<<

стр. 10
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

Электрофоретическое разделение на бумаге. Элюирование: кусочки ленты, содержащие
П р и н ц и п тот же, что п р и электрофорезе отдельные фракции, вырезают и помещают в
на п л е н к а х из ацетата целлюлозы. пробирки для элюирования. Для этого в каждую
Р е а к т и в ы. 1. Буфер. Можно использо- п р о б и р к у с глобулиновой фракцией приливают
вать р а з л и ч н ы е виды буферов — мединал-веро- по 10 мл 0,02 моль/л раствора NaOH, к альбу-
наловьш. боратный, трис-буфер. а) Мединал- миновой фракции — 20 мл и оставляют в тече-
вероналовый буфер рН 8,6:10,3 г мединала и ние 1—2 ч. Измерение проводят в кювете с тол-
1,84 г веронала растворяют и доводят до 1 л щиной слоя 1 см против 0,02 моль/л раствора

178
NaOH при 500—560 нм (зеленый светофильтр). представляет собой насыщенный водный рас-
Величину экстинкции альбуминов умножают твор тимола в буфере. Химическая сущность
на 2. Определяют сумму экстинкции всех фрак- тимоловой пробы окончательно не выяснена.
ций, п р и н и м а я ее за 100 %, и вычисляют долю Считают, что проба является положительной
каждой фракции. при уменьшении альбуминов и увеличении (3- и
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы у взрос- у-глобулинов.
л ы х: альбумины 50—70 %; глобулины: он 3— Способ приготовления тимолового реактива
6 %; а2 9—15; в 8—18 %; у 15—25 %. и вид буфера могут влиять на результаты. Тимо-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Диагно- ловый реактив в вероналовом буфере, предло-
стическое значение определения а л ь б у м и н а женный Маклаганом, неустойчив. Повысить ус-
представлено выше. Увеличение содержания <х- тойчивость реактива можно р а з л и ч н ы м и спосо-
глобулинов в сыворотке крови характерно для б а м и . Хуэрго и Поппер предложили модифици-
острых воспалительных процессов, так как в ровать оригинальный реактив Маклагана, изме-
данную фракцию входят белки острой фазы н и в способ его приготовления (тимол добавля-
(С-реактивный белок, а 1 -гликопротеид, а 1 -анти- ется к вероналовому буферу в форме концентри-
трипсин, а2-макроглобулин, церулоплазмин, рованного спиртового раствора).
гаптоглобулин и др.). Во фракцию а-глобулинов Позднее было предложено заменить верона-
входит большинство гликопротеидов. Содержа- ловый буфер трис-буфером, который в сочета-
ние а-глобулинов увеличивается также при нии с НС1 и малеиновой кислотой увеличивает
различных хронических заболеваниях, злока- стабильность реактива. Немаловажное значение
чественных новообразованиях, метастазирова- имеет оптимизация условий определения. Реак-
н и и опухолей, травмах, ревматизме, инфаркте ция более чувствительна при рН 7,55 и темпе-
миокарда. ратуре 23—25 °С.
Повышение в-глобулинов в сыворотке крови Оценку помутнения, возникшего в ходе реак-
чаще наступает при гиперлипопротеидемиях ции, можно проводить визуально или турбиди-
различного происхождения, что связано с н а л и - метрически. Предложены различные суспензии
чием в данной фракции липопротеидов. Фрак- для построения калибровочной кривой. Чаще
ция у-глобулинов увеличивается при патологи- других применяют бариево-сульфатный реактив.
ческих состояниях, связанных с интенсифика- Тимоловая и сулемовая пробы и проба Вельт-
цией иммунологических процессов, так как мана утверждены в качестве у н и ф и ц и р о в а н н ы х
фракция у-глобулинов состоит главным образом в 1972 г.
из иммуноглобулинов. Увеличение с о д е р ж а н и я Тимоловая проба (унифицированный метод).
у-глобулинов может наступать за счет образо- П р и н ц и п . При взаимодействии сыворотки
вания патологических белков — парапротеинов, с тимолово-вероналовым раствором появляется
относящихся к иммуноглобулинам. помутнение вследствие образования глобулино-
Гипогаммаглобулинемии могут носить вро- тимоло-липидного комплекса.
жденный характер или могут быть обуслов- Р е а к т и в ы . 1. Тимол, 100 г/л спиртовой
лены наличием различных заболеваний или па- раствор: 10 г очищенного тимола растворяют
тологических состояний, сопровождающихся ис- в 96 % этиловом спирте в мерной колбе вме-
тощением иммунной системы. К т а к и м заболева- стимостью 100 мл. Очистка тимола: 100 г тимола
н и я м относятся злокачественные опухоли, хро- ч. растворяют в 100 мл 96 % этилового с п и р т а ,
нические воспалительные процессы, аллергиче- фильтруют. К фильтрату прибавляют 1 л холод-
ские заболевания. ной воды, сильно встряхивают и оставляют сто-
ять на 20 мин. Затем фильтруют; кристаллы,
оставшиеся на фильтре, промывают 2 раза хо-
лодной водой, сушат до постоянной массы вна-
5.1.4. Осадочные пробы чале на фильтровальной бумаге, затем в течение
2—3 дней в эксикаторе над безводным хлоридом
Применение осадочных проб с диагности- кальция. 2. 5,5-Диэтилбарбитуровая кислота
ческой целью основано на изменениях устойчи- (веронал), фарм. 3. 5,5-Диэтилбарбитуровой ки-
вости белков плазмы п р и некоторых заболева- слоты натриевая соль (мединал), фарм. 4. Бу-
ниях. В норме белки в плазме крови находятся ферный раствор: 2,76 г веронала и 2,06 г меди-
в коллоидном состоянии и отличаются высокой нала растворяют и доводят до 1 л водой. Хранят
устойчивостью. При постановке осадочных проб, в холодильнике; при появлении осадка раствор
которые сопровождаются химическим или физи- негоден к употреблению. 5. Тимолово-веронало-
ческим вмешательством, наступает преципита- вый буфер рН 7,55—7,6: в мерной колбе вмести-
ция белков, приводящая к помутнению или об- мостью 100 мл смешивают 80 мл буферного
разованию хлопьев. раствора и 1 мл 100 г/л спиртового раствора
Основные осадочные пробы. Пробы с приме- тимола, встряхивают и доливают буферным рас-
нением реакции Таката (проба Таката, проба твором до метки. Проверяют рН. 6. Бария хло-
Гросса, сулемовая проба); тимоловая проба; рид ч. д. а. или х. ч. 7. Калибровочный раствор.
кефалин-холестериновая проба; цинк-сульфат- а) Раствор хлорида бария: 1,175 г хлорида
ная (Кункеля) проба; реакция Вельтмана; зо- бария ( В а С l 2 - 2 Н 2 О ) растворяют и доводят до
лото-коллоидальная проба. Наибольшее диагно- 100 мл водой, б) Серная кислота х. ч.,0,1 моль/л.
стическое значение при заболевании печени име- Суспензия сульфата бария: 3 мл раствора хло-
ет тимоловая проба. Тимоловая проба предло- рида бария наливают в мерную колбу вмести-
жена в 1944 г. Маклаганом. Тимоловый реактив мостью 100 мл и доводят объем до метки

179
0,1 моль/л раствором серной кислоты при тем- личестве миллилитров раствора сулемы, пошед-
пературе 10 °С (при этой температуре размеры ш и х на титрование.
частиц преципитированного сульфата бария Н о р м а л ь н ы е величины:1,6—2,2 мл
дают относительно стабильный результат). Сус- сулемы.
пензию сульфата бария готовят перед употреб-
Л и т е р а т у р а . Grinstedt F. Acta med
лением.
Scand., 1948, vol. 131, p. 66.
Материал для исследования.
Сыворотка крови, свободная от гемолиза. Проба Вельтмана (унифицированный ме-
Х о д о п р е д е л е н и я . К 6 мл тимолово- тод). П р и н ц и п . При добавлении к сыворотке
вероналового буферного раствора прибавляют крови раствора хлорида к а л ь ц и я и нагревании
0,1 мл сыворотки, оставляют стоять 30 мин и происходит нарушение коллоидальной устойчи-
затем измеряют оптическую плотность при дли- вости сыворотки.
не волны 630—690 нм (красный светофильтр) Р е а к т и в ы . 1 . Кальция хлорид 0,5%.
против тимолово-вероналового буфера в кюве- Готовят из 10 % раствора хлорида кальция
тах с толщиной слоя 1 см. Реакцию проводят ( С а С l 2 • 6Н 2 О), что соответствует 5 % раствору
при комнатной температуре. безводного хлорида кальция. Точно определить
Р а с ч е т ведут по калибровочному гра- массу хлорида кальция невозможно из-за его
фику. гигроскопичности, поэтому концентрацию раст-
Построение калибровочного вора определяют по относительной плотности;
г р а ф и к а : и з калибровочного раствора суль- 5 % раствор безводного хлорида кальция имеет
фата бария (суспензии) готовят разведения, относительную плотность 1,040. Для приготовле-
соответствующие единицам помутнения по ния 10 % раствора хлорида к а л ь ц и я 99,14 г
Шенк — Хогланд. Калибровочные растворы хо- СаСl2 • 6Н2О доводят до 1 л бидистиллированной
рошо встряхивают и тотчас при длине волны водой и растворяют, затем измеряют относитель-
630—690 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см ную плотность и путем дальнейшего разведения
против воды измеряют. доводят относительную плотность до 1,040.
Из полученного раствора, разведя его в 10 раз,
готовят 0,5 % раствор хлорида кальция. Для
приготовления 0,5 % раствора можно использо-
0,1 моль/л раст-
Суспензия Единицы
помутнения вать ампулированный раствор хлорида каль-
вор НаSО 4 , мл
BaSO4, мл
ция. Если относительная плотность ампулиро-
ванного раствора 1,040, то 0,5 % раствор гото-
4,65 5
1,35 вят разведением ампулированного раствора
10
2,7 3,3 в 10 раз.
5,4 0,6 20 Материал для исследования.
Сыворотка крови, свободная от гемолиза.
Х о д о п р е д е л е н и я . К 0,1 м л сыворотки
прибавляют 4,9 мл воды, перемешивают, опро-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 0—4 ед. кидывая пробирку, и прибавляют 0,1 мл 0,5 %
П р и м е ч а н и е . Можно использовать го- раствора хлорида кальция, встряхивают и на-
товый набор реактивов Био-Ла-Тест «Тимоло- гревают пробирку над пламенем до однократ-
вая проба» («Лахема», ЧССР), в состав которо- ного з а к и п а н и я смеси. Охлаждают пробирку и
го входят трис-буфер и малеиновая кислота. смотрят на свету. Если хлопьев нет, то в эту же
пробирку добавляют еще 0,1 мл хлорида каль-
Л и т е р а т у р а . Huerga J., Popper H.
ц и я и вновь кипятят. Процедуру повторяют,
J. Lab. c l i n . Med., 1949, vol. 34, p. 877; Shank R.,
пока не выпадут хлопья.
Hoagland C. J. biol. Chem., 1946, vol. 162, p. 33.
Результаты оценивают, подсчитывая общее
Сулемовая проба (унифицированный метод). количество пошедшего на реакцию хлорида
П р и н ц и п . Сулема в присутствии мелкодис- кальция.
персных коллоидов (белков) образует коллои- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В норме
дальный раствор солей ртути. Нарушение дис- коагуляция наступает при прибавлении 0,4—
персности белковых фракций сыворотки крови 0,5 мл раствора хлорида кальция.
вызывает осаждение грубодисперсных частиц. К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Результа-
Р е а к т и в ы . 1. Сулема, 1 г/л раствор: ты осадочных проб могут быть патологическими
0,1 г двухлористой ртути растворяют в воде при заболеваниях печени, а также при других
в мерной колбе вместимостью 100 мл. 2. Натрия заболеваниях, сопровождающихся диспротеине-
хлорид, 154 ммоль/л. м и я м и . Поэтому их следует расценивать в соче-
Материал для исследования. тании с д р у г и м и лабораторными тестами и кли-
Сыворотка крови, свободная от гемолиза. ническими симптомами. Наиболее специфичной
Х о д о п р е д е л е н и я . К 0,5 мл сыворотки для поражения печени является тимоловая про-
добавляют 1 мл 154 ммоль/л раствора NaCl ба, она бывает положительной раньше появле-
и титруют 1 г/л раствором сулемы. После появ- ния желтухи. Сулемовая проба чаще бывает
ления первоначально обратимого помутнения положительной п р и циррозе печени, токсических
титруют медленно с интервалом 20—30 с до поражениях печени, силикозе. В пробе Вельт-
стойкого помутнения (через вертикальный слой мана коагуляция наступает при прибавлении
жидкости нельзя прочитать газетный текст). меньшего количества раствора хлорида кальция
Результаты сулемовой реакции выражают в ко- п р и паренхиматозном поражении печени, маля-

