<<

стр. 12
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

Сыворотка, свободная от гемолиза. Цитратную
дом. П р и н ц и п . Холинэстераза гидролизует
и оксалатную плазму употреблять нельзя, так
субстрат бутирилтиохолина йодид с образова-
как соли лимонной и щавелевоуксусной кислот
нием кислоты и тиохолина. Тиохолин взаимодей-
ингибируют активность фермента.
ствует с 5,5'-дитио-бис-(2-нитро-бензойной ки-
Х о д о п р е д е л е н и я . Опытная проба:
слотой) с образованием 2-нитро-5-меркаптобен-
смешивают 5 мл вероналового буфера, 0,2 мл
зоата, окрашенного в желтый цвет.
воды и 0,1 мл сыворотки. Смесь прогревают
Основная реакция:
при 37 °С в течение 5 м и н . Затем добавляют
0,2 мл раствора ацетилхолинхлорида и инкуби-
руют в течение 30 мин при 37 °С. После инкуба-
ции добавляют 0,2 мл раствора прозерина. Ох-
лаждают и измеряют на ФЭКе в кювете с толщи- И н д и к а т о р н а я реакция:
ной слоя 0,5 см при длине волны 500-560 нм
тиохолин+ 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойная
(зеленый светофильтр) против воды. Окраска
кислота) — —>-2-нитро-5-меркаптобензоат.
устойчива в течение 1 ч. Холостую пробу ставят
Активность холинэстеразы сыворотки крови
так же, как опытную, но раствор прозерина
пропорциональна скорости изменения поглоще-
добавляют до и н к у б а ц и и . Из э к с т и н к ц и и хо-
ния 2-нитро-5-меркаптобензоатом в индикатор-
лостой пробы вычитают экстинкцию опытной
ной реакции.
пробы.
Р е а к т и в ы . 1 . Калия фосфат однозаме-
Р а с ч е т ведут п о калибровочному гра-
щенный ч. д. а. или х. ч. 2. Натр едкий х. ч. или
фику.
Построение калибровочного ч. д. а. 3. Фосфатный буфер, 52 ммоль/л, рН 7,7:
в мерной колбе вместимостью 1000 мл последо-
г р а ф и к а . Из 0,1 моль/л раствора уксус-
вательно растворяют приблизительно в 900 мл
ной кислоты готовят разведения, как указано
воды 7,075 г однозамещенного фосфата к а л и я
ниже.
и 1,496 г едкого натра. Проверяют рН и доводят
объем до метки водой. 4. 5,5'-Дитио-бис-(2-нит-
робензойная кислота) кристаллическая, 0,26
ммоль/л раствор в фосфатном буфере, рН 7,7:
0,103 г 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кисло-
ты) растворяют в 500 мл фосфатного буфера
рН 7,7 в мерной колбе вместимостью 1 л. Объем
доводят буфером до метки. Раствор стабилен
в течение 6 нед при х р а н е н и и в холодильнике
в посуде из темного стекла. 5. S-Бутирилтио-
холина йодид кристаллический, 218 ммоль/л:
0,0792 г бутирилтиохолина йодида растворяют
в мерной колбе, вместимостью 10 мл в воде.
Объем доводят до метки. Раствор стабилен в те-
чение 6 нед при хранении в холодильнике в посу-
де из темного стекла. 6. L-Цистеина гидрохло-
рид, мол. м. 175,6, х. ч. Пригоден L-цистеина Специальное оборудование. 1.
гидрохлорид производства ВНР. Хранят в холо- Спектрофотометр или колориметр с термостати-
дильнике. 7. Основной калибровочный раствор рованной кюветой (25; 30; 37 °С) для микро-
измерений. Колебания температуры не должны
L-цистеина гидрохлорид, 5 ммоль/л. Готовят в
ледяной бане: 0,0878 г цистеина гидрохлорида п р е в ы ш а т ь ±0,1 °С. 2. Полуавтоматические
растворяют в 50 мл воды в колбе вместимостью микропипетки.
100 мл, объем доводят до метки водой. Раствор Материал для исследования.
стабилен в течение 2 ч при х р а н е н и и в холодиль- Сыворотка или плазма крови. Холинэстераза
нике. 8. Рабочий к а л и б р о в о ч н ы й раствор ци- сыворотки крови стабильна в течение 5 дней п р и
хранении при комнатной температуре или в хо-
стеина гидрохлорида 2 ммоль/л соответствует
активности холинэстеразы 4000 МЕ/л, или лодильнике.
66,68 мкмоль/(с • л). Готовят путем разведения Х о д о п р е д е л е н и я . Перед определени-
основного калибровочного раствора водой в ем температура рабочих растворов и сыворотки
2,5 раза. Стабилен в течение 2 ч при хране- должна быть доведена до температуры измере-
нии в холодильнике. ния. Определяют по следующей схеме.




Смешивают и тотчас измеряют оптическую изменение экстинкции в 1 с; / — толщина слоя
2
плотность против воды при длине волны 400 жидкости в кювете, м ( 1 - 1 0 - ); ? — коэф-
440 (405) нм в кювете с толщиной слоя 1 см и од- фициент . молярной экстинкции 2-нитро-5-мер-
новременно включают секундомер. Далее еще каптобензоата в условиях проведения определе-
н и я (м 2 • моль- ' ) .
3 раза измеряют экстинкцию точно через 30;
60; 90 с. Величина коэффициента молярной экстинк-
Р а с ч е т . Для расчета ^Е/30 с - и з каждого ции зависит от условий проведения определе-
последующего результата измерения (при 25 ния: рН, температуры, длины волны измерения
и др. Коэффициент молярной экстинкции при
или 30 °С для опытной пробы и при 37 °С —-
для опытной и холостой проб) вычитают пре- температуре 25 °С, длине волны 405 нм, толщине
2 2
дыдущий. Из полученных величин Е/30 с рас- слоя кюветы I см равен 13,3- 10 м /моль, при
измерении на фотоколориметре со светофильт-
ром с длиной волны 405 нм при 30 °С — 14,3
м 2 /моль, при 37 °С — 14,66 м 2 /моль.
рую используют в последующих р а с ч е т а х . В ел у Построение калибровочной
чае измерения при 37 °G делают поправку на к р и в о й . Из основного раствора L-цистеина
холостую пробу (за счет с п о н т а н н о г о гидролиза п р и г о т а в л и в а ю т серию рабочих калибровочных
субстрата). растворов как указано ниже.
Активность холинэстеразы в сыворотке крови
может быть рассчитана по формуле с п р и м е н е -
нием коэффициента молярной экстинкции 2-
нитро-5-меркаптобензоата, по калибровочной
Активность
кривой и с использованием величины э к с т и н к ц и и Основной холинэстеразы
Вода ди-
рабочего калибровочного раствора L-цистеина. № про- раствор стиллиро-
Р а с ч е т с п р и м е н е н и е м коэффициента мо- бирки L-цистеи- в а н н а я , мл
мкмоль/
на, мл ME
лярной экстинкции производят по следующей (с-л)
формуле:

1 000
каталитическая активность, м о л ь / ( с - м 3 ) = 16,67
9
1 1
2000
2 2 8 33,34
4000
3 4 6 66,68
6000
4
4 6 100,02
8000
2
8
5 133,76
10000 166,7
6 10
где Vр. с.— объем реакционной смеси; V сыв — —
объем сыворотки; t — время реакции, с; ^E —
214
К 5 мкл каждого рабочего калибровочного Воспроизводимость 7—10%.
раствора добавляют 750 мкл 5,5'-дитио-бис-
П р и м е ч а н и е . Определение и расчет ко-
(2-нитробензойной кислоты) в фосфатном бу-
эффициента молярной абсорбции для 2-нит-
абсорбции для 2-нит-
фере и 25 мкл воды. Экстинкцию измеряют при
ро-меркаптобензоата проводят по формуле:
ро-меркаптобензоата проводят
405 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против
холостой пробы. Е
2,
Е= М /МОЛЬ,
Холостая проба включает 750 мкл раствора
5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) в
где с — концентрация L-цистеина в реакци-
фосфатном буфере и 30 мкл воды. онной смеси, моль/м 3 ; / — толщина слоя
Линейность калибровочной кривой сохраня- кюветы, м; ? — экстинкция 2-нитро-5-мер-
ется до 166,7 м к м о л ь / ( с - л ) или 10000 ME. каптобензоата для данной концентрации
Р а с ч е т . При расчете по рабочему калиб- L-цистеина в условиях опыта.
ровочному раствору L-цистеина используют
Л и т е р а т у р а . Knedel M., Bottger R.
формулу:
Klin. Wschr., 1967, Bd 45, S. 325; Szasz G.
Clin. chim. Acta, 1968, vol. 19, p. 191; Test-
Combination Cholinesterase. Cat. № 124133,
Boehringer Mannheim GmbH. Diagnostica.
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . При пораже-
ния абсорбции опытной пробы за 30 с; Екал — эк- нии печени активность фермента в сыворотке
стинкция рабочего калибровочного раствора крови понижается, так как нарушается синтез
L-цистеина; 66,68 — активность холинэстеразы фермента клетками печени. Определение актив-
для рабочего калибровочного раствора L-цисте- ности холинэстеразы не имеет большого значе-
ина, мкмоль/(с • л ) , за 30 с. ния при остром гепатите, но очень ценно для
Нормальные величины: при наблюдения за течением болезни и для определе-
25 °С — 50—155 м к м о л ь / ( с - л ) , или 3000— ния прогноза при хронических заболеваниях
9300 ME; при 30 °С — 62—191 мкмоль/(с • л), печени. Активность фермента уменьшается при
отравлении фосфорорганическими соедине-
или 3714—11513 ME; при 37 °С — 88—240
м к м о л ь / ( с - л ) , или 4659—14443 ME. ниями.



