсман) выделяются на стадии 16 бластомеров, у дрозофилы - на стадии бластоцисты, у человека - первичные половые клетки (гонобласты) появляются на 3-ей неделе эмбрионального развития в стенке желточного мешка в каудальном отделе эмбриона.
Как и все клетки развивающегося организма, клетки зародышевого пути диплоидны. Они могут увеличиваться в числе путем обычного митоза, повторяя все стадии обычного клеточного цикла, где происходит чередование уровней количества ДНК и хромосом на клетку:
2n (2c) ? S-период? 4n (4c) ? 2 клетки 2n (2c) и т.д.
Однако на определенных стадиях развития при половом созревании особей этот обычный ход смены событий меняется. Герминативные клетки превращаются в гониальные (оогонии - женские и сперматогонии - мужские клетки - предшественники), и они вступают в процесс мейоза. При этом как для женских, так и для мужских клеток наступает первый цикл мейоза. На этой и следующей стадии половые клетки получили название сперматоцитов и ооцитов (I и II порядка).
В первом клеточном цикле мейоза происходит целый ряд событий, который его значительно отличает от обычного клеточного цикла. После вступления в I цикл созревания и сперматоциты I и ооциты I порядков синтезируют ДНК, её количеств удваивается, так же как удваивается за счет репликации количество хромосом. Следовательно, после S-периода эти клетки нужно считать (также как и соматические клетки после синтеза ДНК) тетраплоидными. После короткого G2-периода наступает профаза I мейотического деления, которая резко отличается от обычной мейотический профазы.
Особенности профазы I мейотического деления
Во-первых, эта стадия занимает большой отрезок времени (от суток до годов !). Во-вторых, она состоит из нескольких структурно-функциональных фаз (лептотена, зиготена, пахитена, диплотена, диакинез). Далее, в этот период происходит объединение, конъюгация, гомологичных (родительских) удвоенных в результате репликации хроматид, при этом образуются т.н. тетрады, т.е. хромосомные комплексы, состоящие из четырех хроматид (удвоенные материнские и удвоенные отцовские), которые соединены вместе с помощью специальной структуры - синаптинемного комплекса. В это же время происходит обмен участками между хроматидами гомологичных хромосом (но не между сестринскими хроматидами одного гомолога) - кроссинговер. Кроме того, в процессе конъюгации и обмена происходит синтез примерно 1,5% хромосомной ДНК.
В профазе I мейотического деления наблюдается рост объема ооцитов, в которых накапливаются запасные вещества, обеспечивающие ранние стадии развития будущего зародыша.
Эта профаза отличается также длительностью во времени, необходимого для прохождения перечисленных выше событий. Обычная соматическая профаза длится 0,5-1,5 часа. Мейотическая профаза сперматоцита I порядка у самцов мыши длится 12 суток, у человека - 24 дня (плюс еще около двух месяцев до полного созревания сперматозоида). Среди женских половых клеток профаза I порядка тритона обыкновенного длится около 1 года, у мыши от 4 месяцев до 3 лет, у человека профаза I ооцитов начинается на 3-ем месяце внутриутробного развития и может продолжаться до 50-летнего возраста женщины. При этом у человека происходит постепенная гибель заложенных ооцитов: у 3-х месячного эмбриона их около7х106 клеток, к рождению ребенка их остается около 2х106, к половому созреванию - 3х105, всего же созревает (овулируют) примерно 5х102 ооцитов.
Другой особенностью профазы I меойза является то, что в отличие от обычного митоза, хромосомы сохраняют ряд функциональных нагрузок, а именно: они способны к синтезу РНК, частичному синтезу ДНК, претерпевают ряд структурных перестроек. Другими словами, профазные хромосомы I мейотического деления не находятся в состоянии функционального покоя, а участвуют в целом ряде событий.
Стадии профазы I мейотического деления
Вся профаза I мейотического деления состоит из нескольких стадий: лептотена - стадия тонких нитей (хромосом), зиготена - стадия сливающихся (объединяющихся, конъюгирующих) нитей, пахитена - стадия толстых нитей, диплотена - стадия двойных нитей, диакинез - стадия расходящихся нитей (рис. 335).
Из всех стадий профазы I самой длительной является стадия пахитены, в ряде случаев она занимает до 50% времени.
Так, у человека при спермиогенезе стадии лептотены с зиготеной занимают 6,5 сут, пахатина- 15, диплотена и диакинез - 0,8; у мыши лептотена с зиготеной длятся около 3 суток, пахитена - 7 суток, диплотена с диакинезом - около 2 суток; у тритона лептотена занимает 5 сут, зиготена - 8, пахитена - 4-5, диплотена - 2 сут; у домашнего сверчка лептотена и зиготена занимают 2-3 сут, пахитена - 6-9, диплотена - 2. По сравнению с обычным митозом продолжительность деления клеток в процессе мейоза несравнимо длительнее. Это особенно наглядно видно при созревании женских половых клеток у животных, у которых яйцеклетки могут останавливаться в развитии на несколько месяцев и даже лет в стадии диплотены профазы I-го мейотического деления.
У растений мейоз также намного длиннее митоза по времени. Так, у традесканции весь мейоз занимает около 5 сут, из которых на профазу I-го деления приходится 4 сут, но встречаются виды, у которых мейоз идет со скоростью, соизмеримой с митозом.
Лептотена, или стадия тонких нитей, морфологически напоминает раннюю профазу митоза, но отличается тем, что при мейозе ядра обычно крупнее и хромосомы очень тонкие, так что проследить их по всей длине очень трудно (рис. 335а).
Длина каждой мейотической хромосомы на ранних стадиях мейоза может быть в 10-100 раз больше длины соответствующих митотических хромосом. Следовательно, мейотические хромосомы имеют меньшую степень компактизации, они примерно в 30 раз менее компактны, чем хромосомы в метафазе мейоза. В лептотене хромосомы удвоены, но сестринские хроматиды в них далеко не всегда удается различить (так же как в хромосомах в ранней профазе митоза). Таким образом, в лептотене содержится диплоидное количество (2n) сдвоенных сестринских хроматид, общее количество последних, как и при митозе, равно 4n вследствие редупликации в S-периоде.
