<<

стр. 11
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

более 90 %, а КК MB — менее 2 % от общей
17. Калия фосфат однозамещенный безводный
х.ч. (для приготовления калибровочного раство- активности КК.
ра): 0,0169 г КН 2 РО 4 растворяют в воде и объем П р и м е ч а н и е . Если активность К К
раствора доводят в мерной колбе до 100 мл. превышает 500 н м о л ь / ( с - л ) , то время
С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . Фо- и н к у б а ц и и сокращают до 15 или 10 м и н ;
тоэлектроколориметр. полученные величины активности умножают
М а т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я . Све- соответственно на 2 или 3. Разбавлять сы-
жая сыворотка или плазма крови. При хране- воротку не рекомендуется, так как актив-
нии в холодильнике и при комнатной температу- ность фермента при разведении сыворотки
ре активность фермента падает. изменяется непропорционально.
Ход о п р е д е л е н и я . Предварительно
все растворы реактивов прогревают в течение В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициент
вариации составляет в среднем 10 %.
5 мин при 37 °С. Опытная проба: в пробирку
вносят 1,5 мл основной смеси реактивов, 0,1 мл Л и т е р а т у р а . Ертанов И. Д., Борисен-
раствора цистеина и 0,4 мл сыворотки крови. коЛ. М., Делекторская Л. Н. В кн.: Унификация
Содержимое пробирки осторожно перемеши- лабораторных методов исследования / Под ред.
вают и ставят в термостат при 37 °С на 30 мин. В. В. Меньшикова.— М., 1980, с. 16---28; Левин
Затем прибавляют 0,2 мл раствора трихлор- Ф. Б., Березов Т. Т., Кушниренко Е. А. Лаб.
уксусной кислоты, перемешивают стеклянной дело, 1973, № 4, с. 229—231; Kuby S., Noda L.,
палочкой и центрифугируют при 3000 об/мин Lardy H. A. J. h i o l . Chern., 1954, vol. 209, p. 191.
в течение К) м и н . Холостую пробу ставят так же,
как опытную, но сыворотку добавляют после Метод с использованием креатинфосфата в
прибавления раствора трихлоруксусной кисло- качестве субстрата. П р и н ц и п . Активность
ты. Из опытной и холостой проб забирают по фермента пропорциональна количеству креати-
1 мл надосадочной жидкости и переносят в х и м и - на, образующегося в результате ферментатив-
ческие пробирки ( м а р к и р о в а н н ы е соответствую- ной реакции. Креатин определяется но цветной
щим образом), в которых содержится по 2 мл реакции с а-нафтолом.
смеси растворов для проведения специфического Р е а к т и в ы . 1 . Трис-(оксиметил)-аминоме-
гидролиза креатинфосфата. Полученную смесь тан (трис) х.ч. 2. Магния сульфат ч.д.а., х.ч.
растворов перемешивают и оставляют при ком- 3. Трис-буфер, 0,1 моль/л, рН 7,4, содержа-
натной температуре на 30 мин (время гидролиза щ и й 0,015 моль/л Mg +2 (в виде MgSO 4 ):
креатинфосфата). После этого в пробы добавля- 1,21 г триса и 0,180 г MgSO4 помещают в
ют с интервалом 1 м и н по 0,25 мл раствора мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают
эйконогена и точно через 15 м и н опытную пробу водой до метки. Раствор стабилен в течение
измеряют против холостой пробы при длине месяца при хранении в холодильнике. 4. Креа-
волны 600—700 нм (красный светофильтр) в тинфосфат, динатриевая соль, 0,012 моль/л,
кювете с толщиной слоя 0,5 см. рН 7,4: растворяют 0,044 г креатинфосфата в
10 мл воды. Раствор стабилен в течение недели
Р а с ч е т производят п о калибровочному
графику. Построение калибровочного графика; при х р а н е н и и в холодильнике. 5. Аденозин-
5-дифосфорной кислоты натриевая соль, 0,004
готовят калибровочные пробы, как указано ниже.
моль/л, рН 7,4: 0,017 г аденозиндифосфата
Из каждого калибровочного раствора берут
натрия (мол. м. 449) растворяют в 10 мл воды.
по 0,4 мл и обрабатывают, как опытные пробы.
Раствор стабилен в течение недели при хранении
В холостую пробу вместо калибровочных раство-
ров берут по 0,4 мл воды. в холодильнике. 6. Бария гидроокись 8-водная
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : д о 100 ч.д.а. или х.ч., 50 г/л: 5 г безводной гидро-
нмоль/л(с • л), или до 6 ME. окиси бария или 8 г 8-водной гидроокиси бария
Активность изоферментов КК в сыворотке помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл
крови у здоровых лиц колеблется в значитель- и доливают до метки водой, не содержащей

196
СО2. 7. Цинка сульфат ч. д. а., х.ч., раствор скелетной мускулатуры. К поражениям сердеч-
50 г/л: 5 г сульфата цинка помещают в мерную ной мышцы, которые могут вызвать повышение
колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки активности фермента, помимо инфаркта, отно-
водой, не содержащей СО2. 8. а-Нафтол (1 -наф- сятся миокардиты, сердечная недостаточность,
сердечные аритмии. При этом активность КК
тол) ч.Д.а. 9. Натрия карбонат ч.д.а. 10. Натрия
может увеличиться в 20—30 раз по сравнению
гидроокись ч.д.а. 11. Раствор а-нифтола 10 г/л:
1 г а-нафтола, 16 г карбоната натрия и 6 г гидро- с нормой. При поражении скелетной мускулату-
окиси натрия помещают в мерную колбу вмести- ры уровень активности фермента достигает зна-
мостью 100 мл и доводят до метки водой. Раст- чительно более высоких цифр. При инфаркте
вор готовят не ранее чем за 2 ч до использова- миокарда, как правило, подъем активности КК
наступает через 4—8 ч, максимальная актив-
ния. 12. Основной раствор диацетила в этиловом
спирте: 0,2 мл диацетила растворяют в 20 мл ность наблюдается через 16—36 ч и нормаль-
этилового спирта. 13. Рабочий раствор диацети- ный уровень устанавливается к 3—6-му дню. По-
ла 0,5 г/л: к 1 мл основного раствора прили- вышение активности КК может быть вызвано и
вают 20 мл воды. Раствор хранят в холодильни- рядом других причин — употреблением алкого-
ке. 14. Основной калибровочный раствор креати- ля, отравлением снотворными средствами,
на: 0,131 г креатина помещают в мерную колбу внутривенным введением ряда лекарственных
вместимостью 100 мл и доливают водой до веществ. МВ-фракция КК является высокоспе-
метки. 15. Рабочий калибровочный раствор цифичной для сердечной мышцы, активность
креатина, 150 мкмоль/л: 1,5 мл основного раст- ее повышается, как правило, при инфаркте
вора креатина помещают в мерную колбу миокарда.
вместимостью 100 мл и доводят водой до метки.
Раствор хранят в холодильнике.
Специальное оборудование.
5.2.7. Лактатдегидрогеназа,
Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр.
изоферменты лактатдегидрогеназы
Х о д о п р е д е л е н и я . Опытная проба:
0,3 мл буфера, 0,3 мл раствора креатинфосфата,
0,1 мл сыворотки нагревают 5 мин при 37 °С. Лактатдегидрогеназа — ЛДГ (L-лактат:
Добавляют 0,3 мл раствора аденозиндифосфа- NAD-оксидоредуктаза: К.Ф. 1.1.1.27) —глико-
та натрия и инкубируют 30 мин при 37 °С. литический фермент, открытый Мейергофом в
После инкубации добавляют по 0,5 мл растворов 1918 г., катализирует обратимую реакцию вос-
гидроокиси бария и сульфата цинка, центрифу- становления пировиноградной кислоты в молоч-
гируют 15 мин при 3000 — 4000 об/мин. К 1 мл ную.
центрифугата добавляют 1 мл воды, 1 мл раство-
ра а-нафтола, 0,5 мл раствора диацетила. Для
развития окраски пробу помещают в термостат
на 30 мин. Измеряют при 520 нм (зеленый
светофильтр). Холостую пробу ставят так же,
как опытную, но вместо раствора аденозинди- В кристаллическом виде впервые получена
фосфата натрия добавляют воду. в 1943 г. ЛДГ состоит из 5 изоферментов,
К а л и б р о в о ч н а я п р о б а . 0,3 м л буфе- представляющих собой различные комбинации
ра, 0,3 мл раствора аденозиндифосфата, 0,4 мл двух типов (М и Н) полипептидных цепей.
рабочего раствора креатина обрабатывают так Изофермент, преобладающий в мышечной тка-
же, как опытную пробу. Измеряют против ни, состоит из 4 идентичных М-цепей и его
холостой пробы. Холостую пробу ставят, как обозначают М 4 (ЛДГ 6 ); преобладающий в ткани
опытную, но вместо креатина берут воду. сердца, содержит 4 идентичные Н-цепи, и его
Р а с ч е т производят по формуле: обозначают как Н,((ЛДГ|). Остальные три изо-
фермента представляют собой различные соче-
тания М- и Н-цепей, а именно М 3 Н, М2Н2, МНз.
ЛДГ: наиболее быстро продвигается к аноду,
термостабилен, адсорбируется на ДЕАЕ-сефа-
дексе, тормозится высокой концентрацией пиру-
X 333 нмоль/(с • л ) ,
вата, незначительно инактивируется при дей-
ствии мочевины и щавелевоуксусной кислоты
где Eoп — экстинкция опытной пробы; Ехол —
и обладает одинаковой активностью при при-
экстинкция холостой пробы; Е к — экстинкция
менении а-кетобутирата и пирувата в качестве
калибровочной пробы; 333 — коэффициент пере-
субстрата.
счета на наномоли креатинфосфата, преформи-
рованного 1 л сыворотки за 1 с. ЛДГб при электрофорезе продвигается
медленнее других фракций, термолабилен, почти
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : от 0 до
220 нмоль/(с - л ) , или от 0 до 13 ME. полностью инактивируется при действии мочеви-
ны и щавелевоуксусной кислоты и обладает
Л и т е р а т у р а . Токарская 3. Б. Лаб. дело,
незначительной активностью при применении
1971, № 1, с. 24—27; Ennor A. H., Rosenberg H.
а-кетобутирата в качестве субстрата. ЛДГ 2 .
Biochem. J., 1954, vol. 57, p. 203.
ЛДГ 3 , ЛДГ 4 обладают промежуточными свой-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . В сыворот- ствами. При использовании в качестве субстрата
ке крови повышенная активность КК может а-кетобутирата определяется а-гидрооксибу-
быть следствием повреждения сердечной или тиратдегидрогеназа, являющаяся не самостоя-