5.3. Н И З К О М О Л Е К У Л Я Р Н Ы Е АЗОТИСТЫЕ ВЕЩЕСТВА

ществами с образованием окрашенных соедине-
Низкомолекулярные азотистые вещества или
небелковые азотистые компоненты крови состоят ний; ферментативными методами с последу-
ющим определением аммиака или углекислоты
главным образом из конечных продуктов обмена
как продуктов действия уреазы на мочевину.
белков и нуклеиновых кислот. Эти вещества ос-
Принцип газометрических методов основан на
таются в сыворотке крови после осаждения
окислении мочевины гипобромитом натрия в ще-
белка.
В состав фракций небелкового азота крови лочной среде. Мочевина подвергается окисле-
нию соответственно следующему уравнению:
или сыворотки крови входит азот мочевины
˜50 %, аминокислот ˜25 %, мочевой кислоты
˜4 %, креатина и креатинина ˜7,5 %, аммиа-
CO(NH 2 ) 2 + 3NaBrO—>
ка и индикана ˜0,5 %, полипептидов, нуклео-
тидов и других азотистых соединений ˜5 %. + 3NaBr+2H 2 O.
2
Содержание небелковых компонентов сыворотки
крови может меняться в зависимости от способа
осаждения белков. Основной фракцией остаточ- Углекислота поглощается раствором, объем
ного азота является мочевина, определение ко- газообразного азота измеряется с помощью спе-
торой может применяться в диагностических циального аппарата. Наиболее удобно для прак-
целях вместо остаточного азота. тических целей проводить определение мочевины
в аппарате Бородина. Недостатком этой реакции
являются ее низкие специфичность и точность,
так как гипобромит натрия реагирует не только
5.3.1. Мочевина
с мочевиной, но и с другими соединениями,
содержащими аминогруппы. Методы этой груп-
Синтез мочевины происходит в печени глав- пы неточны, плохо воспроизводимы и неудобны
ным образом из аммиака, который образуется при серийной работе, чувствительность их низ-
при дезаминировании аминокислот, распада пу- кая. Бром характеризуется высокой токсично-
риновых и пиримидиновых нуклеотидов. стью.
Методы определения мочевины. Мочевину Среди фотометрических методов наиболее
в биологических жидкостях можно определить распространенными являются методы, основан-
газометрическими, гипобромитными методами; ные на реакции мочевины с диацетилмоноокси-
прямыми фотометрическими методами, основан- мом — реакции Ферона, протекающей в два
этапа.
ными на реакции мочевины с различными ве-
215
Для окисления гидроксиламина могут приме- достаточно чувствительна, но определению
няться следующие вещества: персульфат калия, аммиака мешает наличие в пробах
мышьяковая кислота, хлорная кислота, катионы, бел ка.
феназон. Для интенсификации окраски и повы- Ферментные методы определения аммиака по
шения ее стабильности применяются: тиосеми- оптическому тесту Варбурга с применением глу-
карбазид, фенилантраниловая кислота, глюку- таматдегидрогеназы позволяют определить н а и -
ронолактон, катионы, триптофан и нитриты. Ме- более правильно содержание аммиака и прием-
тоды этой г р у п п ы отличаются хорошей воспро- лемы для ручного и автоматического определе-
изводимостью, высокой чувствительностью, ния мочевины.
большей специфичностью, чем гипобромитные. Ксантгидроловые методы в клинических ла-
В некоторых методах используется 20—50 мкл бораториях применяются редко, так как трудо-
сыворотки, что позволяет применять их без де- емки и неспецифичны, многие амины и амиды
протеинизации сыворотки. дают с ксантгидролом такую же реакцию, как
Ферментативные методы основаны на гидро- и мочевина. Кроме перечисленных выше ве-
лизе мочевины уреазой. Для уреазы мочевина ществ, мочевина образует окрашенные соедине-
является единственным физиологическим суб- ния с п-диметиламинобензальдегидом (реакция
стратом, поэтому уреазные методы высокоспе- Эрлиха), изо-нитрозопропиофеноном, N-бром-
цифичны. Оптимум действия уреазы рН 6,0— сукцинидом. Однако перечисленные реакции не
8,0 зависит от вида буфера. Наиболее употре- являются специфичными на мочевину. Уреазный
бительные буферные растворы в уреазных ме- и диацетилмонооксимный методы применяются
тодах: ЭДТА-буфер, оптимум рН 6,0—6,5, и на автоанализаторах различного п р и н ц и п а дей-
фосфатный буфер, оптимум рН 6,9—7,0. Ком- ствия.
мерческие препараты уреазы характеризуются Унификация методов. В качестве унифици-
различной активностью и степенью чистоты. Об- рованных утверждены диацетилмонооксимный
разовавшийся в ходе ферментативной реакции метод в 1972 г. и уреазный метод, фенолгипо-
аммиак можно определить с помощью различ- хлоритная реакция в 1974 г. «Лахема» (ЧССР)
ных реакций. Фенолгипохлоритная реакция вы- выпускает наборы реактивов для определения
сокочувствительна и специфична на аммиак. мочевины диацетилмонооксимным и уреазным
В реакции используются катализаторы, наибо- методами. На уреазном принципе основано
лее эффективным из применяемых катализато- определение мочевины во многих коммер-
ров является нитропруссид натрия. Интенсив- ческих наборах реактивов, например фирмы
ность окраски образующегося соединения не за- «Boehringer Mannheim» (ФРГ), «Reanal»
висит строго от концентрации реактивов. Изме- (ВНР).
нение концентрации фенола и нитропруссида Унифицированный метод по цветной реакции
натрия на 20 % и гипохлорита натрия на 25— с диацетилмонооксимом. П р и н ц и п . Мочеви-
50 % не влияет на интенсивность окраски. Соот- на образует с диацетилмонооксимом в присут-
ношение концентраций фенола, едкого натра ствии тиосемикарбазида и солей железа в кис-
и гипохлорита натрия в реакции приблизительно лой среде окрашенное соединение.
должно быть равно 1:1:0,1. Салицилатно-гипо- Р е а к т и в ы . 1 . Трихлоруксусная кислота,
хлоритная реакция, описанная R. Richterich, 100 г/л. 2. Диацетилмонооксим, 25 г/л водный
является чувствительной и специфичной на ам- раствор. Реактив стабилен. 3. Тиосемикарбазид,
миак. Реакция Несслера не является специфич- 2,5 г/л водный раствор. Для приготовления
ной, приблизительно в 10 раз менее чувствитель- реактива можно пользоваться также тиосеми-
на на а м м и а к , чем фенолгипохлоритная. Недо- карбазида гидрохлоридом; последний применя-
статком реакции является частое образование ется в виде 3,2 г/л водного раствора. Оба реак-
помутнения. Дихлоризоциануратная реакция тива стабильны при хранении в темной посуде
216
при комнатной температуре. 4. Серная кислота тывают калибровочную пробу, как описано для
концентрированная. 5. Ортофосфорная кислота определения мочевины в сыворотке крови.
85 %. 6. Хлорное железо. Основной раствор Р а с ч е т мочевины н а суточное количество
хлорного железа: 5 г хлорного железа доводят мочи производят по следующей формуле:
до 100 мл водой и подкисляют добавлением 1 мл
концентрированной серной кислоты. Из основно-
го раствора готовят рабочий раствор хлорного
железа: 1 мл основного раствора хлорного желе-
за доводят до 100 мл водой, затем добавляют где Мсут — количество мочевины в суточной мо-
8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл че, ммоль; Еоп — экстинкция опытной пробы;
85 % ортофосфорной кислоты. Хранят в темной Е к — экстинкция калибровочной пробы; С к —
посуде. Годен в течение 2 нед. 7. Бензойная содержание мочевины в калибровочном рас-
кислота, 2 г/л; 0,2 г кристаллической бензойной творе, ммоль; а — суточное количество мочи,
кислоты растворяют в 100 мл воды при интенсив- мл, б — количество мочи, взятое на анализ,
ном перемешивании на водяной бане. 8. Моче- мл; К—коэффициент разведения мочи.
вина для приготовления калибровочного рас- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Для сыво-
твора. Готовят 7 ммоль/л раствор мочевины: ротки крови — 2,5—8,3 ммоль/л, или 15—50 м г /
42 мг мочевины растворяют в воде в мерной кол- 100 мл; для мочи — 330—580 ммоль мочевины
бе вместимостью 100 мл. В качестве раствори- в суточной моче, т. е. 20—35 г/сут.
теля можно использовать 2 г/л раствор бензой-
П р и м е ч а н и я . 1 . Измерение проводят н е
ной кислоты. Калибровочный раствор, приго-
позже чем через 15 мин после охлаждения
товленный на растворе бензойной кислоты, ста-
проб ввиду неустойчивости окраски. 2. Из-за
бильнее, чем водный; 1 мл калибровочного рас-
неустойчивости окрашенного комплекса мо-
твора содержит 0,007 ммоль мочевины. 9. Цвет-
чевины с диацетилмонооксимом и зависимо-
ной реактив: к 30 мл рабочего раствора хлорного
сти окраски от условий нагревания калибро-
железа добавляют 20 мл воды, 1 мл 25 г/л рас-
вочную пробу определяют параллельно каж-
твора диацетилмонооксима и 0,25 мл 2,5 г/л дой серии опыта. 3. При содержании моче-
раствора тиосемикарбазида. Цветной реактив вины в сыворотке крови выше 17 ммоль/л
готовят каждый раз перед употреблением. сыворотку разводят изотоническим раство-
Материал для исследования. ром хлорида натрия, а результаты умножают
Сыворотка крови, моча. Перед определением на коэффициент разведения. 4. Для пере-
профильтрованную мочу (из суточного коли- счета на азот мочевины результаты следует
чества) разводят изотоническим раствором нат- разделить на 2,14.
рия хлорида в соотношении 1:25 или 1:50.
Оценка а н а л и т и ч е с к о й надеж-
Х о д о п р е д е л е н и я мочевины в сыво-
н о с т и м е т о д а . Воспроизводимость: коэф-
ротке крови. Опытная проба: в центрифужную
фициенты вариации составляют 3—6 %. Пра-
пробирку наливают 0,8 мл воды, 0,2 мл сыво-
вильность: результаты исследования, получен-
ротки и 1 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной
ные диацетилмонооксимным методом, хорошо
кислоты, смешивают. Через 15 — 20 м и н центри-
коррелируют с у р е а з н ы м методом; г = 0,93—
фугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 мл
0,97.
надосадочной жидкости и 5 мл цветного реакти-
ва. Пробирку выдерживают на кипящей водяной
бане в течение 20 мин, затем охлаждают в тече- Л и т е р а т у р а . Marsh W., Fingerhut В.,
ние 2 — 3 м и н под проточной водой. Измерение Miller H. C l i n . Chern., 1965, vol. 1 1 , p. 624.
проводят на фотометре п р и длине волны 530 —
560 нм (зеленый светофильтр) против холостой Уреазный метод по реакции с фенол-гипо-
пробы в кювете с толщиной слоя 1 см. Холо- хлоритом. П р и н ц и п . Мочевина под действи-
ем уреазы разлагается с образованием а м м и а к а
стую пробу ставят так же, как опытную, но
вместо надосадочной жидкости берут 0,5 мл и углекислого газа. Выделившийся а м м и а к об-
воды. разует с гипохлоритом натрия и фенолом окра-
шенный продукт—индофенол (синего цвета).
Р а с ч е т проводят по формуле путем срав-
Реакция катализируется нитропруссидом нат-
нения с калибровочной пробой. Калибровочную
рия. Интенсивность окраски пропорциональна
пробу ставят аналогично опытной, но вместо
содержанию мочевины. Стадии реакции:
сыворотки берут 0,2 мл калибровочного рас-
твора.