Расположение хромосом в лептотене часто повторяет телофазную поляризацию ядра. При этом у некоторых животных хромосомы образуют так называемую фигуру "букета" - дугообразно изогнутые сближенные хромосомы, связанные своими теломерами с ядерной оболочкой. У некоторых растений в конце лептотены хромосомы собираются в клубок (синезис).
Характерным для лептотены является появление на тонких хромосомах сгустков хроматина - хромомеров, которые как бы нанизаны в виде бусинок и располагаются по всей длине хромосомы. Число, размер и расположение таких хромомерных участков характерны для каждой хромосомы. Это позволяет составлять морфологические карты хромосом и использовать их для цитологического анализа. Число хромомеров различно у разных объектов: всего у тритона на 12 хромосомах их 2,5 тыс., у сверчка - около 200, у риса на 24 хромосомы - 645.
В лептотене начинает выявляться следующий, чрезвычайно важный и характерный для мейоза процесс конъюгации гомологичных хромосом, их сближение, которое начинается в теломерных участках, связанных с ядерной оболочкой. В этих местах образуется сложная специальная структура - тяж белковой природы, синаптонемный комплекс, который позже, в зиготене свяжет гомологичные удвоенные хроматиды по всей их длине.
Зиготена - стадия прохождения конъюгации гомологичных хромосом (синапсис). При этом гомологичные хромосомы (уже двойные после S-периода) сближаются и образуют новый хромосомный ансамбль, никогда до этого не встречающийся при клеточном делении, - бивалент (рис. 336). Биваленты - это парные соединения удвоенных гомологичных хромосом, т.е. каждый бивалент состоит из четырех хроматид. Таким образом, число бивалентов на ядро будет равно гаплоидному числу хромосом. Такой порядок объединения виден и на следующей, пахитенной стадии, а на стадии зиготены он только начинается, и видимо, именно эта стадия как-то определяет течение данного процесса, во многом еще непонятного. Действительно, как в пространстве ядра хромосомы находят не просто соседа, а только одного специфического гомолога, как они располагаются один около другого - эти вопросы еще до конца не выяснены.
Однако было найдено, что, в отличие от митоза, в профазе мейоза, а именно на зиготенной стадии синтезируется небольшое (0,3% от всей ДНК клетки) количество специфической ДНК, получившей название zДНК. У лилейных zДНК обогащена Г-Ц парами, состоит из уникальных последовательностей нуклеотидов. Эта ДНК распределена небольшими участками по всей длине хромосом лилии. При обычном митотическом цикле она синтезируется одновременно с основной массой ДНК, но при мейозе - только в зиготенной стадии. Было обнаружено, что если на стадии зиготены подавить с помощью ингибиторов этот небольшой дополнительный синтез ДНК, то конъюгация хромосом прекратится. На основании полученных данных было сделано предположение, что специфические по своему строению участки zДНК на гомологичных хромосомах еще на G2-стадии интерфазы ооцита "узнают" друг друга и на некоторое время образуют стабильные связи, необходимые для закрепления хромосом одна вдоль другой. Позднее эта связь осуществляется уже с помощью иной структуры, а именно с помощью синаптонемного комплекса (рис. 337). Объединение гомологов чаще всего начинается в теломерах и центромерах. В этих местах, а позднее и в других по всей длине соединяющихся хромосом происходит сближение осевых тяжей на расстояние около 100 нм, между ними образуются связки, и так происходит формирование полной структуры синаптонемного комплекса. По мере сближения и связывания гомологов этот комплекс растет подобно тому, как действует застежка "молния": две ленты объединяются в одну. В конце зиготены все гомологи не только нашли друг друга, но и тесно объединились с помощью синаптонемной структуры (рис. 338).
Синаптонемный комплекс (СК) встречается практически у всех представителей эукариот, которые обладают половым процессом. Он обнаружен у простейших, водорослей, низших и высших грибов, у высших растений и у животных. По своей морфологии он имеет вид трехслойной ленты, состоящей из двух боковых компонентов - тяжей (толщиной 30-60 нм), центрального осевого элемента (толщиной 10-40 нм); боковые компоненты отстоят друг от друга на 60-120 нм, общая ширина комплекса 160-240 нм (рис. 339). Материал хромосом располагается снаружи от боковых элементов. Каждый боковой элемент связан с петлями двух сестринских хроматид одного гомолога. Большая часть ДНК этих хроматид находится вне СК, и лишь менее 5% геномной ДНК входит в его состав, прочно ассоциируясь с белками СК. В состав этой ДНК входят уникальные и умеренно повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Белковый состав СК сложен, он состоит более чем из 10 мажорных белков с мол.массами от 26 кДа до 190 кДа.
Полное сближение бивалентов и их скрепление с помощью СК происходит на следующей стадии, на стадии пахитены.
Пахитена - стадия толстых нитей, Называется так потому, что благодаря полной конъюгации гомологов профазные хромосомы как бы увеличились в толщине. Число таких толстых пахитенных хромосом гаплоидно (1n), но они состоят из двух объединившихся гомологов, каждый из которых состоит из двух сестринских хроматид. Следовательно, и здесь количество ДНК равно 4c, а число хроматид - 4n.
На этой стадии происходит второе, чрезвычайно важное событие, характерное для мейоза - кроссинговер, взаимный обмен идентичными участками по длине гомологических хромосом. Генетическим следствием кроссинговера является рекомбинация сцепленных генов. Здесь возникают отличные от исходных хромосомы, содержащие отдельные участки, пришедшие от их гомологов. Морфологически этот процесс в пахитене уловить нельзя. Но в дальнейшем, в диплотене, когда начинают расходиться биваленты, они остаются связанными в нескольких точках, хиазмах, которые считают соответствующими местам обмена (рис. 340).