197
тельным ферментом, а фракцией ЛДГ, ориенти- щенный (КН 2 РО 4 ) ч.д.а., х.ч. 2. Калия фосфат
ровочно соответствующая ЛДГ|. двузамещенный 3-водный (К 2 НРО4 • ЗНзО)
Методы определения. Наиболее аналитиче- ч.д.а. 3. Натрия пируват; содержание основ-
ски надежными для определения общей ЛДГ ного вещества не менее 99 %. 4. b-Никотинами-
являются спектрофотометрические методы, осно- дадениндинуклеотид восстановленный, дина-
ванные на прямом оптическом тесте Варбурга триевая соль. Коэффициент -1 молярного поглоще-
2 2
с использованием в качестве субстрата как ния не ниже 5,6 • 10 моль • м при 340 нм.
L-лактата, так и пирувата. Колориметрические 5. Фосфатный буфер 0,1 моль/л, рН 7,4, с раство-
динитрофенилгидразиновые методы более до- ром N A D H 0,165 ммоль/л и раствором пирувата
ступные, но менее точные. Редоксиндикаторные натрия 0,00103 моль/л: 0,16 г однозамещен-
методы основаны на превращении бесцветной ного фосфата калия, 2,07 г двузамещенного
окисленной формы тетразолиевых солей в окра- фосфата калия, 0,0117 г NADH и 0,0114 г
шенную восстановленную форму за счет окисле- пирувата натрия растворяют в 40—60 мл
ния NADH. 0,1 моль/л фосфатном буфере, доводят рН и
Для определения изоферментов ЛДГ наибо- доливают водой в мерной колбе до 100 мл.
лее распространенными являются электрофоре- Стабилен в течение суток при х р а н е н и и в холо-
тические методы. Хроматографические методы дильнике и 8 ч при хранении при комнатной
основаны на разной степени адсорбции изо- температуре. 6. Натрия хлорид, 154 ммоль/л.
ферментов ЛДГ на сефадексе. Возможно опре- С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . 1.
деление изоферментов ЛДГ по выбору опти- Спектрофотометр с термостатированной кю-
мальной концентрации субстрата для каждого ветой для микроизмерений. 2. Полуавтомати-
изофермента. Наиболее простыми и быстро ческие пипетки.
выполнимыми методами определения изофер- М а т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я . Све-
ментов являются методы, основанные на раз- жая сыворотка, свободная от гемолиза.
личном отношении Л Д 1 | и ЛДГ 5 к температуре Х о д о п р е д е л е н и я . Перед определени-
и действию мочевины. ем температура растворов и сыворотки должна
быть доведена до температуры измерения. Опре-
В методе, основанном на термической инакти-
деление проводят по следующей схеме.
вации изоферментов ЛДГ, сыворотку, смешан-
ную с буфером, инкубируют при 56; 60; 65 °С
30 мин. Затем определяют активность ЛДГ В термостатиро- Конечные
Опытная
в неинкубированной и инкубированной сыворот- ванную кювету концентрации
проба, мкл
ках и рассчитывают процент падения актив- (30 °С) приливают веществ в пробе
ности при инкубации при различной темпера-
туре. Сыворотка крови здоровых людей за 30 мин Буфер с NADH и 1. Фосфатный
при 56 °С теряет около 30 % своей активности, пируватом буфер, 0,1
650
при 65 °С — около 80%. При заболеваниях моль/л
печени при 56 °С сыворотка теряет активность 2. NADH, 0,16
до 50 % и при 65 °С — до 90 %. При сердечных ммоль/л
поражениях инактивация при 56 °С дает потерю Сыворотка 3. Пируват,
20
активности до 10 % и при 65 °С — около 60 %. 1 ммоль/л
Определение изоферментов ЛДГ по инги-
бированию мочевиной основано на свойстве
мочевины как ингибитора. Мочевина тормозит
Перемешивают, тотчас измеряют экстинкцию
ЛДГ 5 почти на 100 %. В большинстве случаев
определяется процент стабильной к мочевине и одновременно включают секундомер. Точно
фракции от общей ЛДГ, который при заболе- через 1 и 2 м и н (или через более короткие
промежутки времени) измеряют экстинкцию.
ваниях печени обычно составляет около 20 %.
В норме мочевиностабильная фракция состав- Измерение опытной пробы проводят против воды
ляет около 30% (20—36%). Однако указан- при 340 нм в кювете с толщиной слоя жидкости
ные методы недостаточно аналитически надежны. 1 см. Расчет производят по формуле:
Оптимизация условий измерения и унифи-
активность, моль/(с • м 3) = нмоль/(с -л) • 106 =
кация методов. Вид буфера почти не оказывает
влияния на активность фермента при определе-
нии общей ЛДГ. Оптимум рН равен 7,2—7,5.
Точные оптимальные концентрации реактивов
и оптимума рН зависят от состава изофер-
ментов ЛДГ. В большинстве стран в качестве
стандартных предложены методы, основанные где Vp,c — объем реакционной смеси; К С ы В —
на оптическом тесте, различия касаются условий А? -
определения. В нашей стране в 1974 г. утвержден объем сыворотки; t — в р е м я р е а к ц и и ; ——
в качестве унифицированного колориметриче-
ский динитрофенилгидразиновый метод. изменение экстинкции за секунду; е. — коэффи-
Унифицированный метод по оптимизирован- циент молярной экстинкции NADH, моль -1 • м 2 ;
ному оптическому тесту. П р и н ц и п. Различно l — толщина слоя жидкости в кювете, м (1х10-2).
спектров поглощения окисленной и восстанов- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : д о 3200
ленной форм NAD при 340 нм. нмоль/(с • л), или до 195 ME, при 25 °С. До
Р е а к т и в ы . 1. Калия фосфат однозаме- 5330 нмоль/(с • л), или до 320 ME при 30 °С.

198
В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен- Р а с ч е т активности производят по кали-
ты вариации составляют 5—6 %. бровочному графику.
Построение калибровочного гра-
Л и т е р а т у р а . Bergmeyer H. U. (Hrsg.)
ф и к а : из рабочего калибровочного раствора
Methoden der enzyrnalischen Analyse. Bd. 1.—
пирувата натрия готовят ряд разведений, как
Weinheim: Verlag Chemie, 1974, S. 607—612.
указано в таблице. Затем в пробирки прили-
Унифицированный метод по реакции с 2,4-ди- вают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидра-
нитрофенилгидразином (Севела — Товарека). зина. Далее калибровочные пробы обрабаты-
П р и н ц и п . L-Лактат под действием фермента вают и измеряют, как опытные. Холостую пробу
сыворотки в присутствии NAD окисляется в ставят так же, как калибровочную, но вместо
пируват, который определяется по цветной калибровочного раствора добавляют воду.
реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.
Р е а к т и в ы . 1. Молочная кислота 80%
ч.д.а., х.ч. 2. Натрия гидроокись ч.д.а., х.ч.,
растворы 2 моль/л; 0,4 моль/л. 3. 0,45 моль/л
раствор лактата натрия. В мерную колбу вмести-
мостью 100 мл вносят 5 мл 80 % молочной
кислоты, добавляют 2 моль/л раствора едкого
натра до получения рН 7,5 и доводят объем
водой до метки. Хранят в посуде из темного
стекла в холодильнике. 4. Натрия фосфат пиро
(Na 4 P 2 O7-10 Н 2 О) ч.д.а. 5. НС1 1 моль/л.
6. Натрия пирофосфат 0,03 моль/л, рН 8,8:
6,69 г натрия пирофосфата растворяют в неболь-
шом количестве воды, добавляют 1 моль/л
раствор НСl до получения рН 8,8 и доводят
объем водой до 500 мл. Стабилен в течение
месяца при хранении в холодильнике. 7. NAD
окисленная форма. Готовят из расчета 3 мг
NAD на 1 мл воды. Раствор стабилен в течение
4 нед при хранении в холодильнике. 8. Раствор Линейная зависимость между концентрацией
2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-ди- пировиноградной кислоты и оптической плот-
нитрофенилгидразина растворяют в небольшом ностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с • л).
количестве 1 моль/л раствора НС1 при нагре- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 220—1100
вании на водяной бане. После охлаждения до- нмоль/(с • л), или 0,8—4,0мкмоль/(ч • мл) при
водят объем 1 моль/л раствором НС1 до 100 мл. 37 °С.
На следующий день реактив фильтруют. Раст- В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициент
вор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен вариации около 10 %.
в течение 1 года. 9. Пируват натрия (для по- Л и т е р а т у р а . Seuela M., Tovarek J.
строения калибровочной кривой): 11 мг кристал-
Cas. Lek Cesk., 1959, vol. 98, N 27, p. 844.
лического пирувата натрия растворяют в не-
большом количестве бидистиллированной воды, Электрофоретическое разделение изофер-
переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл ментов ЛДГ на пленках из ацетата целлюлозы.
и доводят водой объем раствора до метки; П р и н ц и п . Изоферменты ЛДГ разделяются
1 мл раствора содержит 88 мкг пировиноград- путем электрофореза на пленке из ацетата цел-
ной кислоты. Рабочий раствор готовят разведе- люлозы при рН 8,6. Затем пленка инкубируется
нием основного раствора в 10 раз бидистиллиро- на слое геля, содержащего субстратную смесь;
ванной водой; 1 мл рабочего раствора содержит при этом места расположения полос изофермен-
8,8 мкг пировиноградной кислоты. тов прокрашиваются в синий цвет формазаном
в результате следующей реакции:
Х о д о п р е д е л е н и я . Опытная проба:
0,1 мл сыворотки, разведенной 1 : 2, смешивают
с 0,3 мл раствора NAD, прогревают 5 мин при
37 "С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л
раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл
NADH + НСТ—
0,45 моль/л раствора лактата натрия, предвари-
I
тельно прогретых при 37 °С, и инкубируют смесь
(нитросиний тетразолий)
при 37 °С в течение 15 мин. Тотчас после инкуба-
ции добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитро-
фенилгидразина, выдерживают 20 мин при Оптимум рН инкубационной среды лежит
комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл в области 8,0—8,3. Реакция ускоряется в при-
0,4 моль/л раствора едкого натра, перемеши- сутствии феназина метасульфата.
вают и через 10 мин измеряют на ФЭКе в Р е а к т и в ы . 1. Буфер для электрофореза:
кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны а) 1,84 г 5,5-диэтилбарбитуровой кислоты (веро-
500—560 нм (зеленый светофильтр) против нала) и 10,3 г натриевой соли 5,5-диэтилбарби-
холостой пробы. Холостую пробу ставят, как туровой кислоты (мединала) растворяют в 1 л
опытную, но сыворотку добавляют после инку- воды, рН 8,6; б) 3,025 г трис-(оксиметил)-
бации. аминометана растворяют в 700 мл воды в мерной