где Еоп — экстинкция опытной пробы; Е к — эк-
стинкция калибровочной пробы; С к — концен-
трация мочевины в калибровочном растворе,
7 ммоль/л.
Определение мочевины в моче
проводят аналогично определению мочевины в
сыворотке крови, но вместо сыворотки берут
0,2 мл разведенной мочи. Параллельно обраба-

217
Р е а к т и в ы . 1. Уреаза. Для определения содержит 0,011 моль/л гипохлорита и 0,13 моль/л
пригодна уреаза с активностью > 5 МЕ/мг. едкого натра. Раствор хранят в холодильнике
2. Этилендиамин-N, N, N', N'-тетрауксусной в посуде из темного стекла. 12. Мочевина ч. д. а.
кислоты динатриевая соль (трилон Б), ч. д. а. 13. Бензойная кислота, 2 г/л (кислоту раство-
3. ЭДТА — буфер, 0,0269 моль/л, рН 6,5:0,50 г ряют при н а г р е в а н и и ) . 14. Калибровочный рас-
трилона Б растворяют в 30—40 мл воды, доводят твор мочевины, 0,5 ммоль/л: 15 мг мочевины
рН до 6,5 1 моль/л раствором едкого натра и до- растворяют в мерной колбе вместимостью 500 мл
ливают водой в мерной колбе до 50 мл. 4. Основ- в 2 г/л растворе бензойной кислоты. Раствор
ной раствор уреазы в буфере, 10 МЕ/мл: 20 мг стабилен при хранении в холодильнике. 15. Нат-
уреазы (активность 5 МЕ/мг) растворяют в рия хлорид, 0,154 моль/л.
10 мл буфера. Навеску уреазы берут в зависи- Специальное оборудование.
мости от активности фермента. Раствор Спектрофотометр или колориметр с кюветой
стабилен в течение месяца при хранении для микроизмерений. 2. Полуавтоматические
в холодильнике. 5. Рабочий раствор уреазы. микропипетки.
Перед началом определения берут Материал для и с с л е д о в а н и я .
необходимое количество основного рас- Сыворотка крови или плазма.
твора уреазы и разводят бидистиллированной Х о д о п р е д е л е н и я . Перед определе-
водой в отношении 1 : 4 . 6. Фенол ч. д. а. 7. Нат- нием сыворотку разводят 0,154 моль/л раство-
рия нитропруссид 2-водный ч. д. а. 8. Цветной ром хлорида натрия в отношении 1:9.
реактив: фенол — 0,11 моль/л, нитропруссид Опытная проба: 100 мкл рабочего раствора
натрия — 0,18 моль/л: 0,0263 г нитропруссида уреазы вносят в пробирку, добавляют 20 мкл
натрия помещают в мерную колбу вместимостью разведенной сыворотки. Закрывают пробкой, пе-
500 мл, приливают примерно 300 мл воды, рас- ремешивают и инкубируют в течение 15 мин
творяют при перемешивании. Затем добавляют при 37 °С. После инкубации добавляют 300 мкл
цветного реактива и 300 мкл рабочего раствора
5,18 г фенола и доливают водой до метки. Реак-
гипохлорита натрия. Перемешивают и инкуби-
тив стабилен в течение месяца при х р а н е н и и
руют в течение 20—30 мин при 37 °С. Измеряют
в холодильнике в посуде из темного стекла.
экстинкцию в кювете с толщиной слоя 1 см
9. Натр едкий ч. д. а., х. ч., 1 моль/л; 0,26 моль/л.
10. Гипохлорит натрия. Приготовление основ- при длине волны 500—560 нм (зеленый свето-
ного раствора гипохлорита: 100 г хлорной из- фильтр) против холостой пробы. Окраска ста-
бильна в течение нескольких часов.
вести размешивают в течение 15 мин с 170 мл
воды, после чего прибавляют при непрерывном Холостую пробу обрабатывают так же, как
помешивании раствор, состоящий из 170 мл во- опытную, но вместо сыворотки берут 0,154 моль/л
ды и 70 г карбоната натрия. Масса сначала раствор NaCl.
густеет, затем разжижается. Оставляют стоять Калибровочную пробу обрабатывают так же,
как опытную, но вместо сыворотки берут калиб-
до следующего дня. Надосадочную жидкость
ровочный раствор мочевины. Измеряют при тех
(гипохлорит н а т р и я ) сливают и фильтруют че-
же условиях против холостой пробы.
рез промытый водой фильтр. Хранят в холо-
Расчет ведут по формуле:
дильнике в посуде из темного стекла. Определе-
ние активности хлора: 1 мл основного раствора
гипохлорита натрия смешивают с 100 мл воды.
К 50 мл этого раствора добавляют 5 мл свеже-
приготовленного 50 г/л раствора йодида калия где Еоп — экстинкция опытной пробы; Ек — эк-
и 10 мл 6 моль/л раствора НС1. Титруют 0,1 н. стинкция калибровочной пробы; 0,5— концент-
раствором тиосульфата натрия (готовят из фик- рация мочевины в калибровочном растворе,
санала). Как только раствор приобретает слабо- ммоль/л; 10— коэффициент разведения.
желтую окраску, добавляют 10 капель 1 % рас- Линейная зависимость между оптической
твора крахмала и титруют до обесцвечивания. плотностью и концентрацией мочевины сохра-
Концентрацию гипохлорита натрия рассчитыва- няется до 33 ммоль/л.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Сыворотка
ют по хлору:
крови —2,5—8,3 ммоль/л, или 20—50 мг/100 мл.
К = а- 0,709, Оценка а н а л и т и ч е с к о й надеж-
н о с т и м е т о д а . Коэффициенты вариации
где К — концентрация активного хлора, находятся в пределах 3—8 %. Уреазная реак-
г/100 мл гипохлорита натрия; а — количество ция высокоспецифична. Фенолгипохлоритная
тиосульфата, пошедшего на титрование, мл; реакция в условиях проведения метода при
0,709 — коэффициент пересчета 1 мл тиосуль- рН> 7,0 также специфична.
фата натрия в концентрацию хлора, г/100 мл.
П р и м е ч а н и е . Объемы сыворотки и реак-
11. Рабочий раствор гипохлорита натрия. После
тивов можно пропорционально увеличивать.
установления концентрации активного хлора ос-
новной раствор гипохлорита натрия разводят Л и т е р а т у р а . Chaney A. L., Mar-
водой так, чтобы концентрация хлора состав- bach Е. P. C l i n . Chem., 1962, vol. 8, p. 131;
ляла 0,78 г/л. Раствор гипохлорита с содержа- Gutmann 1., Bergmeyer H. U. I n : Methods of
нием хлора 0,78 г/л смешивают с равным объе- enzymatic analysis/Ed. H. U. Bergmeyer 2 ed.
мом 0,26 моль/л раствором едкого натра New Jork — London, 1974, vol. 4, p. 1791 —
(100 мл + 100 м л ) . Активность хлора проверяют 1794; Kaplan A. In: Standard methods in c l i n i c a l
не реже одного раза в 2 нед. Рабочий раствор chemistry.— New York, 1965, vol. 5, p. 245.