Было обнаружено, что в пахитене также происходит синтез небольшого количества ДНК (1% от генома), отличающейся тем, что она содержит повторяющиеся последовательности нуклетидов. Но этот синтез репаративен, в результате его не образуются дополнительные или недостающие количества ДНК, а происходит восстановление утраченных. Весь процесс объединения и обмена между ДНК несестринских хроматид гомологов можно представить следующим образом. По длине хромосомы разбросаны участки повторяющихся последовательностей ДНК, которые при разрывах с помощью специальных ферментов легко могут образовать гибридные молекулы. Сшивание и восстановление целостности молекул с помощью специальных репаративных ферментов приводит к включению предшественников в ДНК на стадии пахитены. По всей вероятности, в этом процессе принимает участие т.н. рекомбинационный узелок - большой белковый ансамбль величиной около 90 нм. Он располагается в синаптонемном комплексе между гомологичными хромосомами, его расположение совпадает с местами хиазм, где происходит кроссинговер. В конечном результате в мейозе после второго деления произойдет не только образование гамет с гаплоидным числом хромосом, но в каждой гамете могут быть хромосомы иных свойств, чем в исходных клетках.
В пахитенной стадии начинается активация транскрипционной активности хромосом. Именно в это время в женских половых клетках происходит амплификация рибосомных генов, что приводит к появлению дополнительных ядрышек. На этой же стадии начинают активироваться некоторые хромомеры и изменяется структура хромосом; они приобретают вид "ламповых щеток" ("ершиков" для чистки посуды). Особенно отчетливо эти изменения видны на стадии диплотены.
Диплотена - стадия двойных нитей (рис. 339). На этой стадии мейоза происходит отталкивание гомологов друг от друга, которое часто начинается в зоне центромер. Но при этом пары сестринских хроматид каждой гомологичной хромосомы остаются соединенными между собой в центромерных районах и по всей длине. В это время сестринские хроматиды отчетливо выявляются в световом микроскопе. По мере отталкивания хромосом в бивалентах хорошо видны хиазмы - места перекреста и сцепления хромосом. Только в этих участках сохраняется структура синаптонемального комплекса ; в разошедшихся районах он исчезает. Расположение хиазм может быть различным у разных видов на разных хромосомах. Более длинные хромосомы имеют больше хиазм, чем короткие, но и самые короткие могут иметь одну хиазму на бивалент. Если имеется одна точка контакта, то бивалент приобретает вид креста, если две - то вид петли или ряда петель, если хиазм больше двух (рис. 340).
В диплотенной стадии происходит некоторое укорачивание и конденсация хромосом, в результате чего отчетливо выявляется их 4-нитчатая структура. В зоне хиазм при этом видно, что в перекрест вовлекаются только две хроматиды из четырех - по одной от каждого гомолога (рис. 341).
На этой стадии хромосомы приобретают вид "ламповых щеток" (см. рис. 104). На выделенных хромосомах этой стадии видно, что каждый гомолог в биваленте окружен как бы войлоком, состоящим из петлистых нитчатых структур. При этом было обнаружено, что петли парносимметричны, и каждая пара отходит от хромомера, расположенного на хромосомной оси. Эта ось не что иное, как две спаренные сестринские хроматиды, а хромомеры - это двойные участки конденсированного хроматина, петли же представляют собой деконденсированные участки активного, функционирующего хроматина. Характерным является то, что они содержат большие количества РНК, которая здесь же и синтезируется. Эта РНК относится по своим характеристикам к информационной.
Наличие активных хромосом в диплотене резко отличает мейоз от митоза, где, начиная с профазы, полностью прекращается синтез РНК. Активация транскрипции в пахитене и особенно в диплотене часто совпадает с ростом формирующихся половых клеток, что особенно характерно для ооцитов. Как раз в это время клетка интенсивно синтезирует и запасает белки, необходимые для обеспечения ранних стадий развития зародыша. Для этого происходит синтез огромного количества рибосом на амплифицированных ядрышках и информационной РНК на боковых петлях хромосом.
Диакинез характеризуется уменьшением числа хиазм, укорочением бивалентов, потерей ядрышек. Биваленты приобретают более компактную форму, места соединения гомологичных хромосом оказываются расположенными на их концах терминально. Хромосомы теряют связи с ядерной оболочкой. Эта стадия является переходной к собственно делению клетки. В метафазе I деления мейоза биваленты выстраиваются (как и полагается для метафазы) в экваториальной плоскости веретена.
В анафазе I деления совершается еще одно важнейшее событие - расхождение хромосом. Но, в отличие от митоза, расходятся не сестринские хроматиды, а гомологичные хромосомы, состоящие из двух сестринских хроматид (рис. 342). Если оценивать события этой фазы, то видно, что при анафазе по разным клеткам расходятся аллельные гены, располагающиеся в разных гомологах. Распределение же гомологов по клеткам совершенно случайное, так что происходит смешение, перекомбинация хромосом из разных пар. Если оценивать образовавшиеся хромосомные наборы, от оба они содержат по 2с количества ДНК и по 2n числа хроматид, ибо каждая хромосома в паре гомологов состоит из двух хроматид. В этом отношении редукции числа хромосом (хроматид) еще не произошло, но в два раз произошло уменьшение генетической разнородности, так как теперь в каждом хромосомном наборе нет аллельных генов.
Вслед за телофазой I деления следует короткая интерфаза, в которой не происходит синтеза ДНК, и клетки приступают к следующему делению, которое по морфологи и последовательности не отличается от митотического деления: парные сестринские хроматиды, связанные в центромерных участках, проходят профазу и метафазу; в анафазе они разъединяются и расходятся по одной в дочерние клетки. Таким образом, при II мейотическом делении клетка с 2с количеством ДНК и 2n числом хроматид, делясь, дает начало двум клеткам с гаплоидным содержанием ДНК и хромосом. В отношении числа структурных единиц, хроматид, II деление мейоза является редукционным. Однако термин "редукционный" употребляется также и в общегенетическом смысле и относится к расщеплению аллелей, и в этом смысле редукционным является I деление мейоза, когда в клетки попадает по одной из аллелей (рис. 343).
В результате всего процесса мейоза после двух делений из одной клетки образуются четыре гаплоидных, каждая из которых отличается по своей генетической конституции (рис. 344).
Как во время митоза, так и при расхождении хромосом в I и II делении мейоза происходит случайное распределение хромосом по дочерним клеткам. Это и создает генетическое разнообразие в возникающих гаплоидных половых клетках. Так, например, в диплоидных клетках с числом хромосом равным двум после мейоза образуется 4 различные клетки. Т.е. число вариантов будет равно 2n. У человека же после меойза может возникнуть несколько миллионов различающихся клеток, даже если будет исключен кроссинговер, который увеличит это разнообразие еще во много раз.