199
колбе, концентрированной HCI, доводят до комнатной температуре. Пленка должна быть в
расправленном виде. Денситометрируют при
рН 8,6 и доливают водой до метки. Растворы
«а» и «б» смешивают в р а в н ы х пропорциях. д л и н е волны 575—600 нм.
2. Буфер для приготовления агара: 24,2 г трис- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Соотноше-
( о к с и м е т и л ) - а м и н о м е т а н а растворяют в 700 мл ние ф р а к ц и й ЛДГ, по д а н н ы м различных авто-
воды, доводят рН до 8,3 прибавлением кон- ров, составляет: ЛДГ 1 — 19—29 %, ЛДГ 2 —
центрированной HCI и доливают водой до метки. 23-37 %; ЛДГз - 17-25 %; ЛДГ 4 - 8-
3. Буфер для растворения субстратной смеси, 17 %; ЛДГ 5 -8-18%.
В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-
рН 8,3: 2,42 г т р и с - ( о к с и м е т и л ) - а м и н о м е т а н а
ты в а р и а ц и и для р а з л и ч н ы х изоферментов от
и 1,41 г однозамещенного фосфата калия
10 до 15%.
(КН 2 Ро 4 ) растворяют в 100 мл воды, рН 8,3.
4. Агар Дифко. 5. Лития лактат ч.д.а., х.ч.
Л и т е р а т у р а . Михайлов Ю. Е., Шишло
6. Тетразолевый п-нитросиний (нитросиний
Л. А. Лаб. дело, 1983, № 10, с. 23—26; Маг-
тетразолий, НСТ) ч.д.а. 7. Метилфеназоний
kert С. L., Moller F. Proc. nat. Acad. Sci.,
метасульфат (феназина метасульфат ФМС) ч.
1959, v o l . 45, p. 753—763; Oplier A. «/., Collier
8. Никотинамидадениндинуклеотид окисленный
C. S., Miller J. M. C l i n . Chem., 1966, vol. 12,
( N A D ) . 9. Уксусная кислота, 5 % раствор.
N 5, p. 308—313.
С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . 1 . Ап-
парат для электрофореза на пленках из ацетата К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Актив-
целлюлозы. Может быть использован аппарат ность ЛДГ в сыворотке крови повышается п р и
ЭПАУ-20-50 отечественного производства. 2. Аце- повреждениях миокарда, лейкозах, почечных за-
татцеллюлозная пленка ТУ-6-05-1696-74 г. болеваниях, тромбоцитопениях, инфекционном
3. Денситометр. мононуклеозе, повреждениях п а р е н х и м ы печени,
опухолях, прогрессивной мышечной дистрофии.
Материал для исследования.
При инфаркте миокарда активность фермента
Сыворотка крови, свободная от гемолиза.
Ход о п р е д е л е н и я . Приготовление в сыворотке крови достигает м а к с и м у м а через
24—36 ч и приходит к норме медленнее (на
агара: 1 г агара Дифко растворяют при нагре-
в а н и и в 50 мл буфера № 2, затем охлаждают 8—10-й день), чем активность КК и АсАТ.
Однако из-за отсутствия органной специ-
до 65—70 "С. Субстратную смесь 264 мг лактата
фичности диагностическая значимость опреде-
лития, 4 мг НСТ, 20 мг NAD и 0,4 мг ФМС (4 мг
л е н и я общей активности ЛДГ ниже, чем ее
ФМС растворяют в 1 мл субстратного буфера
и берут 0,4 мл) растворяют п р и п о м е ш и в а н и и изоферментов. Изофермент ЛДГ, обладающий
в 10 мл субстратного буфера; беречь от света. наибольшей электрофоретической подвижно-
стью (ЛДГ|), локализуется преимущественно в
10 мл охлажденного до 65 °С раствора агара
ткани сердца. Увеличение активности этого
осторожно смешивают с приготовленной суб-
изофермента в сыворотке крови характерно
стратной смесью, избегая образования пузырь-
главным образом для поражения сердца. При
ков. Полученный гель наливают ровным слоем
и н ф а р к т е миокарда в большей степени увеличи-
толщиной около 2 мл на стекло или в к а к у ю -
либо подходящую емкость. Помещают гель в вается активность ЛДГ| по сравнению с общей
ЛДГ. В скелетных м ы ш ц а х , печени преобладает
темное место п р и комнатной температуре и
накрывают крышкой, следя за тем, чтобы капли медленно движущийся изофермент ЛДГ (ЛДГ 5 ),
При остром гепатите резко возрастает актив-
влаги не оседали на его поверхности.
ность ЛДГз и ЛДГ 4 и уменьшается активность
П р о в е д е н и е э л е к т р о ф о р е з а. За-
ЛДГ 1 и ЛДГ 2 . При циррозе печени сдвиг в
ливают в камеру прибора примерно 90 мл
изоферментном спектре ЛДГ также происходит
охлажденного до 4 °С буфера для электрофоре-
в сторону ЛДГ 5 . При холецистите активность
за. С заранее замоченной в этом буфере ацетат-
ЛДГз увеличивается незначительно. При остром
целлюлозной пленки удаляют избыток влаги
лейкозе в сыворотке крови увеличивается актив-
фильтровальной бумагой и закрепляют пленку
ность ЛДГ 2 и ЛДГз, причем степень увеличения
в предназначенной для этого рамке (см. инструк-
зависит от количества незрелых клеток. В опухо-
цию к а п п а р а т у ЭПАУ-20-50). Наносят на по-
левых тканях преобладают изоферменты ЛДГ 4
верхность пленки образцы сыворотки в коли-
и ЛДГ 5 , однако определенной корреляции
честве около 1,5 мкл с помощью а п п л и к а т о р а
между ростом опухоли и изменением спектра
(2 а п п л и к а ц и и ) . Помещают рамку с пленкой
ЛДГ в сыворотке крови определить не удалось.
в камеру, закрывают камеру крышкой и вклю-
чают ток. Электрофорез проводят в течение
25 мин при н а п р я ж е н и и 150 В (сила тока
3—5 м А ) . Выключают ток, с н и м а ю т пленку 5.2.8. Липаза
с р а м к и и помещают ( п р е д в а р и т е л ь н о обрезав
влажные концы пленки) на слой геля. К гелю
П а н к р е а т и ч е с к а я липаза (триацилглицерол-
должна прилегать поверхность пленки, на кото-
ацилгидролаза; К.Ф. 3.1.1.3) относится к группе
рую нанесены образцы. Следует избегать обра-
эстераз, гидролизует в ж и р а х внешние, эфирные
зования воздушных пузырьков. Помещают гель
связи с освобождением ж и р н ы х кислот.
с пленкой в термостат на 30 мин при темпера-
туре 37 °С. После о к р а ш и в а н и я пленку отмы-
вают в растворе 5 % уксусной кислоты примерно
в течение 3 мин и высушивают между л и с т а м и
фильтровальной бумаги в термостате или при

200
лении жирных кислот в виде медных солей,
Фермент секретируется поджелудочной железой
которые определяются по реакции с диэтилди-
и в большом количестве содержится в дуоде-
тиокарбаминатом.
нальном содержимом. В сыворотке крови актив-
Оптимизация условий определения и уни-
ность фермента низкая. Липаза представляет
фикация методов. Оптимум рН для липазы
собой гликопротеид, по данным некоторых
авторов, может существовать в виде двух 8,8—9,0. Липаза поджелудочной железы водо-
изоформ. Помимо панкреатической липазы, в р а с т в о р и м а , и ее липолитическое действие про-
сыворотке крови содержатся и другие липазы, является на поверхности жировых гранул.
например липопротеиновая липаза. Липаза Поэтому эмульсия масла должна быть тща-
является термолабильным ферментом и п р и тельно приготовлена. В качестве эмульгатора
37 °С частично инактивируется. чаще применяют дезоксихолат натрия; опти-
Методы определения активности липазы от- м а л ь н а я концентрация 3,5 г/л. Липазу акти-
личаются по используемому субстрату, буферу, визируют желчные кислоты, ионы кальция,
по технике исполнения и основаны главным колипаза. Кроме того, желчные кислоты, так
образом на определении количества освободив- иге как и дезоксихолат натрия, уменьшают по-
шихся под действием фермента ж и р н ы х кислот. верхностное натяжение, что приводит к образо-
ванию эмульсий и увеличению контакта между
В качестве субстратов наиболее часто приме-
ж и р а м и и липазой.
няются: оливковое масло, трибутирин, 2-нафтил-
меристат, твин-80, триолеин, а-нафтиллаурат, Свободные жирные кислоты, образующиеся
фениллаурат и др. За исключением триглице- в результате ферментативной реакции, инги-
ридов (оливковое масло, триолеин), другие бируют липазу. Связывание жирных кислот
субстраты подвергаются гидролизу под действи- ионами кальция с образованием нерастворимых
ем неспецифических эстераз, что снижает специ- соединений является причиной а к т и в а ц и и л и п а
фичность методов, использующих эти субстраты. зы в присутствии ионов кальция.
Оливковое масло способно образовывать тонко- Колипаза, представляющая собой белок,
дисперсную стабильную эмульсию. образует с желчными кислотами и л и п а з о й
Первый метод определения активности липа- комплекс, который обладает большим сродством
зы с применением оливкового масла в качестве к субстрату по сравнению со свободной л и п а -
субстрата был описан в 1932 г. Впоследствии зой. При применении в качестве субстрата
метод подвергался многочисленным модифика- эмульсии оливкового масла реакция нулевого
циям. По способу оценки результатов фермента- порядка протекает в течение короткого интерва-
тивной реакции методы могут быть титро- ла времени (от 4 до 12 м и н ) . В СССР реко-
метрические, фотометрические, турбидиметриче- мендован в качестве унифицированного тур-
ские, сталагмометрические, манометрические. бидиметрический метод с оливковым маслом
Большинство методов относится к титрометри- в качестве субстрата. В методах определения
ческим, основанным на титровании ж и р н ы х активности липазы сложным является стан-
кислот, освобождающихся в результате фер- дартизация единиц активности. Изменение
ментативного гидролиза. мутности пропорционально освобождению жир-
ных кислот, но оно варьирует при измерении
Методы этой г р у п п ы недостаточно точны,
на разных фотометрах. Поэтому абсорбционные
так как очень трудно установить конечную
единицы нежелательно употреблять для измере-
точку титрования в масляной эмульсии. При
ния липазной активности. При разрушении
титровании эмульсия оливкового масла должна
1 мкмоля оливкового масла освобождается
быть гомогенной, в противном случае получен-
2 мкмоля жирных кислот. Поэтому возможны
ные результаты будут неправильными.
два способа выражения активности: в микро-
Колориметрические методы более точные, но
молях разрушенного под действием липазы сы-
связаны с введением в реакцию ряда дополни-
воротки крови оливкового масла или триолеина
тельных реактивов. Турбидиметрические методы
или в микромолях освобожденных жирных
основаны на измерении величины уменьшения
кислот. Однако калибровать турбидиметриче-
оптической плотности стабильной эмульсии
ские методы сложно, так как рассеяние света
оливкового масла под действием липазы. Ста-
меняется с концентрацией нелинейно.
лагмометрические методы используют поверхно-
Унифицированный метод с использованием
стные свойства ж и р н ы х кислот, что позволяет
оливкового масла в качестве субстрата. П р и н -
только условно судить об активности фермента.
ц и п . Спектрофотометрическое измерение изме-
Манометрические методы очень сложны и трудо-
нения мутности суспензии оливкового масла
емки. Принцип их основан на измерении объема
под действием липазы. Активность фермента
угольной кислоты, которая вытесняется из би-
пропорциональна количеству гидролизованного
карбонатного буфера жирными кислотами.
оливкового масла или количеству жирных кис-
Оливковое масло или триолеин как субстраты
лот, образующихся при гидролизе.
используются в методах, предлагаемых в ка-
честве стандартных в США, а также в боль- Р е а к т и в ы . 1. Оливковое масло, мол. мас-
шинстве наборов реактивов для определения са 880 (сред.). 2. А л ю м и н и я окись хромато-
активности липазы, в частности, в наборах графически чистая (для очистки оливкового
реактивов фирмы «Harleco» (США), «Boehrin- масла). Очистка оливкового масла: в колбу
ger Mannheim» (ФРГ), амилазно-липазном а н а - вместимостью 50 мл помещают 25 мл оливко-
лизаторе модели « P e r k i n - E l m e r 91» (США) с вого масла и добавляют 5 г окиси а л ю м и н и я ,
прилагаемым набором реактивов. Описаны ставят на 1 ч на аппарат для встряхивания
фотометрические методы, основанные на выде- жидкости в сосудах. Затем оливковое масло
201
переливают в центрифужные пробирки и центри- Расчет активности. Для расчета
фугируют 30 мин при 5000 об/мин. Оливковое активности липазы можно использовать кон-
масло сливают с осадка и пропускают через трольную сыворотку с известной активностью
плотный бумажный фильтр (с синей полосой) на липазы. Активность липазы в контрольной сы-
воронке Бюхнера. 3. Меди сульфат 5-водный воротке определяют так же, как в исследуемой.
(CuSO 4 • 5Н 2 O) для получения абсолютного Расчет производят по формуле:
спирта. 4. Этиловый спирт абсолютный. Для
абсолютирования этилового спирта применяют
безводный сульфат меди (сульфат меди) белого
цвета. Безводный сульфат меди получают про-
сушиванием CuSO 4 • 5НгО при температуре
120°С в сушильном шкафу при периодическом где Еоп — изменение величины экстинкции
перемешивании. Безводный сульфат меди (охла- опытной пробы за 1 мин; ДЕоп = Е 1 а и — Е2оп
жденный) заливают 96 % этиловым спиртом. за 1 мин; ДЕк — изменение величины экстинк-
Тщательно перемешивают и оставляют стоять ции в контрольной сыворотке за минуту, ДЕк =
3—4 дня, ежедневно перемешивая. Кристаллы = Е1к — Е2к за 1 мин; Ск — активность липазы
сульфата меди приобретают синий цвет. Затем в контрольной сыворотке, ME. Расчет в мкмолях
спирт сливают и засыпают в него новую порцию разрушенного оливкового масла ведут по фор-
сульфата меди. Операцию продолжают до тех муле:
пор, пока цвет кристаллов не будет меняться.
Спирт сливают и фильтруют. 5. Основной раст-
вор оливкового масла, 0,011 моль/л. В колбу
с притертой пробкой наливают 100 мл абсолют-
ного спирта, пипетку с 1,1 мл очищенного олив-
кового масла помещают в колбу так, чтобы
конец ее находился близко к поверхности спирта,
но не касался ее. Держа пипетку в таком поло- где ДЕоп — изменение экстинкции опытной про-
жении, непрерывно вращают колбу круговыми бы за 1 мин; 170 — концентрация оливкового
движениями до тех пор, пока оливковое масло масла в рабочей эмульсии (мкмоль/л), при
не вытечет из пипетки. Затем колбу ставят на которой экстинкция равна приблизительно 1;
1 ч на аппарат для встряхивания жидкости. Ек — экстинкция рабочей эмульсии оливкового
Хранят при комнатной температуре. 6. Рабочая
эмульсия оливкового масла, 0,00017 моль/л, или
170 мкмоль/л: 1,5 мл основного раствора олив-
кового масла медленно добавляют к 100 мл
буфера рН 8,8. При этом кончик пипетки держат
под поверхностью эмульсии. Реактив стабилен коэффициент пересчета на 1 л сыворотки.
при хранении в холодильнике в течение 2 нед. Линейная зависимость сохраняется до 204
7. Трис-(оксиметил)-аминометан. 8. Дезоксихо- мкмоль/л оливкового масла. 16,67—коэффи-
левой кислоты натриевая соль. 9. НС1 концен- циент пересчета в нмоль/(с • л ) .
трированная. 10. Буфер, содержащий трис, Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 0—470
0,025 моль/л и натриевую соль дезоксихолевой нмоль/(с • л), или 0—28 мкмоль/(мин • л).
кислоты, 0,014 моль/л, рН 8,8: 0,3 г триса и
П р и м е ч а н и е . Нормальные величины
0,6 г дезоксихолата натрия растворяют в 40—
следует проверять в каждой лаборатории.
60 мл воды, доводят рН до 8,8 концентрирован-
Воспроизводимость. Коэффициен-
ной НС1 (3—8 капель) и доливают водой в
ты вариации составляют 10—15 %.
мерной колбе до 100' мл. Реактив стабилен при
хранении в холодильнике в течение 2 нед. Л и т е р а т у р а . Делекторская Л. П., Бори-
Специальное оборудование. сенкоЛ. М., Стародворцева В. Г. В кн.: Унифи-
Спектрофотометр с термостатированной кюветой. кация лабораторных методов исследова-
Материал для исследования. ния/Под ред. В. В. Меньшикова.— М., 1980,
Сыворотка, свободная от гемолиза, или плазма с. 41—49; Огнев Ю. В., Шабанова Т. К. Лаб. де-
крови. Активность липазы сохраняется в тече- ло, 1978, № 7, с. 424—427; Shihabi L. К.,
ние 7 дней при хранении сыворотки в холо- Bishop С. Clin. chem., 1971, vol. 17, p. 1150.
дильнике. К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . В сыворот-
Х о д о п р е д е л е н и я . Перед определени- ке здоровых людей активность липазы очень
ем сыворотку и реактивы прогревают до темпе- низкая, при остром панкреатите активность фер-
ратуры измерения. В кювету приливают 3 мл мента может увеличиться до 200 раз по сравне-
рабочей эмульсии оливкового масла, добавляют нию с нормой. Активность липазы в крови быст-
0,1 мл сыворотки, смешивают (без встряхива- ро увеличивается в течение нескольких часов
ния) и ставят в термостат при 30 или 37 °С, после приступа панкреатита, достигая максиму-
через 2 мин измеряют экстинкцию ( E i ) против ма через 12—24 ч, и остается повышенной в те-
воды или воздуха при длине волны 340 нм чение 10—12 дней, т. е. более продолжительное
в кювете с толщиной слоя 1 см, затем кювету время, чем а-амилаза. В моче активность липа-
снова помещают в термостат при той же темпе- зы не обнаруживается. В дуоденальном содер-
ратуре и через 5 мин измеряют экстинкцию жимом липазу рекомендуется определять после
(Е 2 ), рассчитывают ЛЕ за 1 мин. стимуляции секретином и панкреозимином.
202
5.2.9. Сорбитолдегидрогеназа Конечная
В термостатиро- Опытная
ванную кювету концентрация
проба, мл
приливают
Сорбитолдегидрогеназа (L-идитол: NAD + в пробе
5-оксидоредуктаза; К. Ф. 1.1.1.14) фермент, ка-
Триэтаноламино-
тализирующий следующую обратимую реакцию: Около 107
вый буфер ммоль/л
1,6
0,4 ммоль/л
NAD- Na2, раствор 0,1
СДГ
Сыворотка крови 1,0