180
р и и . Коагуляция мри прибавлении большего Л и т е р а т у р а . Weltmann О , Med. K l i n . ,
количества раствора хлорида кальция наблюда- 1930, vol. 26, p. 240; Weitmann O. W i c n . k l i n .
е т с я при ревматизме, туберкулезе л е г к и х . Wschr., 1930, vol. 1 1 , p. 1301.


5.2. Ф Е Р М Е Н Т Ы

5.2.1. Общая часть 1 для ЛДГ и 10000:1 для АсАТ и А л А Т ) ;
размер и форма молекул ферментов и величина
В основе многих болезней лежат н а р у ш е н и я молекулярной массы; внутриклеточная локали-
нормального ф у н к ц и о н и р о в а н и я ферментатив- зация ферментов. Важно также время полу-
ных процессов. Изменения в специфических фер- распада фермента в плазме; оно может коле-
м е н т а т и в н ы х реакциях можно идентифициро- баться от нескольких часов до нескольких дней.
в а т ь к а к п р и ч и н у или следствие различных пато- Ферменты, поступающие в плазму, могут быть
логических состояний. Эта взаимосвязь наибо- с п е ц и ф и ч н ы м и для плазмы и выполнять в ней
лее отчетливо выявляется при некоторых врож- определенные физиологические функции. Их ак-
денных нарушениях метаболизма. Большинство тивность в плазме больше, чем в клетках или
ферментов, катализирующих химические реак- т к а н я х . К ним относятся: церулоплазмин, псев-
ции, протекающие в живом организме, нахо- дохоли нэстераза, липопротеиновая липаза. Эти
дятся в клеточной среде, тем не менее на основа- ферменты синтезируются в печени и постоянно
н и и результатов анализов внеклеточных жид- высвобождаются в плазму. С диагностической
костей (особенно плазмы или сыворотки крови) точки зрения они представляют интерес, когда
можно сделать заключение об и з м е н е н и я х , их активность в плазме ниже нормы за счет
происходящих внутри клеток разных органов нарушения ф у н к ц и и печени.
и тканей. Вторая г р у п п а ферментов, неспецифичных
Определяемая в норме активность ферментов для плазмы, не выполняет определенных физио-
в сыворотке крови есть результат сбалансиро- логических ф у н к ц и й в плазме. Их активность
ванности скорости, с которой ферменты синте- в п л а з м е гораздо ниже, чем в клетках и т к а н я х .
зируются внутри клеток и выходят из н и х , со К ним относятся: а) секретируемые ферменты;
скоростью удаления ферментов из внеклеточной б) ферменты, связанные с клеточным метабо-
жидкости путем и н а к т и в а ц и и и разрушения и их лизмом. К секретируемым ферментам принадле-
экскреции. Изменения активности ферментов в жат липаза, а-амилаза, ЩФ. Эти ферменты
биологических жидкостях при заболеваниях мо- секретируются определенными органами (под-
гут быть обусловлены рядом п р и ч и н . желудочная железа, печень) и выводятся с мо-
Повышение активности может быть резуль- чой, желчью. В норме их активность в плазме
татом ускорения процессов синтеза (например, относительно низка и постоянна. Однако при
ЩФ при рахите, гепатите), некроза клеток патологии, если блокирован любой из обычных
путей экскреции, активность этих ферментов
( н а п р и м е р , КК, АсАТ п р и инфаркте миокарда),
понижения выведения (например, ЩФ, ЛАП в плазме значительно увеличивается (напри-
при закупорке желчных п у т е й ) , повышения про- мер, повышение активности ЩФ в сыворотке
крови при закупорке желчевыводящих путей).
ницаемости клеточных мембран ( н а п р и м е р ,
Ал AT, АсАТ при вирусном гепатите). Основная группа ферментов — это ферменты
клеточного обмена, локализованные в н у т р и кле-
Понижение активности вызывается уменьше-
ток в цитоплазме и клеточных структурах; в сы-
нием числа клеток, секретирующих фермент
воротке крови их активность низка или они
(например, ХЭ при циррозе печени), недоста-
вообще отсутствуют.
точностью синтеза (например, церулоплазмин
Основным п р и н ц и п о м ферментной диагно-
при болезни Вильсона), увеличением выведения
фермента (например, церулоплазмин при неф- стики является выбор оптимального спектра
ферментов, изменение активности которых
розе), торможением активности ( н а п р и м е р , ак-
характерно для патологии определенных орга-
тивности трипсина а н т и т р и п с и н о м ) .
нов или тканей. Спектр ферментов для диагно-
Наиболее важны с диагностической точки
стики заболеваний некоторых органов: сердце —
зрения те изменения, которые обусловлены на-
КК, ЛДГ, АсАТ; скелетные м ы ш ц ы — КК, АЛД;
рушением скорости образования ферментов или
кости — ЩФ; кровь — ЛДГ 2 , ЛДГ 3 ; поджелу-
высвобождением ферментов из поврежденных
дочная железа — а-амилаза, л и п а з а ; предста-
или омертвевших клеток. Многие факторы спо-
тельная железа — КФ; печень (желчные пу-
собны повышать проницаемость мембран для
белков и таким образом вызывать «утечку» ти) — АлАТ, ГлДГ, ХЭ, ЩФ, 7-ГПТ. Очень
высокая активность ферментов в крови может
внутриклеточных ферментов: у м е н ь ш е н и е до-
указывать на поражение определенного органа,
ставки кислорода в клетку, истощение запаса
например, очень высокая активность АлАТ ука-
глюкозы в крови, лекарственные и химические
зывает на поражение печени. Имеет з н а ч е н и е
вещества. Если началось выделение ферментов
из клетки, то на скорость появления ферментов и знание внутриклеточной локализации фермен-
тов, особенно для контроля за течением болезни.
в сыворотке крови воздействуют следующие
Для ферментной диагностики важны также и
факторы: концентрационный градиент внутри
клетки и в сыворотке крови (например, для гепа- сведения о соотношении активности ферментов,
например, АсАТ к А л А Т или КК к АсАТ. Опре-
тоцита соотношение концентраций равно 3000:

181
деление активности органоспецифйческих фер- трацией субстрата согласно уравнению Михаэ-
ментов, т. е. ферментов, содержащихся только лиса — Ментен. Константа Михаэлиса (Км)
в одном органе, например сорбитолдегидроге- характеризует степень сродства фермента с суб-
стратом и представляет собой концентрацию
наза (печень), уроканиназа (печень), орнитил-
субстрата, при которой скорость ферментатив-
карбамилтрансфераза (печень), не имеет боль-
шого диагностического з н а ч е н и я . Количество та- ной реакции равна половине максимальной.
О с н о в н ы е требования, предъ-
ких ферментов ограничено, а активность их
я в л я е м ы е к ф е р м е н т а т и в н о й ре-
в сыворотке крови очень низкая или они вообще
отсутствуют и не всегда определяются сущест- а к ц и и . Активность фермента необходимо оп-
вующими методами. Более важно для диагно- ределять в условиях насыщения фермента суб-
стики определение изоферментов. стратом; до конца измерения должна быть из-
Фермент в целом, как правило, содержится расходована только небольшая часть субстрата;
в ряде органов, а отдельные изоферменты орга- субстрат не должен содержать примесей, влия-
н о с п е ц и ф и ч н ы . Особое значение в ферментной ющих на определение.
диагностике имеет знание пределов нормальных Факторы, влияющие на актив-
величин активности фермента, которые в значи- н о с т ь ф е р м е н т о в . Температура, вид суб-
тельной степени зависят от метода и условий страта и его концентрация; вид буфера и его
определения. В энзиммологии, как ни в какой концентрация; рН; наличие активаторов и ин-
другой области, существует большое количество гибиторов.
единиц активности ферментов, несравнимых ме- Ферментативная реакция чувствительна к
жду собой, поэтому стандартизация единиц изменениям температуры. При повышении тем-
в клинической энзимологии — необходимое ус- пературы энергия теплового движения молекул
ловие для получения диагностически значимых увеличивается, в результате чего число молекул,
и с р а в н и м ы х результатов лабораторных иссле- способных достичь переходного состояния, т. е.
дований. подвергнуться действию фермента, возрастает,
Методические вопросы определения актив- при дальнейшем повышении температуры может
ности ферментов. Из-за низкой активности фер- наступать инактивация ферментов. Температур-
ментов в биологических жидкостях, а также из- ный коэффициент скорости реакции равен при-
за трудности дифференциации различных фер- близительно 10 % на 1 °С. Это значит, что при
ментов х и м и ч е с к и м способом на практике, как повышении температуры на 1 °С активность
правило, не применяется прямое химическое фермента увеличивается на 10 %. Однако при
определение активности ферментов, а измеря- значительном повышении температуры скорость
ется каталитический эффект ферментов путем реакции снижается из-за денатурации белка.
измерения скорости реакции, при которой суб- В 1961 г. Международный биохимический
страт под действием фермента превращается союз рекомендовал измерять активность фер-
в продукт реакции. Эта величина известна как мента при температуре 25 °С, в 1964 г. эти реко-
«скорость реакции» и п р и определенных усло- мендации были изменены на 30 °С. Междуна-
виях прямо пропорциональна количеству при- родная согласованность температуры измерения
сутствующего фермента. активности ферментов является предпосылкой
для международной стандартизации методов,
Чтобы понять механизм ферментативной ре-
а к ц и и , необходимо иметь представление о ее так как при разной температуре оптимальные
значения рН, концентрации буфера, субстрата
кинетике, т. е. о тех законах, которым подчиня-
и других параметров реакции различны.
ется реакция, протекающая под действием
Главное свойство ферментов, отличающее их
фермента. Строгое математическое описание ки-
от других катализаторов,— высокая специфич-
нетики ферментативных реакций очень сложно.
ность; фермент вступает в реакцию только с оп-
Классические кинетические реакции могут иметь
ределенным химическим веществом — субстра-
различный порядок. Скорость реакции нулево-
том. Некоторые ферменты обладают почти абсо-
го порядка зависит только от катализатора,
лютной специфичностью по отношению к дан-
а не от концентрации реагирующих веществ.
ному субстрату. Так, ЛДГ специфична к L-лак-
Скорость реакции первого порядка зависит
тату, глутаматдегидрогеназа — к L-глутамату.
от концентрации одного из реагирующих ве-
Специфичность других ферментов выражена не
ществ. Реже встречаются реакции второго и
третьего порядка, скорость которых зависит от столь сильно — их действие простирается обыч-
но на определенную группу веществ. К таким
двух или трех компонентов реакции соответ-
ферментам относятся фосфатазы, пептидазы.
ственно. При высокой концентрации субстрата
скорость ферментативной реакции практически Для определения активности ферментов в ря-
не зависит от изменения концентрации субстра- де случаев применяют синтетические субстраты,
та. При этом в отношении субстрата реакция так как иногда бывает трудно определить физи-
приобретает нулевой порядок, происходит насы- ологический субстрат или продукты распада
щение фермента субстратом. При этих условиях синтетического субстрата определить легче, чем
скорость р е а к ц и и зависит только от активности физиологического. Как указано ранее, при оп-
фермента. ределенной концентрации субстрата достигается
Исследование эффекта насыщения привело максимальная скорость реакции. Рассчитать
L. Michaelis, M. Menten в 1913 г. к созданию концентрацию субстрата, при которой достига-
общей теории кинетики ферментативных реак- ется максимальная скорость реакции, можно
ций, которой установлена зависимость между теоретически, исходя из уравнения Михаэли-
скоростью ферментативной реакции и концен- са — Ментен.