218
Уреазный метод по салицилатно-гипохлорит- Р а с ч е т производят по следующей фор-
ной реакции. П р и н ц и п . Тот же. Вместо фе- муле:
нола применяют салицилат натрия. концентрация мочевины, ммоль/л =
Р е а к т и в ы . 1 . Этилендиаминтетрауксус-
ная кислота, динатриевая соль ЭДТА. 2. Азид
натрия. 3. Натр едкий, 5 моль/л; 1 моль/л.
4. Гипохлорит натрия. 5. Йодид калия, 50 г/л.
где Еоп -- экстинкция опытной пробы, измерен-
6. НС1, 6 моль/л. 7. Нитропруссид натрия,
2,69 ммоль/л. 8. Буферный раствор: ЭДТА — ная против холостой пробы на реактивы;
26,9 ммоль/л; HCI — 20 ммоль/л; азид нат- Е х о л , сыв — экстинкция холостой пробы на сыво-
рия — 15,4 ммоль/л, рН 6,5. 10 г ЭДТА, 1 г ротку, измеренная против холостой пробы на
азида натрия растворяют в 800 мл воды с 20 мл реактивы; С к — концентрация мочевины в ка-
1 моль/л раствора едкого натра. Доводят рН до либровочном растворе, ммоль/л.
6,5 и доливают водой до 1 л. Раствор стабилен, Линейность калибровочной кривой до
хранят в закрытом виде. 9. Салицилат натрия, 75 ммоль/л.
1060 ммоль/л: 170 г салицилата натрия рас- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы т е же, что
творяют в воде и доводят объем до 1 л. Рас- и в предыдущем методе.
твор стабилен, хранят в закрытом виде. 10. Ги-
Л и т е р а т у р а . Richterich R. KHnische
похлорит натрия, раствор: 70 ммоль/л гипохло-
Chomie. Thcorie u n d Praxis. 3 A u F l . — Basel etc.:
рита натрия и 2500 ммоль/л натра едкого. При-
S. Karger, 1971, S. 286—289.
готовление раствора гипохлорита и определение
Автоматический селективный анализатор
активности хлора см. предыдущую методику.
GSA-II фирмы «Greiner» (Швейцария). Методы
1 1 . Уреазный реактив: 200 мг препарата уреазы
исследования с. 1—5.
с активностью 5000 Сигма ед.* растворяют в
1 л буферного раствора. Хорошо перемешивают,
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Отклоне-
профильтровывают. Раствор стабилен в течение
ния от нормального содержания мочевины в сы-
недели при хранении в холодильнике. 12. Сали-
воротке крови зависят от скорости процессов
цилатный реактив — 1060 ммоль/л салицилата
синтеза мочевины и ее выделения. Увеличение
натрия и 2,69 ммоль/л нитропруссида натрия:
содержания мочевины в сыворотке крови явля-
800 мг нитропруссида натрия растворяют в 1 л
ется одним из главных признаков нарушения
раствора салицилата натрия, фильтруют. Стаби-
функции почек. Из фракций остаточного азота
лен в течение недели. раньше всего повышается уровень мочевины,
Материал для исследования. причем уровень мочевины достигает более высо-
Плазма, сыворотка крови. ких цифр по сравнению с другими фракциями
Х о д о п р е д е л е н и я . Реакцию проводят остаточного азота. При почечной недостаточ-
при 37 "С. Опытная проба: к 10 мкл сыворотки ности азот мочевины может составлять до 90 %
добавляют 0,1 мл воды или 154 ммоль/л рас- фракций остаточного азота. Повышение уровня
твора хлорида натрия, 0,5 мл уреазного реакти- мочевины сыворотки крови может носить и вне-
ва. Смесь инкубируют в течение 3—3'/2 мин почечный характер: при потере жидкости (обез-
(время инкубации должно быть постоянным!) воживание, рвота, понос), при усиленном рас-
при температуре 37 °С, затем добавляют 2 мл паде белков (острая желтая атрофия печени,
салицилатного реактива, перемешивают. Через тяжелые заболевания). Уменьшение содержа-
48 с инкубации при 37 °С добавляют 2 мл гипо- ния мочевины в сыворотке крови может наблю-
хлоритного реактива. Через 5—6 мин инкубации даться при заболеваниях печени (паренхима-
при 37 °С измеряют оптическую плотность рас- тозная желтуха, цирроз печени) из-за наруше-
твора на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 10 мм ния синтеза мочевины в печени.
при длине волны 500—560 нм (зеленый свето-
фильтр) против холостой пробы на реактивы.
5.3.2. Креатинин
Окраска стабильна в течение нескольких часов.
Холостую пробу на реактивы ставят так же,
как опытную, но вместо сыворотки берут воду. В синтезе эндогенного креатина принимают
Холостую пробу на сыворотку ставят так же, участие аминокислоты — аргинин, глицин, мети-
как опытную, но уреазный реактив добавляют онин. Креатин при фосфорилировании превра-
после салицилатного реактива перед гипохло- щается в креатинфосфат, из которого образу-
ритом. Измеряют против холостой пробы на ется креатинин (ангидрид креатина). Этот про-
реактивы. цесс в живом организме необратимый.
Калибровочную пробу обрабатывают так же,
как опытную, но вместо сыворотки берут калиб-
ровочный раствор мочевины. Измеряют в тех
же условиях, что и опытную, против холостой
пробы на реактивы.



* Сигма ед. соответствует активности уреа- Креатин и креатинфосфат являются важны-
зы, катализирующей образование 1 мг азота ми азотистыми веществами мышц, участву-
аммиака в течение 5 мин при 20 °С. ющими в химических процессах, связанных