В человеческом организме фермент содер-
жится в основном в клетках печени.
Методы определения основаны на прямом оп-
тическом тесте или на образовании окрашенного
соединения фруктозы с резорцином — метод Се-
вела — Товарека. В методах определения актив-
ности СДГ, основанных на оптическом тесте,
используют обратную реакцию. Методы, исполь-
зующие эту реакцию, более чувствительные.
Оптимизация условий определения и унифи-
где Vр.с. — объем реакционной смеси; Vсыв —
кации методов. Для определения активности
объем сыворотки; t — время реакции, с; ^Е —
СДГ, основанного на UV-тесте, применяют сле-
изменение экстинкции за 1 с; е — коэффициент
дующие буферные растворы: фосфатный, триэ-
молярной экстинкции NADH в м 2 - м о л ь - 1 ; / 2—
таноламиновый, трис-буфер. В трис-буфере ре-
толщина слоя жидкости в кювете, м ( 1 - 1 0 ˜ ) .
а к ц и я протекает быстрее, чем в триэтанолами-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Активность
новом, однако в трис-буфере для насыщения
в сыворотке крови здоровых людей низкая —
фермента требуется более высокая концентра-
до 25 нмоль/(с-л), или до 1,5 ME.
ция фруктозы. Оптимум рН для СДГ 7.4 — 7,6.
В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициент
В качестве унифицированного в 1974 г. утвер-
вариации около 5 %. Если при 365 нм Л?> 0,03,
жден колориметрический метод Севела — Това-
то сыворотку следует развести или уменьшить
река.
интервалы измерения.
Метод по оптическому тесту. П р и н ц и п
Различие спектров поглощения окисленной и Л и т е р а т у р а . Bergmeyer H. U. (Hrsg.)
восстановленной форм NAD при 340 им. Methoden der enzymatischen Analyse. Wein-
Р е а к т и в ы . 1 . Триэтаноламина гидрохло- heim: Verlag Chemie, 1974, S. 601—606.
рид. 2. Натр едкий, 2 моль/л. 3, Триэтанолами-
Унифицированный метод по реакции с резор-
новый буфер, 0,2 моль/л, рН 7,4: 37,2 г гидро-
цином (метод/Севела — Товарека). П р и н -
хлорида триэтаноламина растворяют в воде, до-
ц и п . Сорбитол под действием фермента сыво-
водят рН до 7,4 2 моль/л раствором NaOH и до-
ротки в присутствии NAD превращается во
ливают водой до 1 л. Стабилен при комнатной
фруктозу, при реакции фруктозы с резорцином
температуре. 4. Натрия карбонат кислый
образуется розово-красное окрашивание, интен-
(NaHCO 3 ), 10 г/л. 5. Никотинамидаденинди-
сивность которого пропорциональна количеству
нуклеотид восстановленный, динатриепая соль,
образовавшейся фруктозы.
12 моль/л: 15 мг N A D - Na 2 растворяют в 1,5 мл
Р е а к т и в ы . 1. Трис- (оксиметил) -аминоме-
10 г/л раствора NaHCO 3 . Стабилен при 4 °С
тан. 2. НС1, 0,2 моль/л. 3. Трис-буфер, 0,05 моль/л,
1 нед. 6. D-Фруктоза, 4 моль/л: 72,0 г D-фрук-
рН 8,8: 70,5 мг триса растворяют в 2,5 мл воды,
тозы растворяют в воде и доводят водой до
прибавляют 0,4 мл 0,2 моль/л раствора HCI.
100 мл. Раствор стабилен при 4 °С 4 нед.
Доводят рН, доливают водой до 10 мл. Раствор
Специальное оборудование.
стабилен при хранении при комнатной темпера-
Спектрофотометр с термостатированной кюве-
туре. 4. D-сорбитол, 0,5 моль/л раствор в
той.
0,05 моль/л трис-буфере: 0,225 г D-сорбитола
Материал для исследования.
растворяют в 2,5 мл 0,05 моль/л раствора трис-
Свежая сыворотка или плазма крови.
буфера. Раствор стабилен в течение 4 нед при
Х о д о п р е д е л е н и я . Предварительно
хранении в холодильнике. 5. NAD, 0,006 моль/л:
все растворы реактивов и сыворотку прогревают
25 мг NAD растворяют в 4,5 мл трис-буфера.
до температуры измерения. Определение прово-
Раствор стабилен в течение 4 нед при хранении
дят по следующей схеме:
в холодильнике. 6. Трихлоруксусная кислота,
Смешивают и измеряют экстинкцию при
раствор 100 г/л. 7. Резорцин, 1 г/л раствор
340 или 365 нм в кювете с толщиной слоя 1 см
в 96 % этаноле. 8. HCI, 30 % раствор. 9. НС1,
против воды в течение 5—8 мин через каждую
0,2 моль/л раствор. 10. Натрия хлорид, 154
минуту.
ммоль/л. 11. D-фруктоза, калибровочный рас-
Р а с ч е т производят по формуле:
твор: 27 мг D-фруктозы растворяют в небольшом
количестве 154 ммоль/л раствора хлорида нат-
рия, переносят в мерную колбу вместимостью
100 мл и доводят объем до метки 154 ммоль/л
раствором хлорида натрия.
203
перемешивают и помещают в водяную баню при
Х о д о п р е д е л е н и я . Опытная проба:
80 °С точно на 8 мин, охлаждают. Возникающее
в ц е н т р и ф у ж н у ю пробирку вносят 0,1 мл
розово-красное окрашивание измеряют на ФЭКе
0,5 моль/л раствора D-сорбитола и 0,3 мл сыво-
при длине волны 500—560 нм (зеленый свето-
ротки, прогревают 5 мин п р и 37 °С, затем добав-
фильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против
ляют 0,2 мл 0,006 моль/л раствора NAD, предва-
холостой пробы. Холостую пробу ставят так же,
рительно прогретого при 37 °С, и инкубируют
как опытную, но раствор трихлоруксусной кисло-
30 мин при 37 °С. Инкубацию прерывают добав-
ты добавляют до инкубации.
лением 0,4 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной
Р а с ч е т активности п о калибровочному
кислоты. Центрифугируют. В чистую пробирку
графику.
вносят 0,5 мл надосадочной жидкости, 0,5 мл
раствора резорцина, 1,5 мл 30 % раствора НС1,



Раствор Актив-
№ 154
30%
Калибровочный Раствор
Раствор Трис- трихлор-
ммоль/л ность
про-
раствор сорби- буфер, резор- раствор сдг,
уксусной
раствор
бир-
HCI, мл
D-фруктозы, мл тола, мл цина, мл
мл нмоль/
кислоты, мл
NaCI, мл
ки
(с-л)

1 0,2 калибровочно- 55,6
0,2 0,4 1,0 3,0
0,1 0,1
го раствора, раз-
веденного в 10 раз
0,05 0,25 0,4
2 0,2 139
1,0 3,0
0,1
3,0
0,2 0,2 0,4
3 278
1,0
0,1 0,1
4 3,0 556
0,2 0,2 0,2 0,4 1,0
0,1
5 3,0 834
0,3 0,2 0,4 1,0
0,1




Построение калибровочного же условиях, что и опытные пробы, против хо-
графика. И з калибровочного раствора лостой пробы. В холостую пробу вместо калибро-
D-фруктозы готовят ряд разведений с добавле- вочного раствора добавляют 154 ммоль/л рас-
нием реактивов, как указано ниже. Далее калиб- твор хлорида натрия. Пересчет активности СДГ
на микромоли фруктозы на 1 л сыворотки за 1 с
ровочные пробы помещают в водяную баню п р и
80 °С на 8 м и н , охлаждают и измеряют при тех и н к у б а ц и и при 37 °С производят по формуле:

С-1000-3300-2
активность СДГ, н м о л ь / ( с - л ) =
180-3600

ность фермента в сыворотке крови наблюдается
где С- 1000 количество D-фруктозы в калиб-
в первые дни острого гепатита и при обострении
ровочной пробе, нг; 3300— коэффициент пере-
хронического гепатита.
2
— коэффициент
счета на 1 л сыворотки;