182
Для достижения максимальной скорости нее проводить в о п т и м и з и р о в а н н ы х условиях
ферментативной реакции концентрация субстра- относительно концентрации субстрата, буфера,
та должна во много раз (50 и более) превышать активаторов и величины рН.
константу Михаэлиса. На практике не исполь- Методы определения активности ферментов.
зуют слишком высокую концентрацию субстра- Существует большое количество методических
та, так как субстрат или его продукт может принципов определения активности ферментов,
тормозить активность фермента. Если для реак- различающихся по технике исполнения, анали-
ции взять концентрацию субстрата, в 10 раз тическим качествам, способу измерения актив-
превышающую константу Михаэлиса, то ско- ности ферментов. По способу измерения разли-
рость р е а к ц и и составит 90 % от м а к с и м а л ь - чают: непрерывное кинетическое измерение,
ной, что достаточно для практических целей. двухточечное измерение, измерение по конечной
Эмпирически также можно определить необхо- точке. Преимущество кинетического измерения
димую субстратную концентрацию по кривой состоит в возможности прямого непрерывного
изменения скорости реакции при увеличении измерения скорости ферментативной реакции
концентрации субстрата. Вид буфера может ока- в начальной линейной части кривой при оптими-
зывать значительное влияние на активность зированной концентрации реактивов. С этой
ферментов, особенно ЩФ. Все ферменты имеют точки зрения наиболее точными и приемлемыми
оптимальную область рН действия. В качестве являются методы, основанные на оптическом
активаторов для многих ферментов могут слу- тесте. Оптический тест был разработан Вар-
жить органические и неорганические соедине- бургом в 30-х годах. П р и н ц и п теста Варбурга
ния. Например, активатором для КК являются основан на разнице поглощения при определен-
сульфгидрильные соединения, для ЩФ — ионы ной длине волны (340 нм) восстановленной
магния. При определении активности ферментов ( N A D H ) и окисленной ( N A D ) форм никотина-
чаще приходится иметь дело с ингибиторами. мидадениндинуклеотида. При длине волны
Ингибиторы ферментов могут находиться в ис- 340 нм NADH имеет максимальную абсорбцию,
следуемом материале и в реактивах. В моче, тогда как NAD не имеет поглощения при данной
например, много ингибиторов ЛДГ. Ионы тяже- длине волны. Качество реактива имеет большое
лых металлов органических и неорганических значение для получения правильных результа-
реактивов являются ингибиторами для боль- тов. Поэтому коэффициент молярной абсорбции
шинства ферментов. рекомендуется проверять в лаборатории, он не
На практике для каждого фермента экспери- должен быть н и ж е 5 - 1 0 2 м о л ь - 1 - м 2 . Различают
ментально должна подбираться концентрация п р я м о й и непрямой оптические тесты. Прямой
субстрата, оптимум рН, вид буфера и его кон- оптический тест применяется для определения
центрация. Оптимизация условий определения активности дегидрогеназ. Непрямой оптический
активности ферментов повышает аналитическую тест включает, помимо измерительной, индика-
надежность результатов исследования и их торную и вспомогательную реакции. Например,
диагностическую информативность, поэтому оп- прямой оптический тест для определения актив-
ределение активности ферментов предпочтитель- ности ЛДГ:




При непрямом оптическом тесте требуется торам, снижающим специфичность данных ме-
введение в реакцию ферментов. Активность фер- тодов, относится влияние метаболитов эндоген-
ментов измеряют на спектрофотометре предпоч- ного происхождения. В редоксиндикаторных ме-
тительно с термостатированной кюветой, а так- тодах N A D H восстанавливает синий тетразолий
же на биохимических анализаторах, позволя- или другие вещества с образованием окрашен-
ющих измерять кинетику ферментативной реак- ных соединений. Промежуточным продуктом
ции. К преимуществам методов, основанных на служит феназинметасульфат.
оптическом тесте, относятся возможность опре- Флуориметрические методы определения ак-
деления активности ферментов при оптимизиро- тивности ферментов более чувствительны, чем
ванных условиях, в начальной линейной части спектрофотометрические. Сравнительно новыми
к р и в о й , при кинетике нулевого порядка. К фак- и еще более ч у в с т в и т е л ь н ы м и являются хемилю-

183
как, например, КФ, АЛД, ЛДГ, так как при
Т а б л и ц а 39. Уменьшение активности фермен-
свертывании крови указанные ферменты будут
тов в сыворотке крови при хранении [Berg-
освобождаться из тромбоцитов, поэтому актив-
meyer Н. U., 1983|
ность ЛДГ, АЛД в сыворотке крови будет выше,
чем в плазме. Важно также знать содержание
ферментов в эритроцитах. Те ферменты, которые
содержатся в эритроцитах, при гемолизе попа-
дают в сыворотку и активность их в сыворотке
будет значительно выше. В табл. 39 представ-
лены данные о стабильности ряда ферментов.
Практически важен также вопрос о разведении
сыворотки при высокой активности фермента.
Для ряда ферментов (АсАТ, КК) известен эф-
фект разведения, т. е. при разведении сыворотки
154 ммоль/л раствором NaCI активность фер-
мента не снижается пропорционально разведе-
нию. Это объясняется р а з л и ч н ы м и п р и ч и н а м и :
концентрация белка в сыворотке может влиять
на активность фермента во время инкубации;
при разведении нарушается соотношение инги-
биторов и активаторов, что также не дает ожи-
даемого результата от разведения, поэтому п р и
определении активности ферментов предпочти-
тельнее не разводить сыворотку, а уменьшать
время инкубации.
Множественные формы ферментов. Множе-
ственность молекулярных форм ферментоп мо-
жет быть обусловлена р а з л и ч н ы м и п р и ч и н а м и .
Она может быть закодирована генетически,
тогда такие множественные формы называют
изоферментами, и может быть обусловлена ге-
терогенностью полипептидных цепей (например,
ЛДГ), различием в аминокислотном составе
фермента (например, для АсАТ). Множествен-
ность молекулярных форм — более широкое по-
нятие, чем изоферменты, она может быть обу-
словлена различным строением небелковой
части молекулы (например, ЩФ), конформа-
ционной изомерией ( н а п р и м е р , МДГ) и другими
факторами. Изоферментами обозначают группу
ферментов из организма одного и того же биоло-
* д — день. гического вида, обладающих одним типом суб-
стратной специфичности, но отличающихся по
минесцентные методы с применением люцифе-
физико-химическим и иммунологическим свой-
рин-люциферазной системы. Из перечисленных
ствам. Изоферменты отличаются друг от друга
методов наиболее широкое клиническое приме-
по кинетическим свойствам (отношение к и н г и -
нение находят спектрофотометрические методы.
биторам, активаторам, сродство с субстратом).
Оптический тест Варбурга лежит в основе мето-
Для большинства ферментов установлено су-
дических принципов, заложенных в большинство
ществование множественных форм. Важность
выпускаемых коммерческих наборов реактивов.
изучения изоферментов для диагностики была
Для определения активности ферментов при-
впервые установлена в 1957 г. для ЛДГ. Изо-
меняют фотометрические методы, основанные на
ферменты способны образовывать комплексы с
образовании окрашенных соединений с продук-
иммуноглобулинами, л и п и д а м и , липопротеина-
тами ферментативной реакции. Как правило,
ми и д р у г и м и компонентами сыворотки, что
измерение проводят по конечной точке, что явля-
может менять их электрофоретическую подвиж-
ется недостатком методов этой группы, и точ-
ность.
ность их ниже, чем методов, основанных на опти-
Методы определения изоферментов. К н и м
ческом тесте Варбурга. Исключение составляют
относятся электрофоретические методы на раз-
методы, в которых в ходе реакции непосред-
личных носителях, хроматографические, им-
ственно из субстрата образуется окрашенное
мунологические; методы, основанные на опреде-
соединение.
лении субстратного оптимума изоферментов;
Материал исследования. Наиболее часто ак-
термическое инактивирование; ингибирование
тивность ферментов определяют в сыворотке,
различными веществами; методы, основанные на
плазме, моче, клетках крови. Для большинства
различном сродстве изоферментов к субстратам.
ферментов не имеет принципиального значения,
Наиболее распространены электрофоретические
определяется ли активность фермента в плазме
методы определения изоферментов на различ-
или сыворотке крови. Это имеет значение для тех
ных носителях: бумаге, крахмальном геле, плен-
ферментов, которые содержатся в тромбоцитах,

184
Рис. 8. Схема расположения некоторых изоферментов сыворотки крови при электрофорезе на бумаге
или ацетатцеллюлозе.
1,2,3,4,5 — соответствующие изоферменты ЛДГ — ЛДГ 1 . ЛДГ 2 , ЛДГ 3 , ЛДГ 4 , ЛДГ 5 ; П — печеночный изо-
фермент ЩФ; ММ — м ы ш е ч н ы й изофермент К.К; ВВ — мозговой изофермент К.К; Мнт — митохондриальный
изофермент АсАТ; Ц — цитоплазматический изофермент АсАТ; Пж — поджелудочный изофермент а-ами-
лазы; Сл — слюнной изофермент а-амилазы.