219
с м ы ш е ч н ы м и сокращениями. В сыворотке крови ем о-нитробензальдегида и реакции Сакагучи
содержится в основном к р е а т и н и н . Суточное трудоемки. Ферментативные методы определе-
выделение к р е а т и н и н а ' д л я каждого человека — н и я креатинина с применением ферментов —
величина относительно постоянная, которая за- аминогидролазы, креатинкиназы, пируваткина-
висит г л а в н ы м образом от массы мышечной зы, лактатдегидрогеназы — дорогостоящие и
т к а н и и мало зависит в отличие от мочевины неабсолютно специфичные.
от питания. Содержание креатинина в сыворот Наиболее п р а в и л ь н ы е результаты дает метод
ке крови уменьшается с возрастом. масс-фрагментографии, сочетающий газовую
Методы определения. Большинство методов хроматографию и масс-спектрометрию; данный
определения креатинина основаны на р е а к ц и и п р и н ц и п может быть положен в основу рефе-
Яффе, описанной в 1886 г., в основе которой рентного метода.
лежит реакция ароматических нитровеществ (на- Унификация методов. В качестве у н и ф и ц и -
пример, п и к р и н о в а я кислота) с веществами, со- рованного в 1972 г. утвержден метод, основан-
держащими активную метиленовую (=СН 2 ) ный на реакции Яффе (метод Поппера).
или метиновую (=СН) группы. В крови многие В основу набора Био-Ла-Тест «Креатинин»
хромогены, производные креатинина — глюко- (народное предприятие «Лахема», ЧССР) поло-
циамид, 5-метилглюкоциамид, 5-метилкреати- жена реакция Яффе с осаждением белков сыво-
н и н , а также аскорбиновая кислота, пировино- ротки трихлоруксусной кислотой. Концентрация
градная кислота, ацетон, глюкоза и другие ве- реактивов дана в таком соотношении, которое
щества — реагируют с пикриновой кислотой дает возможность получить величину рН реак-
а н а л о г и ч н о креатинину, что обусловливает низ- ционной смеси 12,4.
кую специфичность методов, основанных на ре- Унифицированный метод по цветной реакции
акции Яффе. По скорости образования окра- Яффе (метод Поппера). П р и н ц и п . Креати-
ш е н н ы х соединений в реакции Яффе различают нин реагирует с п и к р и н о в о й кислотой в щелоч-
три группы веществ: группу очень быстро реа- ной среде с образованием окрашенных соеди-
гирующих хромогенов (30—40 с), креатинин нений.
и группу медленно реагирующих веществ (после Р е а к т и в ы . 1 . Пикриновая кислота, насы-
15—20 м и н ) . щенный раствор. Товарная п и к р и н о в а я кислота
содержит 15—20 % влажности; кислоту не су-
Совершенствование методов, основанных на
шить! Взрывоопасно! В 100 мл воды растворяют
реакции Яффе, направлено главным образом на
2 г пикриновой кислоты при нагревании в горя-
повышение их специфичности. Для повышения
чей бане. После этого раствор оставляют стоять
специфичности рекомендуется применять устра-
на 24 ч, периодически перемешивая. Затем рас-
нение мешающих хромогенов; отделение креати-
твор фильтруют. Реактив стабилен. Хранят в
н и н а от остальных хромогенов с помощью бу-
темной посуде. 2. НС1, 0,1 моль/л. 3. Основной
мажной хроматографии, электрофореза; экс-
калибровочный раствор к р е а т и н и н а , 10ммоль/л:
тракцию креатинина тетрафенилборатом нат-
113,1 мг креатинина доводят до 100млО,1 моль/л
р и я ; сорбенты — бентонит, сефадекс, реактив
раствором HCI. Хранят в холодильнике в посуде
Ллойда.
с притертой пробкой. Для определения креати-
В автоанализаторах различного типа дей-
нина в сыворотке крови рабочий калибровочный
ствия возможно кинетическое измерение креа-
раствор получают разведением основного раст-
т и н и н а в сыворотке крови без предварительного
вора водой в 100 раз; 1 мл раствора содержит
осаждения белков с разделением на три пере-
0,1 ммоль к р е а т и н и н а . 4. Натр едкий, 2,5 моль/л.
ч и с л е н н ы е выше г р у п п ы веществ, дающих поло-
жительную реакцию Яффе. Депротеинизации Материал для исследования.
в таких методах можно избежать путем добавле- Сыворотка крови, моча. В качестве консервантов
н и и детергентов — тритона Х-100 или доде- для мочи можно использовать тимол и толуол.
цилсульфата натрия. Ход о п р е д е л е н и я . О п р е д е л е н и е
На аналитические качества реакции Яффе, к р е а т и н и н а в сыворотке крови:
повышение ее специфичности, чувствительности 2 мл сыворотки смешивают с 6 мл насыщен-
влияет ряд факторов: температура реакции ре- ного раствора пикриновой кислоты. Через 5 м и н
комендуется не ниже 30 "С, разница температур пробирку помещают на 15—20 с в кипящую
в опытной и калибровочных пробах не должна водяную баню, затем центрифугируют. К 4 мл
превышать 3—5 "С. Оптимальное время реакции центрифугата добавляют 0,2 мл 2,5 моль/л рас-
15—20 мин, тем с а м ы м удается избежать влия- твора едкого натра и тщательно смешивают.
ния медленно реагирующих хромогенов. Опти- Иногда после подщелачивания раствор мутнеет
мальной является величина рН в интервале вследствие выпадения фосфатов. В этом слу-
12,3—12,5, что в значительной степени повышает чае раствор еще раз ц е н т р и ф у г и р у ю т . Затем рас-
специфичность реакции и правильность метода. твор доводят до объема 10 мл водой. Через
К проблеме, окончательно еще не решенной, 10 мин (не позже 20 м и н ) измеряют в кювете
относится выбор способа депротеинизации и его с толщиной слоя 2 см при длине волны 500—
влияние на правильность метода. Способами 560 нм (зеленый светофильтр) против холостой
выбора являются осаждение белков трихлор- пробы.
уксусной и пикриновой кислотами. Холостая проба: 3 мл насыщенного раствора
Для определения креатинина значительно п и к р и н о в о й кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раство-
реже применяется реакция с 3,5-динитробензой- ра едкого натра доводят до объема 10 мл водой.
Р а с ч е т производят п о калибровочному
ной кислотой. Образующаяся в ходе реакции
графику.
окраска мало стабильна. Методы с применени-

220
Построение калибровочного К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Определе-
г р а ф и к а : и з рабочего калибровочного рас- ние креатинина проводят для исследования
твора креатинина готовят разведения, как ука- функции почек. Содержание его в сыворотке кро-
зано ниже. ви увеличивается при значительном ухудшении
функции почек. Концентрация креатинина в сы-
воротке крови здоровых людей относительно
постоянна, мало зависит от пола, возраста,
диеты, и связано это с тем, что образование
креатинина как конечного продукта метабо-
лизма креатина в м ы ш ц а х относительно по-
стоянно. Это является важным условием для
исследования клиренса эндогенного креатинина
как меры клубочковой фильтрации.


5.3.3. Мочевая кислота
Мочевая кислота является конечным про-
дуктом распада пуриновых оснований. Обра-
зовавшаяся мочевая кислота выделяется поч-
ками.
Методы определения. Первый метод опреде-
Через 10 мин производят измерения при тех ления мочевой кислоты был предложен О. Folin,
же условиях, что и опытные пробы. Калибровоч- W. Denis в 1912 г. Он основан на способности
ная кривая линейна до 260 мкмоль/л креати- мочевой кислоты восстанавливать фосфорно-
нина. вольфрамовую кислоту с образованием окра-
О п р е д е л е н и е к р е а т и н и н а в мо- шенных соединений. Впоследствии метод под-
ч е . В мерной колбе или цилиндре вместимостью вергался многочисленным модификациям и до
100 мл смешивают 0,5 мл мочи (из суточного настоящего времени остается одним из наиболее
количества) с 3 мл раствора пикриновой кис- распространенных. К другим веществам, кото-
лоты. Смесь тщательно встряхивают и добав- рые восстанавливаются мочевой кислотой и при-
ляют 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра. меняются для ее определения, относятся мышья-
Выдерживают при комнатной температуре в те- ковомолибденовая кислота, железосинероди-
чение 10 мин. Доводят объем до 100 мл водой. стый калий. Однако эти методы не являются
Измеряют на фотометре в кювете с толщиной специфичными. Ряд веществ (цистеин, трипто-
слоя 1 см при длине волны 500—600 нм (зеле- фан, тирозин) вызывают интерференцию в дан-
ный светофильтр) против холостой пробы. ном методе. Повысить специфичность методов
Холостая проба: 3 мл раствора пикриновой можно предварительным применением ионооб-
кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого менной хроматографии.
натра доводят водой до объема 100 мл. Наиболее специфичными являются фермен-
Р а с ч е т производят по формуле при срав- тативные, уриказные методы. Они основаны на
нении с калибровочной пробой. расщеплении мочевой кислоты уриказой до ал-
К а л и б р о в о ч н а я п р о б а . К 0,5 м л лантоина, СО2 и Н 2 О 2 с последующей индика-
основного калибровочного раствора прибавляют торной реакцией. Результаты реакции можно
3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл измерить следующими способами: измерением
2,5 моль/л раствора едкого натра. Далее пробы потребления кислорода, что требует специаль-
обрабатывают так же, как опытные. ной аппаратуры; измерением абсорбции мочевой
кислоты при 293 нм (образовавшийся в резуль-
тате реакции аллантоин не поглощает света при
293 н м ) ; измерением образовавшейся перекиси
водорода. На ферментативном принципе осно-
где К — количество креатинина в суточной моче,
ван флуорометрический метод определения мо-
мкмоль, С к — количество креатинина в калибро-
чевой кислоты, а также потенциометрический
вочной пробе, 50 мкмоль; Еоп — экстинкция
метод с иммобилизованной уриказой.
опытной пробы; Е к — экстинкция калибровоч-
Прямое спектрофотометрическое определе-
ной пробы; а — суточное количество мочи; б —
ние мочевой кислоты в сыворотке крови основано
количество мочи, взятой для анализа.
на измерении поглощения, обусловленного моче-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В сыво-
вой кислотой при 282—295 нм. Максимум погло-
ротке крови: у женщин 0,044—0,088 ммоль/л,
щения зависит от рН среды. Наиболее рас-
или 44—88 мкмоль/л (0,5—1 мг/100 м л ) ; у
пространенным методом определения мочевой
мужчин 0,044—0,1 ммоль/л, или 44—
кислоты в практических лабораториях явля-
100 мкмоль/л. Содержание креатинина в суточ-
ется фосфорновольфрамовый метод, который
ной моче 4,4—17,7 ммоль/сут, или 0,5—2 г/сут.
утвержден в 1979 г. в качестве унифицирован-
Воспроизводимость. Коэффициен-
ного.
ты в а р и а ц и и составляют 5—6 %.
Унифицированный метод по реакции с фос-
Л и т е р а т у р а . Popper H., Mandel F., форновольфрамовым реактивом. П р и н ц и п .
Mayer H.— Biochem. Z., 1937, vol., 291, p. 354. Мочевая кислота восстанавливает фосфорно-