Завершение мейоза для мужских и женских гоноцитов различное. При мейозе сперматогониев возникают 4 одинаковых по размеру сперматоцита, которые затем дифференцируются в сперматозоиды.
При мейозе оогоний картина иная. Первое деление созревания ( I мейотическое деление) приводит к тому, что от большого ооцита отделяется мелкая клетка - направительное тельце. При II делении происходит также неравное деление: от ооцита отделяется второе направительное тельце, а первое также делится. Поэтому возникают четыре клетки: крупная зрелая яйцеклетка и три мелких направительных тельца, которые быстро дегенерируют.
Глава 26. Регуляция клеточного цикла
Клеточный цикл представляет собой однонаправленный процесс, где клетка последовательно проходит разные его периоды, без их пропуска или возврата к предыдущим стадиям. Вступив в клеточный цикл, клетка его заканчивает синтезом ДНК и делением клетки (рис. 345).
Однако, как уже говорилось, клетки могут выходить из цикла, переходить в стадию покоя, или в G0-стадию. В многоклеточных организмах многие клетки теряют способность к пролиферации, к размножению, теряют способность переходить из стадии покоя в первую стадию пролиферации, в G1-стадию, которая начинает путь клетки к ее делению. К таким клеткам относятся нейроны, кардиомиоциты, клетки хрусталика и многие другие. Существуют также органы с редко делящимися клетками; так, например, клетки печени могут входить в клеточный цикл через несколько месяцев покоя. Быстро размножающиеся клетки взрослых организмов, такие как кроветворные, или базальные клетки эпидермиса и тонкой кишки могут входить в клеточный цикл каждые 12-36 часов. Самые короткие клеточные циклы, около 30 мин, наблюдаются при быстром дроблении яиц низших организмов (иглокожие, земноводные). В экспериментальных условиях короткий (20 час) клеточный цикл имеют многие линии клеточных культур.
Что определяет вступление клеток в пролиферацию и что определяет закономерную последовательность смены периодов клеточного цикла - эти вопросы долгое время оставались без ответа.
Считалось, что для начала вступления в клеточный цикл необходим рост живой массы клетки, образование веществ для деления, в частности ДНК и белка, создания определенного уровня энергетических запасов и т.д.
Фактор стимуляции митоза
Расшифровка регуляции процессов клеточного деления началась в 70е годы прошлого века, когда были найдены методы слияния разных клеток, методы получения гетерокарионов (о них см. главу 2). Оказалось, что можно получить слияние не только интерфазных клеток с интерфазными, но и интерфазных с митотическими клетками (рис. 114). При этом обнаружилось удивительное удивительное явление: в такой гибридной клетке, где были митотические хромосомы одной из исходных клеток, в ядрах от интерфазных клеток начиналась конденсация хромосом, разрушалась ядерная оболочка и образовывались т.н. преждевременно конденсированные хромосомы (ПКХ или РСС - preliminary condenced chromosomes). Причем структура ПКХ зависела от стадии интерфазного ядра: в ядре от G1 клетки появлялись однонитчатые длинные ПКХ, в ядре от G2 клетки ПКХ были двойными (т.к. после S-периода хромосомы удвоились). Эти наблюдения наводили на мысль, что при слиянии таких клеток на интерфазные ядра действуют какие-то факторы, содержащиеся в митотических клетках.
Для проверки этого предположения были поставлены опыты со слиянием клеток на разных стадиях клеточного цикла (см.табл.)
Таблица. Результаты слияния клеток на разных стадиях (G1, S, G2 ,M) клеточного цикла
Исходные клетки
гетерокарион
G2? G1
Нет влияния
S ? G1
Синтез ДНК
S ? G2
Нет влияния
M ? G1
М (ПКХ)
M ? S
М (ПКХ)
M ? G2
М (ПКХ)

Эти эксперименты были дополнены тем, что часть цитоплазмы митозной клетки инъецировали в цитоплазму G1-интерфазной клетки. Это приводило к появлению в ядре интерфазной клетки ПКХ. Из этих наблюдений был сделан ввод о том, что в цитоплазме митотической клетки есть фактор (или факторы), стимулирующие митоз (ФСМ или MPF - mitosis promoting factor). Этот фактор вызывает не только конденсацию хромосом, но и приводит к распаду ядерной оболочки, т.е. переводит интерфазную клетку, даже без синтеза ДНК, в митотическое состояние (конечно, дальше появления конденсированных хромосом развитие митоза не идет).
Параллельно с этими наблюдениями были проведены эксперименты на созревающих и дробящихся яйцеклетках лягушек X.laevis (рис. 346).
Ооцит X.laevis после репликации ДНК и короткой G2-стадии переходит в мейотическую профазу I, во время которой в течение 8 месяцев происходит рост и созревание ооцита, он дорастает до размера зрелой икринки. При спаривании овариальные клетки самки выделяют гомон прогестерон, который стимулирует переход из профазы в I мейотическое деление (митоз I), затем после короткой интерфазы наступает II мейотическое деление, которое на некоторое время останавливается на стадии метафазы (стадия яйца). При оплодотворении спермием метафаза завершается, происходит второе деление меойза, после чего гаплоидное ядро яйцеклетки сливается с ядром спермия, и образуется диплоидная зигота. После этих событий следуют через каждые 30 мин многочисленные деления клеток развивающейся бластулы (рис. 346а).
Если взять с помощью микроманипулятора небольшую часть цитоплазмы из ооцита на стадии метафазы II мейотического деления и инъецировать ее в цитоплазму не стимулированного прогестероном ооцита, то произойдет повторение описанного выше процесса: ооцит вступит в I деление мейоза, а затем и во II деление, т.е. произойдет его созревание (рис. 346в). Таким образом было найдено, что в ооците на стадии метафазы II деления в цитоплазме существует фактор (или факторы), стимулирующие созревание яйцеклетки (ФСС или MPF - maturation promoting factor).
Оказалось, что этот фактор (будем называть его MPF) присутствует в клетках только во время митотического состояния. Он обнаруживается также и во время дробления яйцеклетки (рис. 347). Таким образом, уровень MPF в интерфазных клетках низкий, а в митотических высокий.