5.2.10. Уроканиназа
пересчета на 1 с инкубации; 180— масса 1 мик-
ромоля D-фруктозы, мкг.
У человека уроканиназа содержится главным
Л и н е й н а я зависимость сохраняется от 0 до
образом в печени. Для определения ее актив-
830 н м о л ь / ( с - л ) .
Н о р м а л ьн ы с величины: до ности в сыворотке крови пользуются спектрофо-
тометрическим методом, основанным на спектро-
5,6 н м о л ь / ( с - л ) , или до 0,02 м к м о л ь / ( ч • м л ) .
фотометрическом определении концентрации
В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-
уроканиновой кислоты. В описанном методе ус-
ты в а р и а ц и и до 10 %.
ловия определения оптимизированы, метод уни-
фицирован.
Tovarek J.
Л и т е р а т у р а . Sevela M.,
Унифицированный спектрофотометрический
V n i t r n i i e k , 1961, vol. 7, p. 1392.
метод. П р и н ц и п . Субстрат уроканиназы —
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . СДГ со- уроканиновая кислота — в щелочной среде име-
ет м а к с и м у м поглощения при 277—280 нм. Ак-
держится главным образом в печени, поэтому
тивность фермента определяют по убыли суб-
повышение активности в сыворотке крови специ-
страта в процессе ферментативной реакции.
фично для ее поражения. Однако из-за низкой
активности СДГ в сыворотке крови и недоста- Р е а к т и в ы . 1. Калия фосфат однозаме-
точной чувствительности метода определения щенный безводный х. ч., 0,01 моль/л: 1,36 г
СДГ нормальное значение активности фермента KHzPO 4 растворяют в мерной колбе вместимо-
в сыворотке крови еще не говорит об отсутствии стью 1 л и доводят до метки водой. 2. Калия
поражения печени. Наиболее высокая актив- фосфат двузамещенный, безводный х.ч.,
204
0,01 моль/л: 1,74 г К 2 НРО 4 растворяют в мерной
колбе вместимостью 1 л и доводят до
метки водой. 3. Фосфатный буфер, 0,01 моль/л,
рН 7,2: к 0,01 моль/л раствору К 2 НРО 4
приливают п о р ц и я м и 0,01 моль/л раствор
КН 2 РО 4 до получения рН 7,2. 4. Натр ед-
кий, 0,05 моль/л. 5. Уроканиновая кислота
2-водная, имп. 6. Основной калибровочный рас-
твор уроканиновой кислоты; 0,001 моль/л:
0,0087 г уроканиновой кислоты растворяют в
мерной колбе вместимостью 50 мл в 0,01 моль/л
фосфатном буфере. 7. Рабочий калибровочный
раствор уроканиновой кислоты. Готовят разве-
дением основного раствора в 20 раз раствором
0,05 моль/л NaOH; 1 мл рабочего калибровоч-
ного раствора содержит 0,05 мкмоля уроканино-
вой кислоты. В буфер и в раствор уроканиновой
кислоты в целях консервации добавляют 3—
4 капли хлороформа, после чего буферный рас-
твор можно хранить при комнатной температуре.
Раствор уроканата при хранении в холодиль-
нике без замораживания стабилен в течение где С — количество разложившейся уроканино-
нескольких месяцев. вой кислоты, нмоль (по калибровочному графи-
к у ) ; 5 - 1 0 5 —коэффициент пересчета на 1 л
Специальное оборудование.
Спектрофотометр с длиной волны 280 нм. сыворотки крови; 14 400— коэффициент пере-
Материал для исследования. счета на 1 с инкубации.
Сыворотка крови. Фермент стабилен в течение Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . У практи-
2—3 дней при 4 °С. чески здоровых людей активность уроканиназы
Х о д о п р е д е л е н и я . Опытная проба: в крови отсутствует.
0,35 мл фосфатного буфера смешивают с 0,1 мл В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-
основного калибровочного раствора уроканино- ты вариации в среднем составляют 7—8 %.
вой кислоты, затем добавляют 0,05 мл сыво- С п е ц и ф и ч н о с т ь м е т о д а . Уроканат
ротки крови и инкубируют смесь 4 ч при 37 °С. является единственным субстратом для урока-
После инкубации в пробу сразу добавляют ниназы, обладающей абсолютной субстратной
2,5 мл 0,05 моль/л раствора NaOH для останов- специфичностью.
ки реакции. Холостую пробу № 1 ставят так же,
Л и т е р а т у р а . Буробин В. А., Лихаче-
как опытную, но вместо 0,1 мл основного рас-
ва Н. В. В кн.: Унификация лабораторных мето-
твора уроканиновой кислоты добавляют 0,1 мл
дов исследования/Под ред. В. В. Меньшико-
фосфатного буфера. Холостую пробу № 2 ставят
ва.— М., 1980, с. 35—40; Буробин В. А., Лиха-
так же, как опытную, но 0,1 мл основного рас-
чева Н. В., Абгафорова Г. Е. Лаб. дело, 1978,
твора уроканиновой кислоты добавляют после
№ 11, с. 650—653; Tabor H., Mehler A. H.
инкубации и сразу останавливают реакцию
Acad. Press. Soc., 1955, v o l . 11, p. 228—233.
0,05 моль/л раствором NaOH. После остановки
реакции измеряют оптическую плотность опыт- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Урокани-
ной пробы и холостой № 2 против холостой наза является органоспецифическим ферментом
пробы № 1 на спектрофотометре при длине печени. В 1963 г. С. Р. Мардашевым и В. А. Бу-
волны 280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. робиным впервые было обнаружено, что при
Р а с ч е т активности производят по калиб- токсическом гепатите уроканиназа определяется
ровочному графику. При этом из величины в крови. В дальнейшем многие исследователи
экстинкции холостой пробы № 2 вычитают вели- показали, что активность фермента обнаружи-
чину молярной экстинкции опытной пробы. вается в крови при циррозе печени, хронических
гепатитах. Активность фермента в крови при
Построение калибровочного
токсическом или вирусном гепатите достигает
г р а ф и к а . Из рабочего калибровочного раст-
величин 5—13 н м о л ь / ( с - л ) , или 0,3—0,8
вора уроканиновой кислоты готовят ряд разве-
дений, как указано ниже. мкмоль/(мин - л ) .
Оптическую плотность проб измеряют против
холостой пробы тем же способом, что и при
5.2.11. Щелочная фосфатаза,
определении активности фермента в сыворотке.
изоферменты щелочной фосфатазы
П е р е с ч е т активности уроканиназы н а
микромоли разложившейся уроканиновой кис-
лоты на 1 л сыворотки за 1 мин производят Фосфатазы — ферменты, гидролизующие
по формуле: эфиры фосфорной кислоты. В зависимости от
значения рН, при котором действует фермент,
активность уроканиназы, н м о л ь / ( с - л ) =
различают щелочную и кислую фосфатазу.
Щелочная фосфатаза —-,ЩФ (фосфогидро-
лаза моноэфиров ортофосфорной кислоты; К. Ф.
3.1.3.1) содержится практически во всех живот -
205
ных тканях; наиболее богаты ферментом печень, имело применение так называемых трансформи-
костная ткань, кишечник, плацента. Щелочная рующих буферов.
фосфатаза — негомогенный фермент; разли- Наиболее приемлемыми являются два тран-
чают 5 тканево-специфических изоферментов сформирующих буфера: 2-амино-2-метил-1-про-
щелочной фосфатазы: плацентарный, костный, паноловый и диэтаноламиновый. В пропаноло-
печеночный, кишечный, почечный. Множествен- вом буфере различия по отношению к изофер-
ные формы щелочной фосфатазы обусловлены ментам менее выражены и степень чистоты его
как генетическими факторами, так и посттран- более приемлемая, чем для диэтанол-аминового
сляционной модификацией. Для плацентарной буфера. В пропаноловом буфере п-нитрофенил-
формы существуют отдельный генетический ло- фосфат более стабилен. Диэтаноламиновый
кус и аллельные варианты, которые не обнару- буфер требует высокой степени очистки, так как
живаются для других изоформ. Фракции щелоч- содержит ингибиторы ЩФ. В наборах реакти-
ной фосфатазы различаются по своим каталити- вов «Лахема» (ЧССР) предложен новый буфер
ческим свойствам, электрофоретической под- D-N-метилглюкамин. К трансформирующим бу-
вижности, устойчивости к тепловой инактива- ферам относится М-(2-оксиэтил)-этилендиамин-
ции. Исследованием термоустойчивости (56 °С тетрауксусная кислота (НЭДТА). Этот буфер
10 мин или 65 °С 5 мин) изоферментов ЩФ из содержит ионы цинка и магния, которые необхо-
различных тканей установлено, что при указан- димы для работы фермента. Данный буфер
ных условиях плацентарная ЩФ устойчива к на- и субстрат п-нитрофенилфосфат используются
греванию, костная фракция очень чувствитель- в оптимизированном референтном методе опре-
на к теплу (85—90% инактивации); менее деления активности ЩФ, разработанном Меж-
чувствительна к теплу кишечная фракция (50— дународной Федерацией клинической химии. За
65 % инактивации) и печеночная (50—75 % последние годы за счет оптимизации условий
инактивации). измерения достигнуты значительные улучшения
Однако только по методу тепловой инакти- аналитических качеств методов определения ак-
вации судить об органной принадлежности ЩФ тивности ЩФ. В СССР в качестве унифициро-
невозможно. В норме при электрофорезе выяв- ванных в 1972 г. утверждены два метода с суб-
ляется 1—2 фракции ЩФ в зоне а2-глобулинов. стратом — (3-глицерофосфатом и п-нитрофенил-
При патологии количество изоферментов и их фосфатом.
расположение при электрофорезе могут менять- Унифицированный метод по гидролизу п-нит-
ся. ЩФ образует комплексы с белками и липи- рофенилфосфата. П р и н ц и п . Субстрат п-нит-
дами. рофенилфосфат натрия гидролизуется с образо-
Методы определения фосфатаз различаются ванием п-нитрофенола, дающего в щелочной
по используемому субстрату: р-глицерофосфат среде желтое окрашивание.
натрия — метод Боданского; фенилфосфат нат- Р е а к т и в ы . 1 . п-Нитрофениловый эфир
рия — метод Кинга — Армстронга; п-нитрофе- фосфорной кислоты динатриевая соль ч. д. а.
нилфосфат натрия — метод Бессея — Лоури — 2. НС1, 0,001 моль/л. 3. п-Нитрофенилфосфат
Брока; кроме того, применяются субстраты — натрия, 4 г/л раствор в 0,001 моль/л раствора
нафтилсульфат, фенолфталеиндифосфат, фе- НС1: 0,4 г п-нитрофенилфосфата помещают в
нолфталеин монофосфат, тимол фталеинмоно- мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают
фосфат. Ниболее специфичным и простым явля- до метки 0,001 моль/л раствором НС1. В связи
ется метод Бессея — Лоури — Брока, основан- с тем, что в продаже чаще имеется бариевая
ный на ферментативном гидролизе п-нитро- соль п-нитрофенилфосфата, то перевод ее в нат-
фенилфосфата, однако для получения правиль- риевую соль осуществляется следующим спосо-
ных результатов важным в данном методе явля- бом: к навеске п-нитрофенилфосфата бария,
ется оптимизация условий определения. Во всех соответствующей получению 9 г/л раствора и по-
методах субстратами служат однозамещенные мещенной в фарфоровую ступку, добавляют не-
ортофосфата, дву- и трехзамещенные производ- большими количествами 0,001 моль/л раствор
ные гидролизу щелочной фосфатазой не подвер- НС1 в процессе растирания соли в ступке в тече-
гаются. Определение ЩФ с субстратом п-нитро- ние 10 мин. Добавлением насыщенного раствора
фенилфосфатом проводится на биохимических сульфата натрия (1 мл на 100 мл раствора)
автоанализаторах различного принципа дей- бариевую соль переводят в натриевую. Через
ствия. 5 мин полученный раствор п-нитрофенилфос-
Оптимизация условий определения и унифи- фата натрия фильтруют в делительную воронку,
кации методов. Во всех странах, где занимаются где затем взбалтывают с равным объемом водо-
стандартизацией методов, стандартизован метод насыщенного бутилового спирта. После разделе-
с субстратом п-нитрофенилфосфатом, однако ния слоев жидкости в делительной воронке
условия измерения предложены различные. (вверху — бутанол, внизу — постепенно обес-
п-Нитрофенилфосфат легко гидролизуется, дает цвечивающийся субстратный раствор) бутанол
минимальные различия для изоферментов ЩФ выливают, а субстратной раствор подвергают
в оптимизированной концентрации и с образова- описанной выше процедуре очистки еще 2—3 ра-
нием хромогена при гидролизе субстрата, что за, пока он не станет совершенно бесцветным.
дает возможность осуществлять кинетическое После бутанола производят экстракцию водона-
измерение. Высокое значение молярного погло- сыщенным эфиром 1—2 раза. Реактив не дол-
щения п-нитрофенилфосфата делает этот метод жен содержать свободного п-нитрофенола, от-
достаточно чувствительным. Для оптимизации сутствие которого в субстратном растворе про-
методов определения ЩФ большое значение веряется следующей пробой: к 1 мл субстратного
206
раствора прибавляют 10 мл-0,02 моль/л рас-
твора едкого натра и измеряют на ФЭКе при
длине волны 400—420 нм (фиолетовый свею
фильтр). Экстинкция должна быть меньше 0,08;
если э к с т и н к ц и я больше 0,08, необходимо уда-
лить свободный п-нитрофенол. Для этого реак-
тив экстрагируют 2 или 3 раза р а в н ы м и объема-
ми бутилового спирта и один раз — эфиром.
Затем удаляют следы эфира выдерживанием
на воздухе. Бутиловый спирт и эфир должны
иметь нейтральную реакцию. Если реактив не
выдерживает у к а з а н н ы й выше тест, то экстра-
гирование повторяют. Хранят раствор в холо-
дильнике в замороженном состоянии R течение
2—3 нед. 4. Аминоуксусная кислота (гликокол,
глицин) ч. д. а. или х. ч. 5. Магния хлорида
6-водный ч. д. а. или х. ч. 6. Натр едкий ч. д. а.
или х. ч.; растворы 0,1 моль/л, 0,02 моль/л, не
содержащие углекислого газа. 7. Буферный рас-
твор — 0,05 моль/л глициновый буфер с добав- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 278—830
лением катализатора хлорида м а г н и я — 95 мг/л: н м о л ь / ( с - л ) , или 1—3 мкмоль п-нитрофенола,
375 мг г л и ц и н а и 10 мг MgCI 2 • 6Н2О растворяют освобожденного 1 мл сыворотки за 1 ч инкуба-
в 42 мл 0,1 моль/л раствора едкого натра и дово- ции — единицы Бессея — Лоури — Брока. Нор-
дят объем водой до 100 мл. 8. Субстратно-буфер- м а л ь н ы е величины ЩФ в значительной степени
ный раствор готовят с м е ш и в а н и е м р а в н ы х ча- зависят от возраста.
стей растворов 3 и 7, рН раствора 10,5. П р и В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-
с м е ш и в а н и и 2 мл раствора с 10 мл 0,02 м о л ь / л ты в а р и а ц и и равны в среднем 5—9 %.
раствора едкого натра реактив не должен давать
Л и т е р а т у р а . Bessey О. A., Lowry О. Н.,
экстинкцию на ФЭКе более 0,1 ( т о л щ и н а слоя
Brоck M.˜ J. Biol. Chem., 1940, vol. 164, p. 321.
1 см, длина волны 400—420 н м ) . В противном
случае раствор негоден или подлежит реэкстра- Оптимизированный метод по гидролизу п-ни-
гированию бутанолом или эфиром. После эк- трофенилфосфата. П р и н ц и п . Измерение пог-
стракции необходимо снова установить рН. Х р а - лощения при 405 нм при образовании п-нитрофе-
нят в холодильнике в течение 2—3 дней. 9. н - Н и - нола из п-нитрофенилфосфата. Реакция проте-
трофенол — калибровочный раствор 5 - 1 0 ˜ 5 кает по следующему уравнению:
моль/л: 696 мг п-нитрофенола х. ч. растворяют
в 0,02 моль/л растворе едкого натра и доводят
этим же раствором объем до 1 л; 1 мл раствора
рН 10,4
содержит 5 мкмолей п-нитрофенола.
= п-нитрофенол + фосфат
Материал для исследования.
Свежая, свободная от гемолиза сыворотка или
плазма крови. Цитрат, оксалат, ЭДТА, гепарин Р е а к т и в ы . 1 . 2-Амино-2-метил-1-пропа-
вызывают интерференцию. При х р а н е н и и а к т и в - нол ( 2 А 2 М 1 П ) . 2. HCI, 1 моль/л. 3. 2-Амино-
ность фермента возрастает. 2-метил-1-пропаноловый буфер, 0,393 моль/л,
Х о д о п р е д е л е н и я . Опытная проба: в рН 10,4: 2А2М1П нагревают при температуре
пробирки вносят по 1 мл субстратно-буферного 30—35 °С до получения жидкости. 17,52 г
раствора, прогревают п р и 37 °С в течение 5 мин, 2А2М1П растворяют в 400 мл воды, доводят
затем добавляют по 0,1 мл сыворотки. Содержи- рН до 10,4 раствором HCI 1 моль/л и доводят
мое пробирок перемешивают и инкубируют в те- объем водой в мерной колбе до 500 мл. Раствор
чение 30 мин при 37 "С. После и н к у б а ц и и про- необходимо предохранять от СО2 воздуха; ста-
бирки переносят в водяную баню со льдом, а за- билен при комнатной температуре в течение
тем добавляют по 10 мл 0,02 моль/л раствора месяца. 4. Магния хлорид 6-водный (MgClj X
едкого натра и тщательно перемешивают. Через Х6Н 2 О), 6,38 ммоль/л: растворяют 0,131 г хло-
5 мин пробы измеряют на ФЭКе при длине рида м а г н и я в 60—70 мл воды в мерной колбе
волны 400—420 нм (фиолетовый светофильтр) вместимостью 100 мл и доводят водой до метки.
в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой Раствор стабилен. 5. п-Нитрофениловый эфир
пробы. Холостую пробу ставят так же, как фосфорной кислоты динатриевая соль, имп.
опытную, но сыворотку добавляют после (п-НФФ), 204 ммоль/л: растворяют 0,757 г
инкубации. п-НФФ в 10 мл 6,38 ммоль/л раствора хлорида
Р а с ч е т производят п о к а л и б р о в о ч н о м у магния. При х р а н е н и и в посуде из темного стек-
графику. ла раствор стабилен в течение 5—6 ч, поэтому
Построение калибровочного раствор готовят в необходимом количестве перед
г р а ф и к а . И з рабочего калибровочного рас- употреблением.
твора готовят ряд разведений, как указано н и - Специальное оборудование.
же, и измеряют оптическую плотность растворов Спектрофотометр с термостатированной кюве-
при условиях, аналогичных опытным, против той или биохимический анализатор, позволя-
0,02 моль/л раствора едкого натра. ющий проводить кинетическое измерение.
207
Х о д о п р е д е л е н и я . Перед определе- Электрофоретическое разделение изофермен-
нием температура растворов и исследуемой сы- тов на пленках из ацетата целлюлозы. П р и н -
воротки должна быть доведена до температуры ц и п . Фракции ЩФ разделяются путем электро-
измерения. Определение проводят по следующей фореза на пленках из ацетата целлюлозы при
схеме. рН 8,6. Затем пленки инкубируются на геле,
содержащем субстратную смесь.
Р е а к т и в ы . 1. Буфер барбиталовый для
В термостатиро- Конечная
Опытная электрофореза, 0,075 моль/л, рН 9,2: 5,5-диэтил-
концентрация
ванную кювету
проба веществ
приливают барбитуровая кислота (веронал) — 2,01 г, 5,5-
(мкл) в пробе
(30 °С) диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль
(мединал) — 15,4 г. Навески реактивов поме-
щают в мерную колбу вместимостью 1 л, рас-
2А2М1П-буфер 920,0 2А2М1П-
творяют и доводят до метки водой. 2. Буфер
0,345 моль/л
боратный для приготовления субстрата, рН 10,5:
20,0
Сыворотка крови
борная кислота — 0,309 г, калия хлорид —
Перемешивают, оставляют на 5 мин 0,373 г, натрия гидроокись — 0,176 г, магния
хлорид 6-водный — 0,0005 г. Навески реактивов
п-НФФ -
80,0
Раствор п-НФФ
помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл,
16 ммоль/л
растворяют и доводят до метки водой. 3. Суб-
MgCl 2 — 0,5
стратно-буферная смесь для инкубации пленок:
ммоль/л
а-нафтилфосфат натрия — 0,04 г, фиолетовый
быстрый Б (Fast violet В. salt) — 0,04 г. Навес-
ки реактивов растворяют в 20 мл боратного
Осторожно перемешивают и точно через 1, 2,
буфера. 4. Агароза: 0,32 г на 40 мл субстратного
3 м и н (или через другие, но равные промежутки
буфера. Заливают сначала половинным коли-
времени) измеряют экстинкцию при длине вол-
чеством буфера, доводят до кипения, после чего
ны 405 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против
прибавляют остаток буфера. Смесь второй раз
воды.
доводят до кипения. Охлаждают до 60 °С и сме-
Расчет активности фермента проводят по
шивают с буферно-субстратной смесью 1 : 1 .
формуле:
5. Раствор для промывания — 50 г/л раствор
3 6
активность, моль/(с • м ) =нмоль/(с • л) • 10 =
уксусной кислоты.
Специальное оборудование.
1. Аппарат для электрофореза на пленках из
ацетата целлюлозы. Можно использовать ЭПАУ-
где Vp,c, — объем реакционной смеси, мл; 20-50 отечественного производства. 2. Ацетат-
Усыв — объем сыворотки, мл; / — время реак- целлюлозная пленка ТУ 6-05-1696-74.
Х о д о п р е д е л е н и я . Нанесение сыво-
— изменение экстинкции за 1 с; ротки: способ нанесения (аппликация) сыво-
ротки имеет немаловажное значение при элект-
е — коэффициент молярной экстинкции п-НФ рофорезе на ацетатцеллюлозных пленках. Же-
в растворе 2А2М1П при 30 °С, м 2 - м о л ь - 1 лательно, чтобы аппликатор был фиксирован
(18,8- 10 2 ). Коэффициент молярной экстинкции и позволял наносить микроколичества сыворот-
п-НФ может меняться в зависимости от качества ки. Для определения изоферментов ЩФ тре-
реактива и условий определения; / — толщина буется 1—5 мкл сыворотки (двойная апплика-
слоя жидкости в кювете, м (1 • 1 0 - 2 ) . 1 МЕ = ция). Для облегчения трактовки результатов
= 1 м к м о л ь / ( м и н • л) = 16,67 н м о л ь / ( с - л ) . электрофореграммы на ацетатцеллюлозную
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы ; 500—1417 пленку можно наносить равные количества
н м о л ь / ( с - л ) , или 30—85 ME. обычной и предварительно инактивированной
Оценка а н а л и т и ч е с к о й надеж- теплом сыворотки.
н о с т и . Коэффициенты вариации составляют Проведение электрофореза.
3,2—4,8 %. При сравнении данного метода с ре- Ацетатцеллюлозную пленку замачивают в
ферентным методом МФКХ r = 0,99. По анали- электрофоретическом буфере в течение 20—
тическим качествам его можно использовать 30 мин. Высушивают фильтровальной бумагой,
в качестве временного референтного метода. наносят 1—5 мкл сыворотки и подключают ка-
меру к источнику напряжения. Электрофорети-
Л и т е р а т у р а . IFCC. Expert Panel on En- ческое разделение проводят в течение 50 мин
symes. Part 5 IFCC method for a l k a l i n e phosp- при напряжении 270 В и силе тока 15—25 мА.
hatase (ortho-phosphoric-monoester phospho- После электрофореза пленки кладут рабочей
hydrolase, a l k a l i n e o p t i m u m EC 3.1.3.1).— Clin. стороной на поверхность геля, содержащего суб-
chim. Acta, 1983, vol. 135, p. 339F — 367F Bo- стратно-буферную смесь ( 1 : 1 ) , и выдерживают
wers G. N., McComb R. B. C l i n . Chem., 1975, в термостате при 37 °С до развития окраски.
v o l . 21, № 13, p. 1988—1995; Bowers G. N., О ц е н к а р е з у л ь т а т о в . Непросветлен-
McComb R. В., Upretti A. C l i n . Chem., 1981, ные высушенные пленки оценивают с помощью
денситометра.
vol. 27, № 1, p. 135—143; A reference method
for measurement of a l k a l i n e phosphatase activity Н о р м а л ь н ы е з н а ч е н и я . В норме вы-
являются 1—2 фракции ЩФ в зоне а 2 -глобу-
in h u m a n serum.— C l i n . Chem., 1983, vol. 29,
№ 5, p. 751—761. линов.
208
Клиническое значение. Значи- вый оптимум рН, но различаются по действию
тельное увеличение активности ЩФ в сыворотке на них ряда веществ (ингибиторов), в частности
крови наблюдается при костных заболеваниях, тартрата (солей винной кислоты). Активность
связанных с увеличением количества остеоблас- простатической фракции фермента ингибируют
тов, или с более интенсивным синтезом ЩФ тартрат, ионы фтора и железа. При использо-
в остеобластах. Наиболее высокая активность вании 0,02 моль/л раствора тартрата и п-нитро-
(выше нормы в 20 раз и более) наблюдается фенилфосфата в качестве субстрата ингибиро-
при болезни Педжета (деформирующий остит), вание составляет 95 %, т. е. простатическая КФ
менее высокая — определяется при рахите. Зло- является тартратлабильной. Специфичностью к
качественные новообразования, поражающие КФ предстательной железы обладают субстраты
кости, также вызывают повышение активности п-нафтилфосфат и тимолфталеинфосфат.
ЩФ в сыворотке крови. При гиперпаратирео- Методы определения КФ те же, что и для
идизме уровень ЩФ повышается незначитель- ЩФ, но различаются по используемым буфер-
но. Изменения активности ЩФ в сыворотке ным системам и значению рН.
крови, помимо костной патологии, характерны Оптимизация условий определения и унифи-
кация методов. В методах определения актив-
при заболеваниях печени и желчных путей.
ности общей простатической КФ чаще всего
Резкое увеличение активности фермента на-
блюдается п р и заболеваниях, с о п р о в о ж д а ю щ и х , применяется цитратный буфер, обладающий
ся механической желтухой. В меньшей степени способностью активировать кислую фосфатазу
предстательной железы. В большинстве стан-
активность ЩФ увеличивается при гепатите и
дартных методов, рекомендуемых в различных
циррозе печени. Повышение активности фермен-
та в сыворотке крови при заболевании печени странах, и в наборах реактивов в качестве
и желчных путей связано с высвобождением субстрата используется п-нитрофенилфосфат.
ЩФ из поврежденных печеночных клеток или «Лахема» (ЧССР) выпускает набор реактивов
задержкой экскреции ЩФ из желчи, в резуль- для определения общей и простатической КФ.
тате чего фермент вновь поступает в кровоток, Метод по гидролизу п-нитрофенилфосфата
а также с индуктивным ее синтезом в желчных для определения активности общей и простати-
канальцах. При заболеваниях костей ЩФ в сы- ческой фракций. П р и н ц и п . КФ гидролизует
воротке по своим свойствам аналогична кост- п-нитрофенилфосфат в кислой среде с образова-
ному ферменту, при болезнях печени — фермен- нием п-нитрофенола, дающего в щелочной среде
ту, который выделяется из печени. Если при желтое окрашивание. Активность КФ предста-
электрофорезе в норме выявляется 1—2 фрак- тельной железы ингибируется L-тартратом.
ции ЩФ, то при патологии количество фракций Р е а к т и в ы . 1 . п-Нитрофенилфосфат ди-
и их расположение п р и электрофорезе могут натриевая соль (п-нитрофенилфосфат не дол-
меняться. Наиболее быстро мигрирующей фрак- жен содержать примеси п-нитрофенола); п-нит-
цией (от катода к аноду) является печеночный рофенилфосфат отечественного производства
изофермент. При заболеваниях печени возмож- требует перекристаллизации (см. 5.2.11). 2. Нат-
но появление второй печеночной полосы ЩФ. рия хлорид ч. д. а. или х. ч. 3. Натрия цитрат
Несколько более медленно по сравнению с пече- трехзамещенный, 1 моль/л, рН 5,5. 4. Калий-
ночной фракцией движется костная фракция натрий виннокислый ч. д. а. или х. ч. (раствор
ЩФ. Еще более медленно движется плацент- ингибитора), 0,12 моль/л раствор в 1 моль/л
ная термостабильная фракция ЩФ. Фракция растворе цитрата. 5. Раствор А: 80 мл концент-
ЩФ с очень высокой термостабильностью наз- рированного буферного раствора разбавляют
вана изоферментом «Реган» по имени больного 32 мл воды и в 37 мл этого раствора растворяют
раком легкого, у которого он был обнаружен 0,09 г п-нитрофенилфосфата и 0,31 г хлорида
впервые. Ее появление может быть связано с на- натрия. Определение можно проводить по набо-
личием злокачественного новообразования. На- ру реактивов «Лахема» (ЧССР). 6. Раствор Б:
иболее медленно мигрирующей фракцией явля- 40 мл концентрированного раствора ингибитора
ется кишечная ЩФ. разбавляют 16 мл воды и в 18,5 мл этой смеси
растворяют 0,045 г п-нитрофенилфосфата и
0,155 г хлорида натрия. Растворы А и Б стабиль-
5.2.12. Кислая фосфатаза, ны при хранении в холодильнике в посуде из
фракция кислой фосфатазы темного стекла в течение нескольких недель.
7, п-Нитрофенол ч. д. а. 8. Основной калибро-
вочный раствор п-нитрофенола: 16,68 мг п-нит-
Кислая фосфатаза — КФ (фосфогидролаза
рофенола помещают в мерную колбу вмести-
моноэфиров ортофосфорной кислоты, кислый
мостью 100 мл и доливают до метки водой. 9.
оптимум рН; К. Ф. 3.1.3.2) — содержится почти
Натр едкий ч. д. а. или х. ч., 0,1 моль/л.
во всех органах и тканях человека, особенно
богаты КФ клетки крови, предстательная желе- Материал для исследования.
за, печень, почки, кости. Активность КФ в пред- Свежая сыворотка или плазма крови, свобод-
стательной железе в 100 раз выше, чем в других ные от гемолиза.
тканях. КФ не является гомогенным ферментом. Х о д о п р е д е л е н и я . Опытная проба: в
Большинство тканей содержат два или более одну пробирку вносят 0,5 мл раствора А (общая
изоферментов, отличающихся по своим свой- активность), в другую пробирку — 0,5 мл рас-
ствам. твора Б (тартратстабильная фракция) и нагре-
Ткань предстательной железы содержит два вают до 37 °С в течение 5 мин. Добавляют
основных изофермента, которые имеют одинако- в обе пробирки по 0,1 мл сыворотки или плазмы