ках из ацетата целлюлозы, полиакриламидном методы для ряда ферментов, а также требова-
геле (рис. 8). Хроматографические методы осно- ния к референтным материалам для измерения
ваны на разной степени адсорбции изофермен- активности ферментов '. В рамках рабочей
тов. группы экспертов стран — членов СЭВ также
Иммунологическая дифференциация изо- разработаны правила определения активности
ферментов предусматривает применение специ- ферментов.
фических антисывороток. Электрофореграммы Согласно разработанным рекомендациям
различных ферментов представлены на рис. 8. номенклатура ферментов должна употребляться
Стандартизация и унификация методов опре- в соответствии с рекомендациями (1972) Комис-
деления активности ферментов предусматривает сии Международного биохимического союза по
выбор и оценку у н и ф и ц и р о в а н н ы х методов для номенклатуре и классификации ферментов (с до-
практической работы в клинико-диагностиче- полнениями по 1975 г.); определение активности
ских лабораториях, разработку наиболее точ- ферментов рекомендуется проводить в оптимизи-
ных, референтных (эталонных) методов. Рефе- рованных условиях с кинетическим измерением;
рентные методы предназначаются для оценки предпочтительная температура измерения 30 °С,
аналитической надежности у н и ф и ц и р о в а н н ы х колебания ее не должны превышать ± 0,05 °С.
методов, для оценки качества рефе- Активность ферментов выражается в моль/
рентных и контрольных материалов, они /(с • л ) ; мкмоль/(с • л ) ; нмоль/(с • л ) . Между-
также могут быть использованы для прак- народная единица (ME) — м к м о л ь / ( м и н • л)
тической работы в клинико-диагностических соответствует 16,67 н м о л ь / ( с - л ) ; единица,
лабораториях. Референтные методы для фер- используемая в у н и ф и ц и р о в а н н ы х методах —
ментов разрабатываются на основе: оптимиза- мкмоль/(ч • мл) соответствует 278 нмоль/(с • л ) .
ции параметров реакции, стандартизации усло-
вий измерения; установления необходимой
степени чистоты реактивов и калибровочных
материалов, требований к точности приборов;
оценки аналитической надежности методов. 1
IFCC. Committee on Standarts. Expert
Международной федерацией клинической х и м и и Panel on Enzymes, 1975, 1976, 1977, 1979.
(МФКХ) разработаны общие требования к из- IFCC. S c i e n t i f i c Committee. Expert Panel on
мерению активности ферментов и референтные Enzymes, 1980, 1981.
185
межлабораторных экспериментов и проверки ка-
Комиссия по величинам и единицам МФКХ
чества методов.
и Международного союза теоретической и при-
кладной химии предложила именовать величину Л и т е р а т у р а . Номенклатура ферментов.
нмоль/(с • л) каталом. Поскольку присвоение Рекомендации (1972) Международного биохи-
производным единицам собственных наименова- мического союза по номенклатуре и классифи-
ний может производиться только в соответствии кации ферментов, а также по единицам фермен-
с решением Генеральной конференции по мерам тов и символам кинетики ферментативных ре-
и весам, то до такого решения наименование акций.—М.: ВИНИТИ, 1979.—320; Вилкинсон
катал — неприемлемо. Д. ( W i l k i n s o n J. Н.). Принципы и методы ди-
Вопросами выбора методов определения агностической энзимологии/Пер. с англ.—
активности ферментов успешно занимаются, по- М.: Медицина, 1981.—624 с.
мимо международных организаций, многие на-
циональные комитеты. Созданы Комиссии по
5.2.2. Аминотрансферазы
ферментам Американской ассоциации Клиниче-
ской химии (США), Немецкого общества клини- Аспартатаминотрансфераза — АсАТ (L-ac-
ческой х и м и и (ФРГ), С к а н д и н а в с к и й комитет партат: 2-оксоглутарат аминотрансфераза;
по ферментам, Английская рабочая группа по К. Ф. 2.6.1.1) катализирует обратимый перенос
ферментам. Комиссии по ферментам работают аминогрупп с L-аспарагиновой кислоты на а-ке-
в Австрии, Канаде, Франции, Италии, Японии. тоглутаровую.
Помимо выбора метода, важным направле- Аланинаминотрансфераза — АлАТ (L-ала-
нием в деятельности вышеуказанных организа- нин: 2-оксоглутарат аминотрансфераза; К. Ф.
ций является разработка референтных материа- 2.6.1.2) катализирует обратимый перенос амино-
лов для методов определения активности фер- групп с L-аланина на а-кетоглутаровую кислоту.
ментов, определение их стабильности, чистоты
Реакция, катализируемая АсАТ:
и возможность их применения для проведения




Ферменты открыты советскими учеными А. Е. с соавт. Наиболее распространенным динитро-
Браунштейном и М. Г. Крицман. АсАТ и АлАТ фенилгидразиновым методом является метод
обнаружены во всех исследованных к настояще- Райтмана — Френкеля (1956), в котором опре-
му времени тканях человека и животных. АсАТ деляют окрашенные динитрофенилгидразоны
состоит из изоферментов: цитоплазматического щавелевоуксусной и пировиноградной кислот без
и митохондриального, каталитические свойства экстракции их толуолом в отличие от метода
которых различны. Митохондриальная форма Тонгази. Метод Бабсона, принцип которого
фермента имеет более высокие величины К», для основан на образовании щавелевоуксусной кис-
а-кетоглутарата и более низкие для L-acnap- лотой с солями диазония окрашенного продукта
тата. реакции, прост по исполнению, дает надежные
Методы определения аминотрансфераз осно- результаты, но пригоден только для определения
ваны главным образом на определении скорости АсАТ. Методы определения глутаминовой кисло-
образования пировиноградной и щавелево- ты с помощью бумажной хроматографии трудо-
уксусной кислот, так как нет простых способов емки и применяются главным образом в научных
определения L-аспарагиновой, а-кетоглутаро- исследованиях. Манометрические методы трудо-
вой кислот и L-аланина. Для определения актив- емки и не применяются в клинических лабора-
ности АсАТ и АлАТ наиболее распространен- ториях. Флуориметрические методы высокочув-
ными являются спектрофотометрические и коло- ствительны и точны, но требуют специального
риметрические методы. оборудования. Методы с в-гидроксибензальде-
Первые спектрофотометрические методы, гидом и ванилином не нашли применения из-за
основанные на оптическом тесте, были предло- низкой специфичности.
жены для АсАТ А. Кагтеп в 1955 г., для Оптимизация условий определения и унифи-
АлАТ — F. W r o b l e w s k i , J. La Due в 1956 г. кации методов. В большинстве стран в качестве
В последующем эти методы были модифициро- стандартного предлагаются методы, основанные
ваны и оптимизированы. на оптическом тесте. Различия в национальных
Первый динитрофенилгидразиновый метод рекомендациях по стандартизации методов ка-
определения АсАТ и АлАТ описан N. Н. Tongasi саются не принципа метода, а оптимизирован-
186
ных условий измерения. За исключением метода Советском Союзе в 1972 г. утвержден
МФКХ, ни в одном стандартном методе не в качестве унифицированного модифицирован-
добавляется в инкубационную среду пиридо- ный метод Райтмана — Френкеля. В качестве
ксаль-5-фосфат, являющийся коферментом для наиболее точных рекомендованы оптимизи-
АсАТ и АлАТ. Добавление его в инкубацион- рованные методы, основанные на оптическом
ную среду позволяет увеличить чувствитель- тесте Варбурга.
ность метода. Степень активации зависит от АсАТ. Унифицированный метод по оптими-
многих факторов: вида буфера, концентрации зированному оптическому тесту. П р и и ц и и.
субстрата, концентрации апофермента, содер- Различие спектров поглощения окисленной и
ж а н и я витамина B 6 в организме. восстановленной форм N A D при 340 им.

1. Основная реакция:




фическая каталитическая активность выше
Равновесие реакции сдвинуто вправо.
17 м м о л ь / ( с - л ) . Примеси: А с А Т < 0 , 0 1 % ,
Р е а к т и в ы . 1 . Калия фосфат однозаме-
ГлДГ < 0,003 %, ЛДГ < 0,01 %. Для приго-
щенный (КН 2 РО 4 ) х. ч., ч. д. а. 2. Калия
товления рабочего раствора к 20 мкл суспензии
фосфат двузамещенный (К 2 НРО 4 • ЗН 2 О) ч.д.а.
добавляют 5 мл воды. 9. Лактатдегидрогеназа
3. L-Аспарагиновая кислота или L-аспараги-
из скелетной м ы ш ц ы кролика или свиньи. Сус-
новой кислоты натриевая соль. 4. Фосфатный
пензия в 50 % растворе глицерина. Специфи-
буфер 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещен-
ческая каталитическая активность выше 8 ммоль/
ного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного
/(с - л ) . Примеси: АсАТ < 0,01 %, ГлДГ <
фосфата калия трехводного растворяют в 40—
< 0,003 %, АлАТ < 0,01 %. Для приготовле-
60 мл воды, проверяют рН и доводят водой в
ния рабочего раствора к 40 мкл суспензии добав-
мерной колбе до 100 мл. Стабилен п р и х р а н е н и и
ляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 мес при
в холодильнике. 5. Субстратно-буферный раст-
хранении в холодильнике в хорошо укупоренной
вор 0,25 моль/л L-аспарагиновой кислоты в
посуде. 10. Натр едкий, 5 моль/л; 1 моль/л.
0,1 моль/л фосфатном буфере рН 7,4: 3,30 г
1 1 . Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологи-
L-аспарагиновой кислоты (или 3,9 г натриевой
ческий раствор).
соли L-аспарагиновой кислоты) растворяют в
40—50 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, про-
веряют рН и доводят фосфатным буфером в
П р и м е ч а н и е . Для определения актив-
мерной колбе до 100 мл. Если применяют L-acna-
ности АсАТ и А л А Т по оптическому тесту
рагиновую кислоту, то к навеске перед растворе-
используют отечественные реактивы квали-
нием в фосфатном буфере для установления
фикации «х.ч.» или «ч.д.а.» или импортные,
рН 7,4 добавляют «20—26 мл 1 моль/л раство-
например, можно использовать реактивы
ра едкого натра и затем проверяют рН. Стабилен
ф и р м ы « R e a n a l » (ВНР). Реактивы квалифи-
при хранении в холодильнике в течение месяца.
к а ц и и «ч.» непригодны. Все реактивы готовят
6. в-Никотинамидадениндинуклеотид восста-
на бидистиллированной воде, хранят при
новленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л: 16 мг
температуре от 0 до +4 °С. Уменьшение
N A D H - N a 2 - 4 H 2 O растворяют в 1,5 мл воды.
стабильности может наступить за счет роста
Раствор стабилен в течение 2 нед при хранении
микроорганизмов. Поэтому в растворы ре-
в темной посуде в холодильнике. Коэффициент
комендуется добавлять несколько капель
молярного поглощения не ниже 5,6 • 10 2 м 2 X
хлороформа.
-1
X моль при 340 нм. 7. а-Кетоглутаровая
Специальное оборудование.
кислота, 0,45 моль/л: 0,2 г а-кетоглутаровой
кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют Спектрофотометр с термостатированной кюве-
той. Измерение проводят при 340 нм.
0,5 мл 5 моль/л раствора едкого натра. Если
используют динатриевую соль а-кетоглутаровой Материал для исследования.
кислоты, то 0,26 г соли растворяют в 3 мл воды. Сыворотка крови или плазма, свободные от
Раствор стабилен в течение 2 нед при х р а н е н и и гемолиза.
в холодильнике. а-Кетоглутаровая кислота не Х о д о п р е д е л е н и я . Перед определени-
ем температура растворов и сыворотки должна
должна содержать примесей пирувата и мала-
та. 8. Малатдегидрогеназа из сердца свиньи быть доведена до температуры измерения. Пе-
ред работой можно готовить смесь реактивов,
(L-малат: NAD + оксидоредуктаза; К. Ф. 1 . 1 . 1 . 3 7 ) .
состоящую из субстратно-буферного р а с м т р а .
Суспензия в 50 % растворе г л и ц е р и н а . С п е ц и -
187
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : от 30 до
раствора NADH, МДГ и ЛДГ в соотношении
60: 1 : 1 : 1. Определение проводят по следую- 420 нмоль/ (с -л) ((от 2 до 25 ME)] при 30 °С.
щей схеме. П р и м е ч а н и е . Определение активности
фермента можно проводить по микрометоду.
Опыт-
В термостати- Холо- Для этого перед работой готовят смесь ре-
Конечная кон-
рованную стая
ная активов, состоящую из субстратно-буферно-
центрация ве-
кювету проба, проба, ществ в пробе го раствора, растворов NADH, ЛДГ, МДГ
приливают мл мл
в соотношении 60: 1 : 1 : 1. Опытная проба
включает смесь реактивов — 0,630 мл, сыво-
Фосфатный бу-
3,0
Субстратно- 3,0 ротку — 0,10 мл, а-кетоглутаровую кисло-
буферный фер -80 ту — 0,02 мл. Холостую пробу ставят так
раствор м моль/л же, как опытную, но вместо сыворотки до-
L-Аспарагино- бавляют 154 ммоль/л раствор хлорида натрия.
вая кислота — Определение проводят по той же схеме, что и
200 ммоль/л в макрометоде.
0,18 ммоль/л
0,05
NADH-раст- 0,05
вор А л А Т . Унифицированный метод по оптими-
10000 нмоль/
МДГ-суспен- 0,05 0,05 зированному оптическому тесту. П р и н ц и и
/(с-л)
зия тот же, что для АсАТ.
10000 нмоль/
ЛДГ-суспен- 0,05 0,05 1. Основная реакция:
/(с-л)
зия
Сыворотка —
0,5
крови
154 м моль/л
раствор хло-
рида натрия 0,05