Далее было найдено, что при инъекции цитоплазмы из митотических клеток культуры ткани в нестимулированный ооцит X. laevis, происходит созревание ооцита. Следовательно, фактор, стимулирующий митоз и фактор, стимулирующий созревание ооцитов - одно и тоже.
Этот фактор, MPF, был выделен и охарактеризован. Это гетеродимерный комплекс, состоящий из белка циклина (см. ниже) и зависимой от циклина протеинкиназы (Cyclin dependent kinase - Сdk), фермента, относящегося к фосфорилазам, который модифицирует белки, перенося фосфатную группу от АТФ на аминокислоты серин и треонин. Следовательно, MPF состоит из двух субъединиц: каталитической (Сdk) и регуляторной (циклин) (рис. 348).
Циклины
Циклин был обнаружен при изучении включения меченых аминокислот в синхронно дробящиеся яйца морского ежа. Было обнаружено, что в одном из белковых пиков на электрофореграммах метка периодически то появляется, то исчезает: она появлялась после клеточного деления, постепенно возрастала к митозу, а затем ее уровень падал после анафазы, и потом снова начинал возрастать в следующей интерфазе. Этот белок был назван циклином. Он постоянно синтезируется в течение эмбрионального клеточного цикла и резко разрушается при вступлении в анафазу. Подобный митотический циклин В был обнаружен у всех эукариот, в том числе и у X. laevis.
В раннем эмбриогенезе, т.е. при дроблении яиц X. laevis, первые 12 делений идут друг за другом при минимальной величине G1 и G2 периодов, и возрастание уровня MPF происходит во время каждого деления. Интересно, что дробление яиц и циклические изменения активности MPF происходят также без участия ядер. Это значит, что для появления активности MPF не нужна транскрипция информационных РНК. В этот период все клеточные белковые синтезы идут на долгоживущих матричных РНК, синтезированных еще во время роста ооцитов в мейотической профазе.
Расшифровка природы активности MPF была получена на модельных экспериментах с использованием цитоплазматических экстрактов активированных яиц X. laevis. В этих экстрактах были все компоненты для поддержания клеточного цикла: ферменты и предшественники для синтеза ДНК, гистоны и другие белки и липиды для образования ядерной оболочки, так же как и мРНК, необходимая для синтеза белков, и в том числе циклина В.
Если к такому экстракту добавить хроматин из спермиев X. laevis, то вокруг хроматина образуется ядерная оболочка, затем происходит синтез ДНК, следует конденсация хромосом, разрушается ядерная оболочка, образуется митотическая фигура, и потом наступает интерфаза, и цикл повторяется через каждые 20 мин снова и снова. По мере прохождения каждого цикла происходило сначала нарастание циклина В в интерфазе параллельно возрастанию активности MPF. В митозе после анафазы количество циклина В и активность MPF падали, т.е. происходило циклическое изменение двух параметров (рис. 349). По мере возрастания уровня MPF при повышении активности Сdk происходила конденсация хромосом за счет фосфорилирования конденсинов и гистона Н1, распад ядерной оболочки при фосфорилировании ламинов, образование веретена деления, т.е. все атрибуты митотического аппарата.
Подавление синтеза белка циклогексимидом или разрушение всей mРНК с помощью РНК-азы полностью снимало циклику MPF и циклина В. Если после действия РНК-азы и при последующем ее удалении ввести в экстракты mРНК только для циклина В, то периодические изменения уровней MPF и циклина В восстанавливаются (рис. 349в). Эти данные говорят о том, что в системе MPF только циклин В синтезируется в интерфазе и деградирует в анафазе. В то время как второй компонент, а именно протеинкиназа Сdk существует долгое время и активируется при появлении циклина В.
Деградация циклина В в анафазе вызывается сложной цепочкой белковых взаимодействий, которая приводит к его расщеплению с помощью сложных белковых протеолитических комплексов - протеосом. Кроме того, в начальных этапах деградации циклина участвует сложный белковый комплекс АРС (комплекс стимулирующий анафазу), который не только подготавливает циклин к деградации, но одновременно приводит к деградации когезинов, удерживающих хроматиды друг с другом вплоть до анафазы.
Общая схема регуляции митотического циклина В и MPF в циклирующих клетках может быть представлена на рис 350.
Регуляция клеточного цикла у млекопитающих
На предыдущей схеме рассмотрены только конечные звенья цепи событий, заканчивающихся делением клетки. Однако, как уже говорилось, деление клетки обязательно связано с репликацией ДНК. Следовательно, должны существовать механизмы, регулирующие запуск синтеза ДНК, а этому должны предшествовать события G1-периода, подготавливающие начало S-периода. Оказалось, что комплексы Сdk - митотический циклин В - это только конечный этап регуляции клеточного цикла. На самом же деле от начала вхождения в клеточный цикл до его завершения в клетке работает каскад комплексов Сdk-циклин. Так, у дрожжей один и тот же Сdk отвечает за прохождение цикла, но на разных его стадиях он взаимодействует с разными циклинами, характерными для каждой стадии клеточного цикла.
У млекопитающих в реализации всего цикла участвуют 9 различных циклинов и 7 разных Сdk (рис. 351). Но что является пусковым механизмом для вхождения клеток в цикл из состояния покоя, из G0-стадии? Мы видели, что для активации клеточного цикла ооцита X. laevis необходимо первоначальное воздействие гормона прогестерона, который в данном случае является фактором роста (ФР или GF) или пролиферации.
Было найдено, что существует множество факторов роста, побуждающих клетки к размножению. Они могут быт собственными продуктами данных клеток (аутокринная стимуляция) или других соседних (паракринная стимуляция), или даже клеток других органов (гормональная стимуляция). Так, например, фактор роста из тромбоцитов (PDGF) стимулирует пролиферацию клеток соединительной ткани, эпидермальный ФР (EGF) стимулирует размножение многих типов клеток, работает как сигнальный белок при эмбриональном развитии; ФР нервов (NGF) вызывает рост отдельных типов нейронов; эритропоэтин вызывает пролиферацию предшественников эритроцитов и т.д.