209
к набору реактивов для определения активности
и инкубируют 30 мин при 37 °С. Затем в обе
кислой фосфатазы в сыворотке крови. Био-Ла-
пробирки добавляют по 2 мл О, I моль/л раствора
Тест, «Лахема» (ЧССР).
гидроокиси натрия. Холостая проба: в пробирку
вносят 0,5 мл раствора А, далее обрабатывают К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Определе-
так же, как опытную, но сыворотку или плазму ние активности КФ обычно проводится для диаг-
добавляют после инкубации. Измеряют экстинк- ноза карциномы предстательной железы. При
цию опытной и холостой пробы при длине волны этом простатическая фракция КФ имеет боль-
405 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против шее диагностическое значение, чем общая КФ.
воды. Определение активности КФ может быть исполь-
Построение калибровочного зовано для дифференциальной диагностики ме-
г р а ф и к а . И з основного калибровочного тастазов рака предстательной железы в кости
раствора готовят рабочие растворы, как указано и заболеваний костной ткани, в частности остео-
ниже. дистрофий, при которых обычно повышен уро-
вень только щелочной фосфатазы, в то время
Активность КФ как при костных метастазах рака предстатель-
Основной
ной железы повышается, как правило, актив-
Вода ди-
калибро-
№ ность в крови как ЩФ, так и КФ. Массаж пред-
вочный ра- стилли-
про- стательной железы, катетеризация, цистоско-
рован- мкмоль/
створ п- нмоль/
бирки нитрофе- пия, ректальные исследования приводят к повы-
ная, мл (мин-л) (с- л)
нола, мл шению активности КФ, поэтому кровь для опре-
деления активности КФ рекомендуется брать не
раньше чем через 48 ч после указанных про-
1 2,5 41,7 цедур.
1,9
0,1
5 83,3
0,2 1,6
2
0,5 2,0 10 166,7
3
1,0 25 416,7
1,0
4
5.2.13. Фруктозо-1,6-дифосфат-альдолаза
833,5
50
1,0 —
5