221
вольфрамовый реактив с образованием соеди- Калибровочную пробу ставят и измеряют
нения голубого цвета. так же, как опытную, но вместо фильтрата берут
Р е а к т и в ы . 1. Серная кислота, 0,35 моль/л: 3 мл рабочего калибровочного раствора.
к 200 мл воды добавляют 10 мл концентрирован-
ной серной кислоты отн. плотности 1,84 и дово- Концентрация мочевой кислоты, ммоль/л =
дят объем водой до 500 мл. 2. Натрий вольфра-
мовокислый двухводный (Na 2 WO 4 -2H 2 O) ч.д.а.,
100 г/л: растворяют 50 г вольфрамовокислого
натрия в небольшом количестве воды и доводят где ЕОП — экстинкция опытной пробы; ЕК —
объем до 500 мл. 3. Натрия карбонат ч.д.а., экстинкция калибровочной пробы; С к — кон-
103 г/л: растворяют 51,5 г н а т р и я карбоната в центрация рабочего калибровочного раствора,
небольшом количестве воды и доводят объем 0,03 ммоль/л; 10 — пересчет на объем сыворотки
до 500 мл. 4. Ортофосфорная кислота, 85 %, (в опытную пробу берут 0,3 мл, т.е. в 10 раз
ч.д.а. 5. Лития сульфат (Li 2 SO 4 -Н 2 O) ч.д.а. меньше, чем в калибровочную пробу).
6. Лития карбонат (Li 2 СОз) ч.д.а. 7. Фосфор- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Мужчины:
новольфрамовый реактив; в круглодонную колбу
0,24—0,50 ммоль/л, или 4,0—8,5 мг/100 мл;
вместимостью 1,5 л вносят 40 г вольфрамово- женщины: 0,16—0,4 ммоль/л, или 2,8—
кислого натрия и 300 мл воды. Добавляют 32 мл 7,5 мг/100 мл.
85 % ортофосфорной кислоты и несколько стек- В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-
лянных бусинок. Осторожно кипятят в течение ты вариации находятся в пределах 3—5 %.
2 ч на песочной или глицериновой бане с обрат-
Л и т е р а т у р а . Henry R. J., Sobel С.,
ным холодильником. Охлаждают до комнатной
Kim J. Amer. J. din. Pathol., 1957, vol. 28, p. 152.
тепературы и доливают водой до 1 л. Добавляют
32 г сульфата лития. Раствор стабилен при хра-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Повыше-
нении в холодильнике. 8. Мочевая кислота, имп. ние содержания мочевой кислоты в крови наблю-
9. Формалин, не менее 37,5 %, фарм. 10. Основ- дается при нарушении ее выделения из орга-
ной калибровочный раствор мочевой кислоты, низма (заболевания почек, ацидоз, токсикоз
6 ммоль/л: растворяют 0,6 г карбоната лития беременности); повышенном образовании пури-
в 150 мл воды, фильтруют и нагревают до 60 °С. нов (некоторые гематологические заболевания,
Взвешивают 1,017 г мочевой кислоты, вносят в прием пищи, богатой п у р и н а м и ) .
предварительно нагретую колбу вместимостью
1 л, вливают теплый раствор карбоната лития
и быстро встряхивают. После растворения мо-
5.3.4. Аминокислоты и пептиды
чевой кислоты колбу охлаждают до комнатной
температуры, добавляют 20 мл раствора фор-
малина, наливают 300—350 мл воды. Добав- В крови содержатся свободные аминокис-
лоты экзогенного и эндогенного происхождения.
ляют несколько капель раствора метилового
Концентрация их в сыворотке крови невелика.
оранжевого, затем встряхивают, медленно до-
С диагностической целью определяют как от-
бавляют 20—22 мл 0,35 моль/л серной кислоты
дельные аминокислоты, так и общий аминный
до изменения цвета в розовый. Доливают колбу
азот. Наибольшее клиническое значение имеет
до метки водой. Раствор стабилен при хранении
определение таких аминокислот, как фенилала-
в холодильнике в посуде из темного стекла;
нин, оксипролин, цитруллин. Для определения
1 мл раствора содержит 0,006 ммоль мочевой
свободных аминокислот применяют: хромато-
кислоты. 1 1 . Рабочий калибровочный раствор
мочевой кислоты, 0,03 ммоль/л: 1 мл основного графию на бумаге, ионообменную хроматогра-
калибровочного раствора доводят до 200 мл фию и фотометрические методы. Чаще всего оп-
ределение аминокислот проводят на аминокис-
водой. Стабилен в течение 2 нед при хранении
лотных анализаторах в соответствии с прилагае-
в холодильнике.
мой к прибору инструкцией.
Материал для исследования.
Кровь содержит также в небольшом коли-
Сыворотка, свободная от гемолиза.
честве полипептиды, которые поступают из ки-
Х о д о п р е д е л е н и я . Опытная проба:
шечника при переваривании белков и образуют-
к 8 мл воды добавляют 1 мл сыворотки, 0,5 мл
ся эндогенно как продукты распада белков тка-
0,35 моль/л серной кислоты и перемешивают.
ней.
Затем добавляют 0,5 мл раствора вольфрамо-
Многие из полипептидов, циркулирующие в
вокислого натрия и тщательно перемешивают.
биологических жидкостях, относятся к биологи-
Через 5—10 мин фильтруют. К 3 мл фильтрата
чески активным веществам, и их определение
добавляют 1,5 мл раствора натрия карбоната,
имеет большое клиническое значение. Методы
перемешивают. Затем добавляют 1 мл фосфор-
их определения будут описаны соответственно
новольфрамового реактива, перемешивают, пе-
в других главах.
реворачивая пробирку. Через 30 мин измеряют
в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны Хроматографическое разделение на бумаге
по Боде—Гири. П р и н ц и п . В основе разде-
590—700 нм (красный светофильтр) против хо-
лостой пробы. Холостую пробу ставят так же, ления лежат различия в степени адсорбции
аминокислот и растворимости их в соответст-
как опытную, но вместо фильтрата берут 3 мл
вующем растворителе. После разделения амино-
воды.
кислоты с нингидрином в слабокислой среде
Р а с ч е т ведут по формуле при сравнении
дают синее окрашивание с последующим прев-
с калибровочной пробой.