Хорошим примером зависимости пролиферации клеток от факторов роста могут служить клеточные культуры. Было найдено, что для размножения многих клеточных культур, кроме питательных сред, необходимо добавление сывороток крови или эмбриональных экстрактов. Оказалось, что именно в этих добавках содержатся ФР. Без них клетки переходят в G0-стадию, а затем погибают. Для роста нервных клеток в культуре требуется добавление в среду фактора роста нервов (NGF).
Эти разные ФР связываются на поверхности клеток со своими рецепторами и передают сигнал через вторичные мессенджеры (например, цАМФ) на систему внутриклеточного каскада протеинкиназ (фосфорилаз), связанных с запуском клеточного цикла. Сначала активируются гены раннего ответа, белки которых индуцируют транскрипцию генов отложенного ответа, некоторые из них сами являются факторами транскрипции, а также индуцируют синтез некоторых циклинов и cdk, которые отсутствовали в G0-периоде.
Так, вначале синтезируются белки Сdk и циклины, характерные для G1-стадии, затем для S-фазы и потом для митоза (рис. 352). В G1-стадии комплекс Сdk-циклин (G1- CDK) фосфорилирует факторы транскрипции, необходимые для активации экспрессии генов, ответственных за образование синтетического комплекса S-CDK, который после образования инактивируется специальным ингибитором. В конце G1-периода комплекс G1 - CDK фосфорилирует этот ингибитор, который отделяется от комплекса S-CDK, тем самым его активируя. При этом в первоначальном комплексе G1--CDK циклин деградирует. Активированный S-CDK комплекс индуцирует S-фазу, фосфорилируя белки регуляторного участка ДНК, связанных с точками начала репликации. После этого циклин в этом комплексе также деградирует. После активации S-периода происходит репликация ДНК. Во время S-периода и в начале G2-периода происходит синтез нового, митотического комплекса, М-CDK, определяющего вхождение клетки в митоз. Однако до окончания синтеза ДНК он находится в неактивном состоянии и активируется путем дефосфорилирования. После активации этого комплекса, он участвует в фосфорилировании белков хроматина, что приводит к конденсации хромосом, белков ламины, которые деполимеризуются, и при этом разрушается ядерная оболочка, фосфорилирует ряд белков, ассоциированных с микротрубочками при образовании веретена деления. После ассоциации микротрубочек с хромосомами происходит активация АРС (комплекс стимуляции анафазы), деградация когезинов, вслед за чем наступает анафаза, и активация протеолиза митотических циклинов. После расхождения хромосом и цитотомии в раннем G1-периоде следующего цикла новые комплексы G1-СDK фосфорилируют АРС, инактивируя их, что способствует впоследствии накоплению митотических циклинов.
Контрольные точки клеточного цикла
Наличие контрольных точек в клеточном цикле необходимо для определения завершения его каждой фазы. Остановка клеточного цикла происходит при повреждении ДНК в G1-периоде, при неполной репликации ДНК в S-фазе, при повреждении ДНК в G2-периоде, и при нарушении связи веретена деления с хромосомами.
Одним из контрольных пунктов в клеточном цикле является собственно митоз, который не переходит в анафазу при неправильной сборке веретена и при отсутствии полных связей микротрубочек с кинетохорами. В этом случае не происходит активации АРС-комплекса, не происходит деградации когезинов, соединяющих сестринские хроматиды, и деградации митотических циклинов, что необходимо для перехода в анафазу.
Повреждения ДНК препятствуют вхождению клеток в S-период или в митоз. Если эти повреждения не катастрофические и могут быть восстановлены за счет репаративного синтеза ДНК, то блок клеточного цикла снимается, и цикл доходит до своего завершения. Если же повреждения ДНК значительные, то каким-то образом происходит стабилизация и накопление белка р53, концентрация которого в норме очень низкая из-за его нестабильности. Белок р53 является одним из факторов транскрипции, который стимулирует синтез белка р21, являющегося ингибитором комплекса CDK-циклин. Это приводит к тому, что клеточный цикл останавливается на стадии G1 или G2. При блоке в G1-периоде клетка с повреждением ДНК не вступает в S-фазу, так как это могло бы привести к появлению мутантных клеток, среди которых могут быть и опухолевые клетки. Блокада в G2-периоде также предотвращает процесс митоза клеток с повреждениями ДНК. Такие клетки, с блокированным клеточным циклом, в дальнейшем погибают путем апоптоза, программированной клеточной гибели (рис. 353)
При мутациях, приводящих к потере генов белка р53 или при их изменениях, блокады клеточного цикла не происходит, клетки вступают в митоз, что приводит к появлению мутантных клеток, большая часть из которых нежизнеспособна или же часть из них дает начало злокачественным клеткам.
Глава 27. Гибель клеток: некроз и апоптоз
Гибель (смерть) отдельных клеток или целых их групп постоянно встречается у многоклеточных организмов, так же как гибель одноклеточных организмов. Причины гибели, процессы морфологического и биохимического характера развития клеточной смерти могут быть различными. Но все же их можно четко разделить на две категории: некроз (от греч. nekrosis - омертвление) и апоптоз (от греч. корней, означающих "отпадение" или "распадение"), который часто называют программируемой клеточной смертью (ПКС) или даже клеточным самоубийством (рис. 354).
Некроз
Этот вид клеточной смерти обычно связывается с нарушением внутриклеточного гомеостаза в результате нарушения проницаемости клеточных мембран, приводящим к изменению концентрации ионов в клетке, с необратимыми изменениями митохондрий, что сразу приводит к прекращению всех жизненных функций, включая синтез макромолекул. Некроз вызывают повреждения плазматической мембраны, подавление активности мембранных насосов под действием многих ядов, а также необратимые изменения энергетики при недостатке кислорода (при ишемии - закупорке кровеносного сосуда) или отравлении митохондриальных ферментов (действие цианидов). При этом при повышении проницаемости плазматической мембраны клетка набухает за счет ее обводнения, в цитоплазме происходит увеличение концентрации ионов Na+ и Ca2+, закисление цитоплазмы, набухание вакуолярных компонентов и разрыв их мембран, прекращение синтеза белков в цитозоле, освобождение лизосомных гидролаз и лизис клетки. Одновременно с этими изменениями в цитоплазме изменяются и клеточные ядра: вначале они компактизируются (пикноз ядер), но по мере набухания ядра и разрыва его оболочки пограничный слой хроматина распадается на мелкие массы (кариорексис) а затем наступает кариолизис, растворение ядра. Особенностью некроза является то, что такой гибели подвергаются большие группы клеток (например, при инфаркте миокарда из-за прекращения снабжения кислородом участка сердечной мышцы). Обычным является то, что участок некроза подвергается атаке лейкоцитов и в зоне некроза развивается воспалительная реакция (рис. ).