Перемешивают и оставляют стоять на 10 мин
при 30 или 37° С
12 ммоль/л
Раствор а-ке- 0,1 0,1
Р е а к т и в ы . 1 . Калия фосфат однозаме-
тоглутаровой
щенный ( K H 2 P O 4 ) ч.д.а., х.ч. 2. Калия фосфат
кислоты
двузамещенный (К 2 НРО 4 • ЗН 2 О) ч.д.а. 3. Фос-
ф а т н ы й буфер, 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г одно-
замещенного фосфата калия и 2,07 г двузаме-
щенного фосфата к а л и я трехводного растворя-
Перемешивают и через 60 с (лаг-фаза) изме-
ют в 40—60 мл воды, проверяют рН и доводят
ряют экстинкцию и одновременно включают
водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при
секундомер. Точно через 1, 2, 3 м и н (или через
х р а н е н и и в холодильнике. 4. 1.-а-Аланин. 5.
более короткие, но р а в н ы е промежутки времени)
Субстратно-буферный раствор, 0,63 моль/л L-
измеряют экстинкцию.
а л а н и н а в 0,1 моль/л фосфатном буфере, рН 7,4:
Поправку на холостой опыт проводят по
5,62 г L - а л а н и н а растворяют в 80 мл 0,1 моль/л
формуле:
фосфатного буфера, проверяют рН и доводят
фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл.
Стабилен в течение 2 мес при хранении в холо-
дильнике. 6. р-Никотинамидадениндинуклеотид
восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л
(коэффициент молярной экстинкции не ниже
5.6 • 10 2 м 2 • моль -1 при 340 н м ) : 16 мг
Скорректированную в е л и ч и н у опытной про- N A D H - N a 2 - 4 H 2 O растворяют в 1,5 мл воды.
бы используют в дальнейших расчетах. Раствор стабилен в течение 2 нед при х р а н е н и и
Р а с ч е т производят п о формуле: в темной посуде в холодильнике. 7. Натр едкий,
активность, моль/(с • м 3 ) = н м о л ь / ( с - л ) • 106 = 5 моль/л. 8. а-Кетоглутаровая кислота, 0,56 моль/л:
0,245 г а-кетоглутаровой кислоты растворяют
в 2,5 мл воды и добавляют 0,5 мл 5 моль/л
раствора едкого натра. Если используют ди-
натриевую соль а-кетоглутаровой кислоты, то
0,318 г соли растворяют в 3 мл воды. Раствор
стабилен в течение 2 нед при хранении в холо-
где V f с.— объем реакционной смеси, мл; дильнике. 9. Лактатдегидрогеназа из скелетной
Venn— объем сыворотки, мл; / — время реак- м ы ш ц ы кролика или свиньи, суспензия в 50 %
растворе глицерина. Специфическая каталити-
изменение экстинкции за 1 с;
ческая активность выше 8 м м о л ь / ( с • л ) . При-
F — коэффициент молярной экстинкции \Л1)Н меси: АсАТ < 0,01 %, ГлДГ < 0,003 %,
АлАТ < 0,01 %. Для приготовления р а б о ч е й )
раствора к 45 мкл с у с п е н з и и добавляют 5 мл
кювете в метрах
188
Условные обозначения те же, что для опре-
воды. Стабилен в течение 3 мес п р и х р а н е н и и
деления АсАТ.
в холодильнике. 10. Натрия хлорид, 154 ммоль/л
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : от 30 до
(физиологический раствор). Все реактивы
420 нмоль/(с • л) [(от 2 до 25 ME)] при 30 °С.
лучше готовить на бидистиллированной воде.
Специальное оборудование то
П р и м е ч а н и е . Определение активности
ж е, что для АсАТ. фермента можно проводить по микрометоду.
М а т е р и а л и с с л е д о в а н и я . Свежая
Для этого перед работой готовят смесь ре-
сыворотка или плазма крови, свободные от гемо-
активов, состоящую из субстратно-буферно-
лиза. Фермент стабилен при 4 °С в течение го раствора, растворов N A D H и ЛДГ
суток. в соотношении 60 : 1 : 2. Опытная проба
Х о д о п р е д е л е н и я . Перед определени-
включает: смесь реактивов — 0,630 мл; сы-
ем температура растворов и сыворотки должна воротку - 0,10 мл; а-кетоглутаровую кисло-
быть доведена до температуры измерения. Перед
ту — 0,02 мл. Определение проводят по той
работой можно готовить смесь реактивов, сос- же схеме, что и в макрометоде.
тоящую из субстратно-буферного раствора,
Оценка а н а л и т и ч е с к о й надеж-
раствора N A D H и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1.
н о с т и м е т о д о в . Коэффициенты в а р и а ц и и
Определение проводят по следующей схеме.
2—6 %. При использовании реактивов, сво-
бодных от ингибиторов, и точного спектрофото-
Опыт- Холо- Конечная
В термостати-
метра метод дает правильные результаты.
ная стая концентрация
рованную
Реакции для АсАТ и АлАТ линейны до величины
про- веществ
про-
кювету
в пробе
ба, мл ба, мл активности 4000 нмоль/(с - л ) .
приливают
Л и т е р а т у р а . Делекторская Л. Н. В. кн.:
Субстратно-бу- Фосфатный бу- У н и ф и к а ц и я лабораторных методов исследова-
3,0 3,0
ферный раствор фер — 80 ммоль/л ния / Под ред. В. В. Меньшикова.— М., 1978,
L-Аланин — вып. V I I I , с. 83—89; Bergmeycr //. U. (Hrsg.)
500 ммоль/л Methoden der e n z y m a t i s c h e n A n a l y s e . Wein-
NADH-раствор 0,05 0,18 ммоль/л h e i m / V e r l a g Chemie, 1974, Bd 1, S. 769—775,
0,05
20 000 нмоль/
ЛДГ 785—792; Karmen A. .}. C l i n . Invest., 1955,
0,1 0,1
v o l . 34, p. 131; Wrobtewski F., La Due J. S.
(с-л)
Proc. Soc. exp. biol. Med., 1956, vol. 91, p. 569—
Сыворотка кро- 0,5 —
571.
ви 154 ммоль/л
раствор хлори-
Унифицированный динитрофенилгидразино-
да натрия 0,5
— вый метод Райтмана — Френкеля. П р и н ц и п .
В результате п е р е а м и н и р о в а н и я , происходящего
Перемешивают и оставляют стоять на 10 мин под действием АсАТ и АлАТ, образуются щаве-
левоуксусная и пировинОградная кислоты. При
при 30 или 37 °С
добавлении 2,4-динитрофенилгидразина в ще-
Раствор а-кето-
лочной среде образуются окрашенные гидразо-
глутаровой кис-
ны пировиноградной и щавелевоуксусной кислот.
лоты 15 ммоль/л
0,1 0,1
Р е а к т и в ы . 1 . Натрия фосфат двузаме-
щенный (Na 2 HPO 4 ), 0,1 моль/л: 14,2 г Na 2 HPO,
доводят до 1 л водой. 2. Калия фосфат одно-
Перемешивают, через 60 с ( л а г - ф а з а ) изме-
замещенный, 0,1 моль/л: 13,60 г КН 2 РО 4 до-
ряют экстинкцию и одновременно включают се-
водят до 1 л водой. 3. 0,1 моль/л фосфатный
кундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через
буфер рН 7,4: смешивают 840 мл 0.1 моль/л
более короткие, но р а в н ы е п р о м е ж у т к и времени)
раствора Na 2 HPO 4 и 160 мл 0,1 моль/л раствора
измеряют экстинкцию. Измерение опытной и
КН 2 РО 4 . Полученный раствор с индикатором
холостой проб проводят против воды при 340 нм
бромтимоловым синим должен давать голубую
в кювете с толщиной слоя 1 см.
окраску. Величину рН буфера доводят под контро-
Поправку на холостой опыт проводят по
лем рН-метра. К приготовленному раствору в
формуле:
качестве консерванта можно добавить 5—10 мл
хлороформа. 4. Натр едкий, 0,05 моль/л; 1 моль/л.
5. Бромтимоловый синий, 0,04 % раствор: 100
мг индикатора растирают в ступке с 3,2 мл
0,05 моль/л раствора едкого натра. После раст-
ворения смывают водой в мерную колбу вмести-
мостью 250 мл и доводят водой до метки. 6. DL-
Скорректированную величину опытной про-
А с п а р а г и н о в а я кислота или I.-аспарагиновая
бы используют в дальнейших расчетах.
кислота *. 7. D L - А л а н и н или L - а л а н и н *. 8. а-
Р а с ч е т производят п о формуле:


* Если берется вместо DL-аспарагиновой
кислоты L - а с п а р а г и н о в а я , а вместо D L - а л а н и н а
L-аланин, то навеска уменьшается вдвое.
189
Р а с ч е т активности ферментов в сыворотке
Кетоглутаровая кислота. 9. Субстратный раст-
крови производят по калибровочному графику.
вор для определения АсАТ: 29,2 мг а-кетоглута-
Построение калибровочного графика: из кали-
ровой кислоты и 2,66 г DL-аспарагиновой
бровочного раствора готовят ряд разведений,
кислоты растворяют в 1 моль/л растворе едкого
к а к указано ниже.
натра. Едкий натр следует прибавлять осторож-
но, небольшими порциями, до полного растворе-
ния составных частей и до получения рН 7,4.
Активность
Калибро- Ди-
Раствор переливают количественно в мерную Пировино- фермента,
вочный стил-
колбу вместимостью 100 мл, ополаскивая 0,1 моль/л градная
№ нмоль/
про- раствор лиро- кислота
фосфатным буфером рН 7,4. Доливают буфер (с-л)
бир- пирувата ван-
в колбу до метки, тщательно перемешивают, ная
натрия,
ки
прибавляют 1 каплю хлороформа и сохраняют
АсАт, АлАТ
мл мкг
в холодильнике в замороженном виде. Перед МКМлПЬ
мл
употреблением замороженный раствор должен
полностью оттаять (повторное оттаивание не
1 0,55 4,4 0,05
0,05 278
рекомендуется). 10. Субстратный раствор для
2 0,5 8,8 556
0,1 0,1
определения АлАТ: 29,2 мг а-кетоглутаровой
0,45 13,2 0,15
3 0,15 834
кислоты и 1,78 г DL-аланина отвешивают на
0,2 0,4 17,6 0,2 1112
4
аналитических весах. Дальнейшая работа про-
0,35 22,0
5 0,25 0,25 1390
водится так же, как для субстратного раствора
АсАТ. 11. HCI 1 моль/л. 12. Раствор 2,4-динитро-
фенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитрофенилги-
дразина растворяют в небольшом количестве
Калибровочные пробы ставят так же, как
1 моль/л раствора HCI при нагревании на водя-
опытные, но вместо сыворотки добавляют разве-
ной бане. После охлаждения доводят объем
денные калибровочные растворы. Измеряют
НС1 до 100 мл. На следующий день реактив
против холостой пробы, в которую вместо ка-
фильтруют. Раствор стабилен при хранении в
либровочных растворов добавляют воду. Кали-
холодильнике в посуде из темного стекла. 13. Натр
бровочная к р и в а я линейна до величины экстинк-
едкий, 0,4 моль/л, свободный от карбонатов.
ции 0,3.
Бутыли с реактивом и водой закрывают пробка-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : для АсАТ,
ми с поглотительными трубками, н а п о л н е н н ы м и
АлАТ 28—190 н м о л ь / ( с - л ) [0,1—0,68 мкмоль/
натронной известью. 14. Пировинограднокислый
( ч - м л ) ] при 37 °С.
натрий. Для приготовления калибровочного
Оценка а н а л и т и ч е с к о й надеж-
раствора 11 мг кристаллического пирувата
н о с т и м е т о д а . Воспроизводимость: коэф-
н а т р и я (белого цвета) растворяют в небольшом
фициенты в а р и а ц и и составляют 2—6 % в зави-
количестве воды, переносят в мерную колбу
симости от условий определения. Правильность
вместимостью 100 мл и доводят объем раствора
метода зависит в значительной степени от пра-
до метки водой; 1 мл раствора содержит 110 мкг
вильного построения калибровочной кривой и
пирувата натрия, что соответствует 88 мкг (или
правильной постановки холостой пробы. Специ-
1 мкмолю) пировиноградной кислоты.
фичность: абсорбционная способность гидразо-
Материал для исследования.
на щавелевоуксусной и пировиноградной кислот
Сыворотка крови, свободная от гемолиза.
выше, чем гидразона а-кетоглутаровой кислоты
Х о д о п р е д е л е н и я А с А Т . Опытная п р и 500 нм. Интерференция: ацетилсалициловая
проба: в пробирку вносят 0,5 мл субстратного кислота ( а с п и р и н ) , барбитураты, пенициллин,
раствора для определения АсАТ, нагревают при опиаты завышают результаты во всех методах.
37 °С в течение 5 мин, добавляют 0,1 мл сы-
Л и т е р а т у р а . Reltman S., Frankel S.
воротки и инкубируют п р и 37 °С 30 мин.
Amer. J. C l i n . Pathol., 1957, vol. 28, p. 56.
Затем добавляют 0,5 мл раствора
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Несмотря
2,4-динитрофенилгидразина и выдерживают в
на отсутствие органной специфичности, опреде-
течение 20 мин при комнатной температуре.
ление АсАТ и АлАТ при заболеваниях печени
Добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого
и сердца имеет большую диагностическую цен-
натра, тщательно перемешивают и оставляют
ность. При инфаркте миокарда активность АсАТ
для развития окраски на 10 м и н при комнатной
в сыворотке крови повышена: активность воз-
температуре. Измеряют на ФЭКе при длине
растает через 4—6 ч после инфаркта миокарда
волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в
и снижается до нормы на 3—7-й день.
кювете с толщиной слоя 1 см против холостой
Особенно важное значение имеет определе-
пробы.
ние аминотрансфераз для раннего выявления
Холостую пробу ставят так же, как опытную,
гепатита. Острый гепатит сопровождается рез-
но сыворотку добавляют после и н к у б а ц и и .
ким повышением АлАТ; АсАТ при этом также
Х о д о п р е д е л е н и я А л А Т . В пробир- повышена, но обычно ниже активности АлАТ.
ку вносят 0,5 мл субстратного раствора АлАТ Активность АлАТ начинает увеличиваться уже
и нагревают при 37 °С в течение 5 мин. Затем в продромальной стадии, когда другие признаки
вносят 0,1 мл сыворотки и инкубируют при болезни еще не появились. Коэффициент Де
37 °С 30 м и н . Д а л ь н е й ш и й ход а н а л и з а осу- Ритиса А с А Т / А л А Т < 1. При тяжелом пораже-
ществляют так же, как и при определении нии печени соотношение активности ферментов
АсАТ, меняется.

190
5.2.3. а-Амилаза литические и иммунологические свойства, незна-
чительно отличаются по электрофоретической
подвижности, но разделяются при гель-фильтра-
а-Амилаза (1,4-а-D-глкжан глюканогидро-
ции на ДЭАЭ-сефадексе.
лаза, К. Ф. 3.2.1.1) — один из первых открытых
Методы определения а-амилазы в биологи-
ферментов; катализирует эндогидролиз а-1,4-
ческих жидкостях.основаны на различных прин-
глюкозидных связей крахмала, гликогена и род-
ципах: сахарифицирующие или редуктометри-
ственных им полисахаридов до мальтозы,
ческие методы — на определении образующихся
декстринов и других полимеров. У человека
из крахмала Сахаров (метод Энгельгардта —
а-амилаза секретируется поджелудочной и слюн-
Герчука, 1925); амилокластические — на опре-
ными железами, небольшая ее активность об-
делении остатка нерасщепленного крахмала по
наруживается в тканях печени и скелетной
степени интенсивности его окраски с йодом (ме-
мускулатуры. Молекулярная масса а-амилазы
тоды Самоги, Смита — РОЭ, Каравея). Амило-
относительно низкая (˜ 48000); в отличие от
кластические методы более чувствительны и
большинства ферментов она фильтруется в
специфичны, чем редуктометрические, но также
клубочках почек и содержится в моче. а-Амила-
не лишены недостатков: точность их во многом
за состоит из двух изоферментов: панкреати-
зависит от качества крахмала и оптимизации
ческого (Р-тип) и слюнного (S-тип), каждый
условий определения.
из которых делится на несколько фракций.
Вискозиметрические методы основаны на
Изоферменты происходят соответственно из под-
измерении вязкости суспензии крахмала. Они
желудочной и слюнной желез. Существует
не отличаются высокой точностью и редко при-
также макроамилаза, которая не выделяется
меняются. Методы с применением хромогенных
почками из-за большой величины молекулы, но
субстратов основаны на использовании. ком-
может встречаться в сыворотке крови в норме
плексов субстрат-краситель, которые под дей-
и при патологии. У здоровых людей в сыворотке
ствием а-амилазы распадаются с образованием
крови около 70 % амилолитической активности
водорастворимого красителя. К новым методам
приходится на слюнной изофермент, в моче
определения активности а-амилазы относятся
приблизительно такой же процент приходится
методы, основанные на сопряженных фермент-
на панкреатическую изоамилазу. Два изофер-
ных реакциях.
мента а-амилазы имеют почти идентичные ката-




быть использованы также амилоза, мальто-
Наиболее перспективными являются фото-
метрические методы с применением субстра- триоза. Оптимум рН действия фермента на-
тов — п-нитрофенилмальтозида или п-нитрофе- ходится в пределах значений от 6,5 до 7,5.
нилмальтогептозида. Активность фермента значительно возрастает в
Зарубежными ф и р м а м и выпускаются наборы присутствии ионов хлора. В молекулу а-амилазы
реактивов с применением хромогенных субст- входит атом кальция. Ионы кальция не только
ратов; реже наборы реактивов, основанные на активизируют а-амилазу, но и предохраняют
сопряженных ферментных реакциях. Для опре- ее от потери активности и распада под влиянием
деления изоферментов а-амилазы наиболее протеолитических ферментов.
точными являются электрофоретические Ингибирование активности а-амилазы фто-
ридами, цитратом, оксалатом и ЭДТА объясня-
методы.
Оптимизация условий определения и унифи- ется связыванием ионов кальция. Вид буфера
не влияет на активность фермента. В большинст-
кация методов. В качестве субстрата в методах
определения а-амилазы чаще всего применяют ве стран применяются в качестве стандартных
амилокластические методы. В СССР в 1972 и
крахмал. Крахмал-полисахарид, состоящий на
1974 гг. утверждены в качестве унифицирован-
10—20% из амилозы, имеющей 1,4-глюкозид-
ных два амилокластических метода: Смита —
ные связи и растворимой в воде, и амилопек-
тина, нерастворимого в воде, имеющего, кроме Роя и Каравея.
Унифицированный амилокластический метод
того, 1,6-глюкозидные связи. Содержание
со стойким крахмальным субстратом (Каравея).
амилозы в различных препаратах крахмала
варьирует, поэтому качество крахмала имеет П р и н ц и п. а-Амилаза гидролизует расщепле-
большое значение. Предпочтительнее использо- ние крахмала с образованием конечных про-
вать крахмал, обладающий лучшей раствори- дуктов, не дающих цветной реакции с йодом.
мостью и дающий н а и в ы с ш у ю интенсивность Об активности а-амилазы судят по уменьше-
окраски с иодом. В к а ч е с т в е субстрата мшгут нию и н т е н с и в н о с т и окраски.