Альдолаза — АЛД (В-фруктозо-1,6-бисфос-
фат D-глицеральдегид-З-фосфат-лиаза; К. Ф.
В каждую из 5 пробирок наливают по 0,1 мл 4.1.2.13) относится к классу лиаз. АЛД явля-
ется ферментом гликолиза. О. W a r b u r g ,
соответствующего рабочего калибровочного
W. C h r i s t i a n выделили впервые фермент в 1943 г.
раствора, прибавляют по 2,5 мл раствора NaOH,
перемешивают и измеряют экстинкцию против из скелетных мышц крыс. АЛД состоит из трех
воды при тех же условиях, что и экстинкцию изоформ: мышечной, печеночной, мозговой,
различающихся по субстратной специфич-
опытной пробы. По полученным з н а ч е н и я м
экстинкции строят калибровочный график зави- ности.
симости экстинкции от активности фермента. Мышечный фермент (фруктозе-1,6-дифосфа-
Р а с ч е т активности производят по калиб- тальдолаза) катализирует гидролиз фруктозо-
ровочному графику. Из экстинкции опытной про- 1,6-дифосфата значительно быстрее, чем фрук-
бы (раствор А) вычитают экстинкцию холостой тозо-1-монофосфата; он отличается малой ор-
пробы; разность экстинкции соответствует эк- ганной специфичностью, наибольшая актив-
стинкции общей КФ. Из экстинкции опытной ность его обнаруживается в скелетной муску-
пробы (раствор Б) вычитают экстинкцию хо- латуре, в сердечной мышце и печени. Печеноч-
лостой пробы; разность экстинкции соответству- ный тип (фруктозо-1-фосфатальдолаза) катали-
ет экстинкции тартратстабильной фракции. Для зирует реакцию расщепления фруктозе-1-моно-
обеих разностей находят соответствующую ак- фосфата на глицериновый альдегид и диокси-
тивность по калибровочному графику. Из вели- ацетонфосфат, содержится исключительно в пе-
чени.
чины активности общей КФ вычитают в е л и ч и н у
В норме в сыворотке крови активность
активности тартратстабильной фракции, полу-
фруктозо-1-фосфат-альдолазы не определяется.
чают активность тартратлабильной фракции КФ
(КФ предстательной железы). Для целей диагностики чаще определяют фрук-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Общая ак- тозо-1,6-дифосфат-альдол азу.
Методы определения. Для определения ак-
тивность 67—167 н м о л ь / ( с - л ) , или 4—10 ME;
тартратлабильная фракция 0—16,7 нмоль/ тивности АЛД в сыворотке крови применяют
спектрофотометрические методы по непрямому
/ ( с - л ) , или 0—1 ME.
В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен- оптическому тесту Варбурга; фотометрические
методы, основанные на определении фосфора
ты вариации колеблются от 6 до 10 %. Если
полученная величина активности общей КФ пре- фосфотриоз по реакции с параоксидифенилом;
вышает 830 н м о л ь / ( с - л ) , то исследование пов- динитрофенилгидразиновые методы (Сибли-Ле-
торяют при инкубации 10 мин и полученный нинжер, 1949). Шапиро (1960) был предложен
результат умножают на 3. динитрофенилгидразиновый метод для опреде-
ления активности фруктозе-1-фосфатальдолазы
Л и т е р а т у р а . Bessey О. A., Lowry О. Н., в сыворотке крови. Определение АЛД по не-
прямому оптическому тесту протекает по сле-
Brock М. 1. J. biol. Chem., 1946, vol. 164,
дующим р е а к ц и я м .
p. 321—329; Кислая фосфатаза. Инструкция
210
Метод, основанный на указанных реакциях, (от 30 до 40 мл), доводят рН до 7,4—7,6 и доли-
трудно выполнять в практических лабораториях вают водой до 100 мл. 6. Монойодуксусная
без наличия готовых наборов реактивов, к тому кислота, 0,4 г/л водный раствор: 40 мг монойод-
же глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа отличает- уксусной кислоты растворяют в 80 мл воды,
ся низкой стабильностью. Из-за трудоемкости доводят рН раствором едкого натра до 7,4 и до-
методы, основанные на определении фосфотри- ливают водой до 100 мл. 7. Трихлоруксусная
оз также не нашли широкого применения. кислота, 100 г/л. 8. Едкий натр, 30 г/л. 9. Бром-
Наиболее простыми и распространенными тимоловый синий (индикатор), 0,4 г/л: раство-
являются динитрофенилгидразиновые методы, ряют 10 мг индикатора в 3,2 мл 2 г/л раствора
основанные на гидролизе фруктозодифосфата едкого натра. Объем раствора доводят водой до
с образованием триоз, которые дают с 2,4-ди- 25 мл. Этим раствором пользуются для установ-
нитрофенилгидразином окрашенные гидразоны. ления рН. При рН 7,4—7,7 индикатор приобре-
Первый динитрофенилгидразиновый метод для тает синий цвет. 10. Калибровочный раствор
определения активности альдолазы в сыворотке диоксиацетона.
крови был описан J. Sibley, A. Lehninger в 1949 г. Материал для исследования!
В дальнейшем были предложены различные мо- Сыворотка, свободная от гемолиза.
дификации метода. В методах определения АЛД Х о д о п р е д е л е н и я . Опытная проба: в
сложным является вопрос относительно выбора пробирку вносят: 0,5 мл исследуемой сыворотки:
калибровочного материала. В качестве калибро- 0,5 мл 5 г/л раствора NaHCOa, 0,12 мл раствора
вочного материала можно использовать фрукто- гидразина сульфата, 0,12 мл раствора монойод-
зодифосфат и триозы: глицеральдегид или диок- уксусной кислоты, 0,12 мл воды, 0,12 мл фрукто-
сиацетон. Возможность использования глицер- зодифосфата. Перемешивают, инкубируют 1 ч
альдегида и диоксиацетона обусловлена тем, при 37 °С. После инкубации в пробу добавляют
что в ходе ферментативной реакции образуется 1,5 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной кисло-
равное количество триоз. Диоксиацетон — более ты, содержимое пробирок перемешивают и цен-
стойкое вещество, чем глицеральдегид, поэтому трифугируют.
его предпочтительнее использовать в качестве В другую пробирку вносят 0,5 мл центри-
калибровочного материала. фугата, 0,5 мл 30 г/л раствора NaOH и оставля-
Колориметрический динитрофенилгидрази- ют на 10 мин при комнатной температуре. Затем
новый метод (Товарницкого — Волуйской). добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенил-
П р и н ц и п . Альдолаза расщепляет фруктозо- гидразина, перемешивают, смесь нагревают
1,6-дифосфат на фосфоглицериновый альдегид 10 мин при 37 °С, добавляют по 3 мл 30 г/л
и фосфодиоксиацетон. При отщеплении лабиль- раствора NaOH и через 10—20 мин определяют
ного фосфора альдегидные и кетоновые группы оптическую плотность раствора на ФЭКе в кюве-
триоз фиксируются гидразином по мере их обра- те с толщиной слоя 0,5 см с зеленым светофильт-
зования. Для предупреждения вовлечения фос- ром (540 нм) против холостой пробы. При стоя-
фотриоз в дальнейшие реакции к раствору нии проб больше 20 мин окраска бледнеет.
фруктозодифосфата прибавляется монойодук- В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициент
сусная кислота, которая блокирует ферменты, вариации около 10 %.
разрушающие фосфотриозы. Свободные триозы Расчет проводят по калибровочной
с 2,4-динитрофенилгидразином образуют гидра- кривой.
зоны, окрашенные в щелочной среде. Построение калибровочной
к р и в о й . 22,5 мг диоксиацетона при нагрева-
Р е а к т и в ы . 1 . 0-фруктозо-1,6-дифосфата
нии растворяют в 25 мл воды; 1 мл такого рас-
натриевая соль, 0,06 моль/л; 2 мл 10 % раствора
натриевой соли 0-фруктозо-1,6-дифосфата (рас- твора содержит 10 мкмолей диоксиацетона.
В ряд пробирок (см. ниже) разливают калибро-
фасованного в ампулах) разводят в колбе вме-
вочный раствор диоксиацетона, доливают водой
стимостью 25 мл водой и доводят объем раствора
и далее проводят реакцию так же, как и при
до метки. Разведенный раствор фруктозе-1,6-
определении активности фермента.
дифосфата стабилен при хранении в холодиль-
нике. 2. HCI, 2 моль/л. Готовят разведением Л и т е р а т у р а . Sibfey J. A., Lehninger A. L.
17 мл концентрированной кислоты (отн. плот- J. biol. diem., 1949, vol. 177, p. 859.
ность 1,19) в 100 мл воды. 3. 2,4-Динитрофенил- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Повыше-
гидразин, 1 г/л раствор: 100 мг сухого вещества ние активности АЛД наблюдается при многих
растворяют в 100 мл 2 моль/л раствора HCI. патологических состояниях: остром гепатите, ин-
4. Натрия карбонат кислый, 5 г/л: 500 мг фаркте миокарда, прогрессивной мышечной ди-
МаНСОз растворяют в 100 мл воды. 5. Гидрази- строфии, дерматомиозите, гемолитических со-
на сульфат, 0,56 моль/л: растворяют 7,3 г гидра- стояниях, активном ревматизме, раке различной
зина сульфата в небольшом количестве воды локализации.
211
5.2.14. Псевдохолинэстераза
Калибре-- Фрукто-
Различают два типа холинэстераз — ацетил-
вочный Дистил- Диокси- 30-1,6-
холинэстеразу, или истинную холинэстеразу —
№ про- раствор лирован- ацетон в дифос-
АХЭ (ацетилхолин-ацетилгидролаза; К. Ф.
бирки диокси- ная вода, пробе, фат в
мкмоль
ацетона, пробе,
мл 3.1.1.7) и псевдохолинэстеразу — ХЭ (ацил-
мкмоль
мл холин-ацилгидролаза; К.Ф. 3.1.1.8). Истинная
холинэстераза содержится преимущественно в
эритроцитах, нервной и мышечной тка-
0,05 0,5 0,25
0,45
1 нях; Псевдохолинэстераза — в сыво-
1
0,4 0,5
2 0,1 ротке крови, печени, поджелудочной железе.
1
2
0,2 0,3
3 АХЭ и ХЭ различаются по ряду свойств и прежде
4 3 1,5
0,3 0,2 всего по субстратной специфичности. Наиболее
4
5 0,4 2
0,1 специфичным субстратом для истинной холин-
эстеразы является ацетилхолин, для псевдохо-
линэстеразы — бутирилхолин. Псевдохолинэс-
тераза не отличается строгой субстратной спе-
цифичностью и гидролизует такие субстраты,
Повышение активности фруктозомонофо-
как ацетилхолин, бензоилхолин, сукцинилхолин
сфат-альдолазы наблюдается при острых гепа-
и другие эфиры холина.
титах. При хронических гепатитах и циррозах
При гидролизе ацетилхолина реакция проте-
печени активность фермента повышается у боль-
кает следующим образом:
шинства больных, но это повышение менее выра-
жено, чем при остром гепатите.