Апоптоз
В процессе развития организмов и их функционировании во взрослом состоянии постоянно происходит гибель части клеток, но без их физического или химического повреждения, происходит как бы их "беспричинная" смерть.
Гибель клеток происходит практически на всех стадиях онтогенеза. Многочисленны примеры отмирания клеток без повреждения при эмбриогенезе. Так отмирают клетки вольфова и мюллерова каналов при развитии мочеполовой системы у позвоночных, погибает часть нейробластов и гонадоцитов, погибают клетки при метаморфозах насекомых и амфибий (резорбция хвоста у головастика и жабер у тритона) и т.д.
Во взрослом организме также постоянно происходит "спонтанная" гибель клеток. Миллионами погибают клетки крови нейтрофилы, клетки эпидермиса кожи, клетки тонкого кишечника - энтероциты. Погибают фолликулярные клетки яичника после овуляции, погибают клетки молочной железы после лактации. Таких примеров много. Особенно много примеров гибели клеток без непосредственного их повреждения при различных патологических процессах. Например, кастрация (удаление семенников) вызывает гибель клеток простатической железы, удаление гипофиза приводит к гибели клеток надпочечников. Другой пример - гибель шванновских клеток при дегенерации аксона. Шванновские клетки в поврежденном периферическом нерве взрослого животного, так же как и клетки-сателлиты и чувствительные нейроны в соответствующих спинномозговых узлах, погибают.
Эти наблюдения наводят на мысль, что клеточная смерть регулируется межклеточными взаимодействиями различным образом. Множество клеток многоклеточного организма нуждается в сигналах на то, чтобы оставаться живыми. В отсутствии таких сигналов или трофических факторов в клетках развивается программа "самоубийства" или программируемой смерти. Например, клетки культуры нейронов погибают при отсутствии фактора роста нейронов (NGF), клетки простаты гибнут в отсутствии андрогенов семенника, клетки молочной железы погибают при падении уровня гормона прогестерона и т.д. С другой стороны, клетки могут получать сигналы, которые в клетках-мишенях запускают процессы, приводящие к гибели по типу апоптоза. Так, гидрокортизон вызывает гибель лимфоцитов, а глютамат - нервных клеток в культуре ткани, фактор некроза опухоли (TNF) вызывает гибель самых различных клеток. Тироксин (гормон щитовидной железы) вызывает апоптоз клеток хвоста головастиков. Кроме этого существуют ситуации, когда апоптическая гибель клетки вызывается внешними факторами, например, радиацией.
Понятие "апоптоз" было получено при изучении гибели части клеток печени при неполной перевязке портальной вены. Было обнаружено, что при этом наблюдается своеобразная картина клеточной смерти, которая затрагивает лишь отдельные клетки в паренхиме печени. Процесс начинается с того, что клетки теряют контакты с соседними клетками, они как бы сморщиваются (первоначальное название этой формы гибели shrinkage necrosis - некроз сжатием клетки), в ядрах по их периферии происходит специфическая конденсация хроматина, затем ядро фрагментируется на отдельные части, вслед за этим сама клетка фрагментируется на отдельные тельца, отграниченные плазматической мембраной - апоптические тельца. Апоптоз - процесс, приводящий не к лизису, не к растворению клетки, а к ее фрагментации, распаду. Судьба апоптических телец тоже необычна: они фагоцитируются макрофагами или даже нормальными соседними клетками. При этом не развивается воспалительная реакция.
Важно отметить, что во всех случаях апоптоза, во время ли эмбрионального развития, во взрослом ли организме, в норме или при патологических процессах, морфология процесса гибели клеток очень сходна. Это может говорить об общности процессов апоптоза в разных организмах и в разных органах.
Исследования на разных объектах показали, что апоптоз есть результат реализации генетически запрограммированной клеточной гибели. Первые доказательства наличия генетической программы клеточной смерти (ПКС) были получены при изучении развития нематоды Caenorhabditis elegans. Этот червь развивается всего за 3 суток и его малые размеры позволяют проследить за судьбой всех его клеток, начиная с ранних этапов дробления до половозрелого организма.
Оказалось, что при развитии C.elegans образуется всего 1090 клеток, из которых часть нервных клеток в количестве 131 штуки спонтанно погибает путем апоптоза, и в организме остается 959 клеток. Были обнаружены мутанты, у которых процесс элиминации 131 клетки был нарушен. Были обнаружены два гена ced-3 и ced-4, продукты которых вызывают апоптоз 131 клетки. Если у мутантных C.elegans эти гены отсутствуют или изменены, то апоптоз не наступает и взрослый организм состоит из 1090 клеток. Был найден и другой ген - ced-9, который является супрессором апоптоза: при мутации ced-9 все 1090 клеток погибают.
Аналог этого гена был найден у человека: bcl-2-ген также является супрессором апоптоза различных клеток. Оказалось, что оба белка, кодируемые этими генами, Ced-9 и Bcl-2, имеют один трансмембранный домен и локализуются во внешней мембране митохондрий, ядер и эндоплазматического ретикулума.
Система развития апоптоза оказалась очень сходной у нематоды и позвоночных животных, она состоит из трех звеньев: регулятор, адаптер и эффектор. У C.elegans регулятором является Ced-9, который блокирует адаптерный белок Ced-4, который в свою очередь не активирует эффекторный белок Ced-3, протеазу, которая действует на белки цитоскелета и ядра.
У позвоночных система ПКС более сложная. Здесь регулятором является белок Bcl-2, который ингибирует адаптерный белок Apaf-1, стимулирующий каскад активации специальных протеиназ - каспаз.