191
Р е а к т и в ы . 1 . Бензойная кислота ч.д.а. где Е1 — э к с т и н к ц и я холостой пробы; Е2 —
или х.ч. 2. Натрия фосфат двузамещенный без- э к с т и н к ц и я опытной пробы; С — количество
водный (Na 2 HPO 4 ) ч.д.а. 3. Крахмал раствори- к р а х м а л а , введенного в опытную и холостую
мый для нефелометрии или к р а х м а л по L i n t n e r . пробы (0,2 мг в микроварианте); / — коэффи-
Крахмал по L i n t n e r выпускается зарубежными ц и е н т пересчета на 1 с и н к у б а ц и и ; К — коэф-
ф и р м а м и специально для использования его фициент пересчета на 1 л биологической жид-
в качестве субстрата при определении а-амила- кости с учетом разведения.
зы. 4. Натрия хлорид, 0,154 моль/л. 5. Субстрат- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Сыворотка
но-буферный раствор рН 7,0: 13,3 г Na 2 HPО 4 крови: 3,3—8,9 мг/(с • л), или 12—32 м г / ( ч • мл).
и 2 г бензойной кислоты растворяют в 250 мл Моча: до 44 м г / ( с • л ) , или до 120 м г / ( ч • мл).
0,154 моль/л хлорида натрия и доводят до Дуоденальное содержимое: 1,7 -4,4 г / ( с • л ) ,
кипения. Суспендируют 0,2 г растворимого крах- или 6—16 г / ( ч • мл). Коэффициент пересчета
мала в небольшом количестве холодной воды в единицы СИ — м г / ( с • л) — равен 0,278.
и вводят в к и п я щ и й буферный раствор. К и п я т я т В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициент
1 м и н , охлаждают и доводят водой до 500 мл. в а р и а ц и и 5—10 %. Линейность реакции сохра-
Стабилен при хранении при комнатной темпера- няется в течение 10 мин.
туре в течение 10—12 дней. Субстратно-буфер-
Л и т е р а т у р а . Caraway W. Т. Атег. J.
н ы й раствор должен быть прозрачным. 6. Калия
d i n . P a t h o l . , 1959, vol. 32, p.'97.
йодид ч.д.а., х.ч. 7. Калий йодноватокислый
ч.д.а., х.ч. 8. Калия фторид ч.д.а. 9. HCI кон- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Гиперами-
ц е н т р и р о в а н н а я , х.ч. 10. 0,01 н. раствор йода: лаземия и гиперамилазурия наблюдаются п р и
0,036 г йодноватокислого калия и 0,45 г йодида многих заболеваниях, но наиболее выражены
калия растворяют в 40 мл воды и медленно при при остром панкреатите, при котором активность
помешивании добавляют 0,09 мл концентри- увеличивается в основном (до 90 % и более)
рованной НС1. 5 г фторида калия растворяют за счет панкреатического изофермента. При дан-
в 50 мл воды, фильтруют в мерную колбу, ном заболевании наибольший подъем содержа-
приливают 40 мл раствора йода и доливают ния амилазы в крови и моче отмечен в первые
водой до 100 мл. Хранят в посуде из темного 1—3 сут. Г и п е р а м и л а з у р и ю панкреатического
стекла. Годен в течение месяца. Если в рабочий происхождения вызывают также такие заболе-
раствор йода не добавляют фторид калия, то вания, к а к вирусный гепатит, рак поджелудоч-
его следует готовить ежедневно. ной железы. К гиперамилаземии непанкреати-
ческого происхождения относят поражение
Материал для исследования.
слюнных желез, п о ч е ч н у ю недостаточность.
Свежая сыворотка или плазма крови, моча или
П р и ч и н а м и повышения а - а м и л а з ы в крови
дуоденальное содержимое, предварительно раз-
веденное 154 ммоль/л раствором хлорида натрия являются нарушение секреции желез, содержа-
в 100 раз. щих а-амилазу, недостаточность выделения
п о ч к а м и а м и л а з ы из организма. Имеется ряд
Ход о п р е д е л е н и я . М и к р о в а р и а н т .
Опытная проба: 0,5 мл субстратно-буферного заболеваний, п р и которых трудно объяснить
раствора помещают в пробирку, нагревают наличие г и п е р а м и л а з е м и и : холецистит, перито-
н и т , ожог, острый аппендицит.
5 мин п р и 37 °С, добавляют 0,01 мл биологи-
ческой жидкости. Инкубируют 7,5 мин при Гиперамилаземию вызывают многие фарма-
кологические вещества — кортикостероидные
37 °С. Время и н к у б а ц и и следует строго отсчиты-
вать по секундомеру с момента добавления био- п р е п а р а т ы , с и л и ц и л а т ы , тетрациклин, фуросе-
логической жидкости в к р а х м а л ь н ы й субстрат. мид, гистамин. Для а-амилазы крови характер-
Тотчас же после и н к у б а ц и и добавляют 0,5 мл ны широкие в н у т р и - и межиндивидуальныс
0,1 н. раствора йода и доводят объем водой в а р и а ц и и . Наиболее и н ф о р м а т и в н ы м с д и а г н о -
до 5 мл. Измеряют на ФЭКе в кювете с толщи- стической точки зрения является определение
ной слоя 1 см при длине волны 630—690 нм панкреатической изоамилазы.
( к р а с н ы й светофильтр) против воды.
Холостую пробу ставят так же, как опытную,
5.2.4. у-Глутамилтрансфераза
биологическую жидкость добавляют поело
и н к у б а ц и и вместе с 0,1 н. раствором йода. Изме-
ряют п р и тех же условиях, что и опытную у-Глутамилтрансфераза [ (5-глутамил) -
пробу, против воды. пептид: аминокислота 5-глутамилтрансфераза,
Макровариант. Ход определения у-глутамилтранспептидаза; К.Ф. 2.3.2.2] откры-
опытной и холостой проб тот же, что и при та в 1950 г.; выделена и очищена в 1963 г.
микроварианте, но объем всех реактивов и ис- Фермент катализирует реакцию переноса у-глу-
следуемой жидкости увеличивают в 5—10 раз. тамилового остатка глутамиловой кислоты на
Р а с ч е т . Активность а - а м и л а з ы выражают а к ц е п т о р н ы й пептид или на L-аминокислоту.
в м и л л и г р а м м а х или граммах крахмала, гидро- у-ГТФ содержится почти во всех органах чело-
лизованного 1 л биологической жидкости за века, наибольшая удельная активность опре-
1 с и н к у б а ц и и при 37 °С. Расчет производят деляется в ткани почек. Фермент не является
по формуле: гомогенным, в зависимости от вида патологии
активность а-а.милазы, м г / ( с • л) = количество ф р а к ц и й может меняться.
Методы определения активности у-ГТФ
различаются по используемому субстрату. В пер-
вых методах применялись физиологические суб-

192
в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят
страты, например глутатион. Методы этой груп-
до метки водой и растворяют. Для определе-
пы трудоемки, малочувствительны и имеют
н и я активности у-ГТФ можно пользоваться
лишь историческое значение. Позднее стали
набором реактивов «Лахема» (ЧССР).
применяться методы, в которых использовались
М а т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я . Сы-
следующие субстраты: L-y-глутамилнафтила-
мид; L-v-глутамил-п-нитроанилид (методы воротка или плазма крови. Гемолиз не влияет
Орловского и др.); L-y-глутамиланилид (метод на активность фермента.
Х о д о п р е д е л е н и я . Опытная проба: в
Гольдберга и др.). Наиболее распространены
пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и
методы с применением в качестве субстрата
Ь-у-глутамил-п-нитроанилида. Позднее был помещают в водяную баню при температуре
описан более быстрорастворимый субстрат — 37 °С, приливают 0,05 мл сыворотки крови; со-
держимое перемешивают и инкубируют точно
производное Ь-у-глутамил-п-нитроанилида —
15 м и н п р и 37 °С. Затем прибавляют 3 мл
Ь-у-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид. Дан-
раствора уксусной кислоты и перемешивают.
ный субстрат используется в наборах реактивов
Холостую пробу ставят так же, как опытную,
фирмы «Boehringer M a n n h e i m » (ФРГ). В ка-
но сыворотку добавляют после инкубации. Изме-
честве буферов могут применяться трис-буфер,
ряют на спектрофотометре при длине волны
глицил г л и ц и н о в ы й , 2-амино-2-метил-1,3-про-
410 нм или на ФЭКе при длине волны 400—
пандиоловый. Вид буфера почти не оказывает
500 нм (фиолетовый или синий светофильтр)
влияния на активность фермента. Преимуще-
в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой
ство глицилглицинового буфера состоит в том,
пробы. Окраска стабильна в течение нескольких
что он одновременно является и буфером, и
часов.
акцептором у-глутамилового остатка.
Р а с ч е т активности производят п о кали-
В СССР в 1979 г. в качестве унифицирован-
бровочной кривой. Построение калибровочной
ного утвержден метод с субстратом L-y-глута-
кривой: из основного калибровочного раствора
мил-п-нитроанилидом и глицилглициновым бу-
готовят рабочие растворы, как указано ниже.
фером.
Унифицированный метод с субстратом L-y-
глутамил-п-нитроанилидом. П р и н ц и п . у-ГТФ
Калибровоч- Активность
катализирует реакцию переноса L-y-глутами- № калиб- Дистилли-
ный раствор у-ГТФ,
ровочного рованная
лового остатка с L-y-глутамил-п-нитроанилида п-нитроани- нмоль/
раствора вода, мл
на глицилглицин. Количество освобожденного лина, мл (с-л)
в ходе реакции n-нитроанилина измеряется
и служит мерой активности у-глутамилтрансфе-
417
0,25 3,75
1
разы:
2 3,50 833
0,50
3,00 1 667
3 1,00
4 1,00 1,00 3334
5001
5 1,50 0,50
6 2,00 6668



Р е а к т и в ы . 1. L-y-Глутамил-п-нитроани-
В каждую из 6 пробирок наливают по 0,05 мл
лид. 2. Натрия хлорид ч.д.а., х.ч. 3. Глицил-
рабочих калибровочных растворов № 1—6,
глицин, 0,55 моль/л, рН 8,3 : 3,63 г глицилгли-
прибавляют по 3,5 мл раствора уксусной кис-
цина помещают в мерную колбу вместимостью
л о т ы , п е р е м е ш и в а ю т и измеряют экстинкцию
50 мл, доливают до метки водой и растворяют
против раствора уксусной кислоты при тех же
(буферный раствор). 4. Субстратно-буферный
условиях, что и опытную пробу. По полученным
раствор: в пробирку наливают 10 мл воды и
з н а ч е н и я м экстинкции строят калибровочную
добавляют 0,028 г L-y-глутамил-п-нитроанили-
кривую. Линейность калибровочного графика
да и 0,082 г хлорида натрия и, не переставая
сохраняется до активности 5000 н м о л ь / ( с • л ) .
мешать, растворяют содержимое пробирки на
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Мужчины:
к и п я щ е й водяной бане в течение 60 с. Затем
250—1767 н м о л ь / ( с - л ) , или 15—106 ME; жен-
раствор охлаждают до 37 °С и добавляют 2,5 мл
щины: 167—ПО н м о л ь / ( с - л ) , или 10—66 ME
буферного раствора. Приготовленный раствор
при 37 °С.
субстрата во время работы хранят в водяной
В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-
бане при 37 "С. Неиспользованный раствор суб-
страта можно хранить в холодильнике в течение ты в а р и а ц и и 1—4 %.
недели. Субстрат плохо растворим и п р и комнат- С п е ц и ф и ч н о с т ь . Расщепление у-глу-
ной температуре выпадает в осадок. Поэтому т а м и л о в ы х пептидов другими пептидами не-
перед употреблением выкристаллизовавшийся известно.
субстрат растворяют нагреванием в кипящей
Л и т е р а т у р а . Инструкция к набору
водяной бане. Нагревание и растворение суб-
реактивов Био-Ла-Тест для определения актив-
страта можно повторить не более 2 раз. 5. Уксус-
ности у-глутамилтранспептидазы в сыворотке
ная кислота ледяная ч.д.а., х.ч., раствор 100 г/л:
крови, «Лахема» ЧССР.
10 мл кислоты доводят водой до 100 мл.
6. Основной калибровочный раствор п-нитро- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Несмотря
на высокую активность у-ГТФ в почках, опре-
а н и л и н а : 0,0829 г n-нитроанилина помещают