ров под действием фермента образуется тиохо-
Методы определения. Манометрические ме-
тоды основаны на измерении в аппарате Вар- лин, который посредством своей SH-группы реа-
бурга количества СО2, образовавшегося из кар- гирует с 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной ки-
бонатного буфера под влиянием уксусной ки- слотой с образованием 2-нитро-5-меркапто-бен-
слоты, освободившейся во время ферментной зоата, имеющего желтую окраску с максимумом
абсорбции 410 нм. Эти методы могут быть ис-
реакции; титрометрические методы — на изме-
рении количества щелочи, пошедшей на титро- пользованы для кинетического измерения актив-
вание уксусной кислоты; фотометрические мето- ности фермента. При использовании в качестве
ды — на изменении цвета раствора под влия- субстрата бензоилхолина применяют спектрофо-
нием уксусной кислоты в присутствии индика- тометрический метод, п р и н ц и п которого основан
тора. К этой группе относится метод Молан- на различии абсорбции бензоилхолина и обра-
дера — Фридмана (1954), гидроксиламиновый зующейся в процессе реакции бензойной ки-
метод Хестрина (1949). Электрометрические ме- слоты.
тоды основаны на измерении рН реакционной В 1974 г. в качестве унифицированного ут-
смеси до и после опыта. Принцип кондуктомет- вержден фотометрический метод с субстратом
рических методов состоит в изменении электро- ацетилхолинхлоридом. Все параметры реакции
проводности инкубационной среды в результате в методе оптимизированы.
ферментативной реакции. Унифицированный метод по гидролизу аце-
Применение кондуктометрических и мано- тилхолинхлорида. П р и н ц и п . Под действием
холинэстеразы происходит гидролиз ацетилхо-
метрических методов на практике ограничено,
линхлорида с образованием уксусной кислоты
так как требуется дорогостоящая аппаратура.
и холина. Уксусная кислота сдвигает рН раст-
Наиболее простыми являются фотометрические
вора, что устанавливается с помощью индика-
методы, основанные на гидролизе ацетилхолина
с образованием уксусной кислоты и изменением тора.
Р е а к т и в ы . 1 . Ацетилхолина хлорид,
'цвета реакционной смеси в присутствии индика-
0,9 моль/л: 1,63 г ацетилхолина хлорида рас-
тора. Эти методы различаются по концентрации
творяют в 10 мл воды. При использовании фар-
субстрата, виду буфера и индикатора. Широко
макопейного ампулированного препарата содер-
применяются также методы с использованием
жимое одной ампулы (0,2 г) растворяют в 1,2 мл
в качестве субстрата ацетилтиохолина или бути-
воды. 2. 5,5'-Диэтилбарбитуровой кислоты нат-
илтиохолина. В результате гидролиза этих эфи-
212
Из каждого разведенного раствора берут по
риевая соль (натриевая соль веронала), фарм.
0,2 мл, смешивают с 5 мл вероналового буфера,
3. НС1, 0,1 моль/л. 4. Натр едкий х. ч., 0,05
0,1 мл сыворотки, прогревают 5 мин при 37 °С,
моль/л. 5. Феноловый красный, индикатор, рас-
затем добавляют 0,2 мл прозерина, 0,2 мл аце-
твор 0,1 г/л, область действия рН 6,8—8,4.
тилхолинхлорида, инкубируют 30 мин при 37 "С
Изменение окраски от желтой к красной. В фар-
и охлаждают. Измерение проводят при тех же
форовой ступке с 5,7 мл 0,05 моль/л раствора
условиях, что и опытные пробы. Холостую пробу
едкого натра растворяют 0,1 г сухого и н д и к а -
ставят так же, к а к калибровочную, но вместо
тора, переносят в мерный цилиндр и доводят
растворов уксусной кислоты добавляют воду.
до 25 мл водой. Из полученного 4 г/л раствора
Из экстинкции холостой пробы вычитают эк-
перед употреблением готовят 0,1 г/л раствор
стинкцию калибровочной пробы. Линейная зави-
разведением водой в 40 раз. 6. Вероналовый
симость калибровочного графика сохраняется
буфер, 0,0075 моль/л, рН 8,4: 1,5450 г натриевой
в пределах от 0 до ПО мкмоль/(с • л ) .
соли веронала растворяют в 500 мл воды, добав-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 45—95
ляют 9 мл 0,1 моль/л раствора HCI и 150 мл
мкмоль/(с • л ) , или 160—340 м к м о л ь / ( ч • м л ) .
0,1 г/л раствора индикатора, измеряют рН.
В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-
Доливают водой до 1 л. При х р а н е н и и в холо-
ты вариации 5—9 %.
дильнике в посуде из темного стекла реактив
стабилен в течение 1 мес. 7. Прозерин, фарм., Л и т е р а т у р а . Делекторская Л. Н., Доб-
7 г/л: 0,7 г прозерина помещают в мерную колбу
рянская Л. Д. В кн.: Унифицированные методы
вместимостью 100 мл и доводят до метки водой. клинических лабораторных исследований/Под
Хранят в посуде из темного стекла. 8. Калибро- ред. В. В. Меньшикова.— М., 1974, вып. V I ,
вочный раствор уксусной кислоты, 0,1 моль/л: с. 5—18; Molander D., Friedman M., La Due J.
0,57 мл ледяной уксусной кислоты (х. ч.) поме- A n n . I n t . Med., 1954, vol. 41, № 6, p. 1139—1151;
щают в мерную колбу вместимостью 100 мл
Schafer C. W., Dopke K. H., Gall, Gothe W.
и доводят до метки водой. A r z n . s t a n d a r d , 1967, Bd 3, S. 84.
Материал для исследования.
Метод с субстратом бутирилтиохолина йоди-

<<

стр. 11
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>