Таблица Развитие процесса программированной клеточной смерти (апоптоза)

Регулятор
Адаптер
Эффектор
Результат
Результат
C.elegans
Ced-9
Ced-4
Ced-3
ПКС
Позвоночные
Bcl-2
Apaf-1
Casp 9
Casp 3
ПКС

Каспазы - цистеиновые протеазы, которые расщепляют белки по аспарагиновой кислоте. В клетке каспазы синтезируются в форме латентных предшественников - прокаспаз. Существуют инициирующие и эффекторные каспазы. Инициирующие каспазы активируют латентные формы эффекторных каспаз. Субстратами для действия активированных каспаз служат более 60 различных белков. Это, например, киназа фокальных адгезионных структур, инактивация которой приводит к отделению апоптических клеток от соседей; это ламины, которые при действии каспаз разбираются; это цитоскелетные белки (промежуточные филаменты, актин, гельзолин), инактивация которых приводит к изменению формы клетки и к появлению на ее поверхности пузырей, которые дают начало апоптическим тельцам; это активируемая протеаза CAD, которая расщепляет ДНК на олигонуклеотидные нуклетосомные фрагменты; это ферменты репарации ДНК, подавление которых предотвращает восстановление структуры ДНК, и многие другие.
Одним из примеров разворачивания апоптозного ответа может являться реакция клетки на отсутствие сигнала от необходимого трофического фактора, например, фактора роста нервов (NGF) или андрогена (рис. 355). В цитоплазме клеток в присутствии трофических факторов находится в неактивной форме еще один участник реакции - фосфорилированный белок Bad. В отсутствии трофического фактора этот белок дефосфорилируется и связывается с белком Bcl-2 на внешней митохондриальной мембране и этим ингибирует его антиапоптозные свойства. После этого активируется мембранный проапоптический белок Bax, открывая путь ионам, входящим в митохондрию. В это же время из митохондрий через образовавшиеся в мембране поры в цитоплазму выходит цитохром С, который связывается с адаптерным белком Apaf-1, который в свою очередь активирует прокаспазу 9. Активированная каспаза 9 запускает каскад других прокаспаз, в том числе каспазу 3, которые будучи протеиназами, начинают переваривать мешенные белки (ламины, белки цитоскелета и др.), что вызывает апоптическую смерть клетки, ее распад на части, на апоптические тельца.
Апоптические тельца, окруженные плазматической мембраной разрушенной клетки, привлекают отдельные макрофаги, которые их поглощают и переваривают с помощью своих лизосом. Макрофаги не реагируют на соседние нормальные клетки, но узнают апоптические. Это связано с тем, что при апоптозе нарушается асимметрия плазматической мембраны и на ее поверхности появляется фосфатидилсерин, негативно заряженный фосфолипид, который в норме располагается в цитозольной части билипидной плазматической мембраны. Таким образом путем избирательного фагоцитоза ткани как бы очищаются от погибших апоптозных клеток.
Как указывалось выше, апоптоз может быть вызван целым рядом внешних факторов, таких как радиация, действие некоторых токсинов, ингибиторов клеточного метаболизма.
Как уже говорилось, необратимые повреждения ДНК вызывают апоптоз. Это связано с тем, что накапливающийся транскрипционный фактор, белок р53, не только активирует белок р21, который ингибирует зависящую от циклина киназу и останавливает клеточный цикл в G1 или G2 фазе (см. рис. 353), но и активирует экспрессию гена bax, продукт которого запускает апоптоз.
Избирательные повреждения митохондрий, при которых в цитоплазму высвобождается цитохром С, также являются частой причиной развития апоптоза. Особенно митохондрии и другие клеточные компоненты страдают при образовании токсически активных форм кислорода (АТК), под действием которых во внутренней мембране митохондрий образуются неспецифические каналы с высокой проницаемостью для ионов, в результате чего матрикс митохондрий набухает, а внешняя мембрана разрывается. При этом растворенные в межмембранном пространстве белки вместе с цитохромом С выходят в цитоплазму. Среди освободившихся белков есть факторы, активирующие апоптоз, и прокаспаза 9.
Многие токсины (рицин, дифтерийный токсин и др.), а также антиметаболиты могут вызывать гибель клеток путем апоптоза. При нарушении синтеза белка в эндоплазматическом ретикулуме в развитии апоптоза участвует локализованная там прокаспаза 12, которая активирует ряд других каспаз, и в том числе каспазу 3.
Элиминация, удаление отдельных клеток путем апоптоза наблюдается и у растений. Здесь апоптоз включает в себя, так же как у животных клеток, фазу индукции, эффекторную фазу и фазу деградации. Морфология гибели клеток растений сходна с изменениями клеток животных: конденсация хроматина и фрагментация ядра, олигонуклеотидная деградация ДНК, сжатие протопласта, его дробление на везикулы, разрыв плазмодесм и т.д. Однако везикулы протопласта разрушаются гидролазами самих везикул, так как у растений нет клеток, аналогичных фагоцитам. Так ПКС происходит при росте клеток корневого чехлика, при формировании перфораций у листьев, при образовании ксилемы и флоэмы. Опадание листьев связано с избирательной гибелью клеток определенной зоны черенка.
Биологическая роль апоптоза или программированной смерти клеток очень велика: это удаление отработавших свое или ненужных на данном этапе развития клеток, а также удаление измененных или патологических клеток, особенно мутантных или зараженных вирусами.
Для того, чтобы клетки в многоклеточном организме существовали, нужны сигналы на их выживание - трофические факторы, сигнальные молекулы. Эти сигналы могут быть переданы на расстоянии и уловлены соответствующими рецепторными молекулами на клетках-мишенях (гормональная, эндокринная сигнализация), это может быть паракринная связь, когда сигнал передается на соседнюю клетку (например, передача нейромедиатора). При отсутствии таких трофических факторов реализуется программа апоптоза. С другой стороны, апоптоз может вызываться сигнальными молекулами, например при резорбции хвоста головастиков под действием тироксина. Кроме того, действие ряда токсинов, влияющих на отдельные звенья метаболизма клетки, также может стать причиной клеточной гибели посредством апоптоза.



5



<<

стр. 2
(всего 2)

СОДЕРЖАНИЕ