7 п/р В. В. Меньшикова 193
деление активности фермента в сыворотке крови зуют для определения активности фермента.
проводят преимущественно для диагностики за- Хранят в холодильнике. 3. Феназина метасуль-
фат, 0,02 г/л. Раствор нестабилен, готовят перед
болевания печени и желчных путей. Повыше-
употреблением. 4. НС1, 1 моль/л. 5. Трис-буфер,
ние активности у-ГТФ наблюдается при забо-
леваниях желчных путей с явлениями обтура- 0,74 моль/л, рН 8,0: 44,8 г трис-(оксиметил)-
ции, при гепатитах, опухолях и метастазах аминометана растворяют в 200 мл воды, при-
бавляют 1 моль/л раствор HCI до получения
в печень. Активность у-ГТФ в сыворотке крови
увеличивается, как правило, параллельно увели- рН 8,0 и доводят водой до 500 мл. Хранят
чению активности щелочной фосфатазы, но в холодильнике. 6. Раствор 2,6-дихлорфенолин-
активность у-ГТФ увеличивается раньше, дер- дофенолята натрия в трис-буфере. К 5,8 мг
жится на повышенных цифрах более длительное 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия прибав-
время и относительное увеличение активности ляют 40 мл 0,7 моль/л трис-буфера рН 8,0.
фермента в несколько раз выше, чем щелочной Хранят в холодильнике. 7. Смесь реактивов,
фосфатазы. состоящая из 1 части раствора NADP, 1 части
Наркотики, седативные средства, этанол раствора глюкозо-6-фосфата, 2 частей раствора
индуцируют активность у-ГТФ печени. Поэтому феназина метасульфата, 16 частей раствора
у-ГТФ является чувствительным тестом для 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Смесь
диагностики алкогольно-токсических заболера- реактивов нестабильна, готовят перед упот-
ний печени. Исследование изоферментов у-ГТФ реблением.
не имеет большого диагностического значения. Х о д о п р е д е л е н и я . Опытная проба: в
При острых панкреатитах активность фермента пробирку наливают 1 мл воды, добавляют
повышена незначительно. 0,02 мл крови и после наступления полного
гемолиза (через 6—10 м и н ) прибавляют 0,5 мл
5.2.5. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа смеси реактивов. При проведении массовых ис-
следований прибавление смеси может быть
проведено одновременно в 35—40 пробах. Время
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (d-глюко-
зо-6-фосфат: NADP 1-оксидоредуктаза; К.Ф. от момента взятия крови до прибавления реакти-
вов не должно превышать 45 мин. Через 30 мин
1.1.1.49) впервые была изолирована Варбургом
производят оценку результатов.
из эритроцитов. Наибольшая активность фер-
мента определяется в эритроцитах, менее богаты Контрольную пробу ставят так же, как опыт-
Г-6-ФДГ печень, поджелудочная железа, почки, ную, для исследования берут кровь практически
легкие. здорового человека.
Методы определения. Применяют оптический О ц е н к а р е з у л ь т а т о в . При отрица-
тест, а также качественные методы, основан- тельной реакции (в норме) происходит полное
ные на восстановлении NADP и 2,6-дихлорфено- обесцвечивание краски; при сомнительной —
линдофенола в присутствии феназина метасуль- явное обесцвечивание, но по сравнению с конт-
фата; оптимум рН фермента между рН 7,4 и рольной пробой остается зеленоватый оттенок;
8,6. Определение активности фермента можно при положительной реакции обесцвечивания
проводить в фосфатном, триэтаноламиновом, краски не происходит или происходит очень
глицилглициновом буферах и трис-буфере. незначительно.
I
Ионы м а г н и я активируют фермент. Описанный
П р и м е ч а н и я . 1. При работе в экспе-
ниже метод утвержден в качестве унифициро-
диционных условиях заранее приготовляют
ванного в 1974 г. Активность фермента опре-
навески реактивов в зависимости от количе-
деляют в эритроцитах.
ства исследований, запланированных на
Проба Бернштейна (унифицированный ме- один раз. 2. Сомнительные реакции не должны
тод). П р и н ц и п . Глюкозо-6-фосфат в при- приниматься в расчет при массовом обследо-
сутствии Г-6-ФДГ эритроцитов и NADP окис- вании населения; плохо вымытая пробирка
ляется с образованием NADPH. NADPH вос- может симулировать сомнительную реак-
станавливает феназин метасульфат, который в
цию. При массовых обследованиях имеют
свою очередь восстанавливает 2,6-дихлорфенол- значение резко положительные и положи-
индофенол. Феназина метасульфат действует в тельные реакции. 3. Сомнительные реакции
этой реакции как активный переносчик электро- следует принимать во внимание и проверять
нов от NADP к краске. активность фермента количественным мето-
Р е а к т и в ы . 1 . Никотинамидадениндинук- дом у женщин с подозрением на гемолити-
леотидфосфат (NADP). 5,75 мг NADP раство- ческую анемию, обусловленную дефицитом
ряют в 2,5 мл воды. Раствор стабилен в те- активности фермента, особенно после приема
чение 4 нед при хранении в холодильнике. лекарств, вызывающих гемолитические кри-
2. D-Глкжозо-б-фосфорной кислоты динатрие- зы у этих больных.
вая соль: 38 мг глюкозо-6-фосфата растворяют
Л и т е р а т у р а . Идельсон Л. И., Кото-
в 2,5 мл воды. В продаже чаще имеется бариевая
ян Э. Р. Лаб. дело, 1970, № 7, с. 428; Bern-
соль глюкозо-6-фосфата; перевод ее в динатрие-
stein R. Е. Nature, 1962, vol. 194, p. 192.
вую соль осуществляется следующим образом:
60 мг бариевой соли глюкозо-6-фосфата раство- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Дефицит
активности Г-6-ФД эритроцитов относится к
ряют в I мл воды, добавляют 0,2 мл насыщен-
ного раствора сульфата натрия, центрифуги- наиболее распространенным наследственным
руют. Отбирают весь надосадочный слой и аномалиям; наследуется дефицит Г-6-ФД доми-
нантно, клинически проявляется как гемолити-
прибавляют к нему 1,3 мл воды. Раствор исполь-

194
ческая анемия. При массовых обследованиях обратимую реакцию фосфорилирования креа-
населения на выявление дефицита Г-6-ФД тина.
учитываются резко положительные и положи- КК человека состоит из двух субъединиц —
тельные результаты анализов. М, В, которые образуют три формы изофермен-
тов. ММ-фракция — мышечный т и п ; МВ-фрак-
ция — сердечный тип и ВВ-фракция — мозго-
5.2.6. Креатинкиназа вой тип.
Методы определения активности КК исполь-
Креатинкиназа (КК) (АТФ: креатин М-фос- зуют оба направления катализируемой реакции
фотрансфераза; К.Ф. 2.7.3.2) катализирует с определением образующихся соединений.




Унифицированный метод с использованием
Образующийся в данной реакции креатин
креатина в качестве субстрата. П р и н ц и п .
может быть определен фотометрически по реак-
ции с а-нафтолом, флуорометрически — по Активность фермента пропорциональна количе-
реакции с нингидрином, а также может быть ству неорганического фосфора, образующегося
использован как субстрат в непрямом опти- в результате кислотного гидролиза синтезиро-
ческом тесте. ванного ферментом креатинфосфата. Неоргани-
Реакция с субстратом креатинфосфатом ческий фосфор определяется по цветной реакции
с молибдатом а м м о н и я .
более чувствительна, чем с креатином, и ее
используют чаще для определения активнос- Р е а к т и в ы . 1. Аденозин-5 -трифосфорной
кислоты динатриевая соль. 2. L-Цистеин,
ти КК.
Методы, основанные на оптическом тесте, 0,024 моль/л: 2,9 мг растворяют в 1 мл воды.
точные, однако без готовых наборов реактивов Готовят раствор перед употреблением. На одну
постановка их трудоемка и требует наличия пробу требуется 0,1 мл. 3. Креатин. 4. Магния
чистых кристаллических ферментов. Более сульфат 7-водный, ч.д.а. 5. А м м о н и й молибде-
простыми являются фотометрические методы, новокислый 4-водный х.ч., 0,02 моль/л: 2,5 г
основанные на определении неорганического молибденовокислого аммония растворяют в
фосфора, освобожденного в результате гидроли- мерной колбе в 70—80 мл воды и доводят
за креатинфосфата. Большинство коммерческих объем до 100 мл водой. 6. Натрия сульфат
наборов реактивов основано на оптическом безводный ч.д.а. 7. Натрий сернистокислый
тесте. Результаты, получаемые с помощью набо- пиро (метабисульфит натрия) ч.д.а. 8. 1-Амино-
ров реактивов, выпускаемых р а з л и ч н ы м и фир- 2-нафтол-4-сульфокислота (эйконоген) ч.д.а.
мами, как правило, не дают сопоставимых 9. Серная кислота, 2,5 моль/л. 10. НС1, 0,1 моль/л.
результатов исследования, что связано с раз- 1 1 . Трис-(оксиметил)-аминометан (трис), ч.д.а.
л и ч н ы м и условиями определения. 12. Трис-буфер, 0,133 моль/л, рН 9,0: 1,61 г
Оптимизация условий определения и унифи- трис растворяют в мерной колбе вместимостью
кация методов. В большинстве стран в каче- 100 мл в 50—60 мл воды, устанавливают рН
стве стандартного предложен метод, основан- буфера 0,1 моль/л раствором HCI и доводят
ный на оптическом тесте по обратной реакции. водой до метки. 13. Раствор эйконогена: 15,36 г
пиросернистокислого натрия, 0,512 г сернисто-
Однако национальные различия касаются вида
кислого натрия и 0,128 г эйконогена растворяют
буфера, активатора, концентрации реактивов,
в 70—80 мл воды, взбалтывают, доводят объем
температуры определения. На активность фер-
водой в мерной колбе до 100 мл и дважды
мента в значительной степени влияют исполь-
фильтруют (через 2 ч и через сутки после
зуемые в качестве активаторов различные тиоло-
приготовления). Раствор следует беречь от
вые соединения. В качестве унифицированного
яркого света; в случае выпадения осадка вновь
в нашей стране п р и н я т метод по определению
фильтруют. Стабилен в течение 1 мес при хра-
фосфора.

195
н е н и и в холодильнике. 14. Основная смесь
реактивов, содержащая 0,02 моль/л сульфата Коли-
Кали-
магния, 0,033 моль/л креатина и 0,0067 моль/л Актив-
чество
бровоч- Дистилли-
АТФ: 0,4920 г сульфата м а г н и я , 0,4326 г № про- фосфо- ность КК,
бирки ный ра- рованная
креатина и 0,3692 г АТФ растворяют в 70—80 мл нмоль/
ра в
створ, вода, мл (с-л)
трис-буфера (для полного растворения креатина пробе,
мкг
смесь нагревают в течение 5—10 мин на водяной
бане п р и 40—45 °С). Затем объем основной
смеси реактивов доводят трис-буфером в мерной
14,4 45
1,0
1 1
колбе до 100 мл. 15. Трихлоруксусная кислота
2
2 7,7 90
1,0
ч.д.а., 4,9 моль/л: 80 г ТХУ растворяют в 50—
3 135
3 1,0 5,13
60 мл воды и объем раствора доводят в мерной
4 4 180
2,85
1,0
колбе до 100 мл. 16. Смесь растворов для
2,08 5 225
5 1,0
проведения кислотного гидролиза креатинфос-
фата. Смесь готовят перед употреблением,
учитывая, что на одну пробу расходуют 2 мл.
Смесь состоит из 0,25 мл раствора молибдено-
вокислого а м м о н и я , 0,25 мл раствора серной ных пределах, и точных данных установить не
кислоты и 1,5 мл воды (соотношение 1 : 1 : 6 ) . удалось. Активность ММ-фракции составляет

<<

стр. 10
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>