222
ращением полученного синего производного в р и ф у ж н у ю пробирку с притертой пробкой и
стабильное медное производное оранжево-крас- экстрагируют 3 раза (каждый раз в течение
ного цвета, имеющее максимум пoглощения при 1 ч) 8 мл солянокислого ацетона. Нераствори-
530 нм. Метод позволяет определить все амино- мый осадок отделяют центрифугированием.
кислоты, за исключением пролина и оксипро- Надосадочную жидкость (всего 24 мл) выпари-
лина. вают досуха в фарфоровой чашке на водяной
Р е а к т и в ы . 1. н-Бутиловый спирт. 2. Ук- бане при 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл
сусная кислота ледяная. 3. Смесь бутилового воды и и обрабатывают 2 мл эфира для удаления
спирта, уксусной кислоты и воды (в объемных липидов. После отделения эфира водный рас-
соотношениях 4 : 1 : 5): смешивают в мерном ци- твор помещают в фарфоровую чашку и сгущают
линдре 40 мл бутилового спирта, 10 мл ледяной досуха. Сухой остаток растворяют в 0,2 мл
уксусной кислоты и 50 мл воды. Смесь переносят воды. На хроматограмму наносят 40 мкл эк-
в делительную воронку. После расслаивания стракта порциями по 5 мкл.
берут верхний слой и используют его в качестве П о л у ч е н и е одномерных хрома-
подвижного растворителя. Нижний слой исполь- т о г р а м м с ы в о р о т к и к р о в и . Н а лист
зуют для насыщения хроматографической ка- бумаги, промытой раствором 8-оксихинолина,
меры. 4. Смесь бутилового спирта, уксусной кис- наносят в 2 точках по 40 мкл полученного
лоты и воды (в объемных отношениях 40: 15:5). экстракта сыворотки крови. В третью точку на-
Смесь используют в качестве подвижного раст- носят 5 мкл 0,01 моль/л раствора аминокислот
ворителя. 5. Ацетон. 6. Нингидрин, раствор «свидетелей». В качестве растворителя исполь-
5 г/л в ацетоне. Хранят в темной склянке. Пе- зуются смеси: н-бутанол, уксусная кислота, вода
ред определением смешивают 95 частей 5 г/л (в соотношении 4 : 1 : 5 ) и н-бутанол, уксусная
раствора нингидрина в ацетоне с 1 частью ледя- кислота, вода (40: 1 5 : 5 ) . Наиболее четкое и
ной уксусной кислоты и 4 частями воды. 7. Эти- полное разделение аминокислот сыворотки кро-
ловый спирт 96 %. 8. Меди сульфат 5-водный, ви достигается при трехкратном пропускании
насыщенный раствор в 75 % этиловом спирте. обеих смесей (в этом случае после каждого про-
Перед употреблением раствор фильтруют. пускания растворителя бумагу высушивают на
9. Набор аминокислот, растворы 0,01 моль/л. воздухе и снова помещают в хроматографи-
10. НС1 концентрированная. 11. Солянокислый ческую камеру). После последнего пропускания
растворителя хроматограмму высушивают при
ацетон: 1 мл концентрированной НС1 сме-
шивают с 99 мл ацетона. 12. Диэтиловый комнатной температуре в течение 2 ч. Следует
придерживаться одного и того же времени
эфир.
С п е ц и а л ь н о е оборудование. 1. сушки хроматограмм, что обеспечивает луч-
Хроматографические камеры. В качестве хрома- шее совпадение результатов отдельных опре-
тографической камеры могут быть использованы делений.
высокие стеклянные банки с пришлифованной Х о д и с с л е д о в а н и я . Хроматограмму,
стеклянной крышкой диаметром 25 см и больше, освобожденную путем высушивания от избытка
высотой 50—60 см. 2. Хроматографические кю- растворителя, погружают на несколько секунд
веты. Для получения нисходящих хроматограмм в 5 г/л раствор нингидрина в ацетоне, просуши-
растворитель наливают в хроматографическую вают в течение нескольких минут на воздухе и
кювету, представляющую собой трубку диамет- прогревают в течение 10 мин при 50 °С в сушиль-
ром 2—4 см и имеющую по длине щель шириной ном шкафу для развития окраски. Далее хро-
3—6 мм. Трубка имеет оправу из стеклянных матограммы высушивают в течение суток на воз-
палочек, через которые перекидывается бумага. духе. Затем вырезают участки хроматограмм с
3. Бумага. Для разделения аминокислот исполь- фиолетовыми пятнами аминокислот, разрезают
зуют хроматографическую фильтровальную бу- их на мелкие кусочки и помещают в пробирки
магу марки «быстрая» (Б). Для количествен- с притертыми пробками. В пробирку добавляют
ного определения аминокислот может быть ис- 2,5 мл насыщенного раствора сульфата меди
пользована только бумага, освобожденная от в этиловом спирте. При этом фиолетовая окрас-
катионов металлов, мешающих точному коли- ка аминокислот переходит в оранжево-красную
чественному определению аминокислот на хро- в результате образования комплексного соеди-
матограммах. Для удаления катионов металлов нения с медью, которое растворяется в 75 %
из бумаги последнюю обрабатывают раствором этаноле и экстрагируется из бумаги. Пробирки
8-оксихинолина или трилона Б (динатриевая закрывают пробками и содержимое их тща-
соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). тельно перемешивают для полноты экстракции
Материал для исследования. окрашенного продукта. Экстракцию продол-
Получение концентрированного безбелкового жают в течение часа в темноте при комнатной
экстракта сыворотки крови: предварительная температуре. Одновременно с пятнами амино-
подготовка сыворотки крови для количествен- кислот вырезают из бумаги контрольные участ-
ного определения аминокислот сводится к полу- ки, равные по площади опытным, и обрабаты-
чению экстракта сыворотки крови, свободного вают их точно таким же образом. Интенсивность
от белков и солей, мешающих хроматографи- окраски измеряют на фотоколориметре при
ческому разделению аминокислот, и сгущению 500—530 нм (зеленый светофильтр) в кюветах
безбелкового экстракта. Для этого порошок, с толщиной слоя 5 мм против контрольной
полученный из 2 мл сыворотки, высушенной пробы.
лиофилизацией или в вакуумном эксикаторе над Р а с ч е т аминокислот проводят по калиб-
безводным хлоридом кальция, помещают в цент- ровочным графикам, которые строят по калибро-

223
вечным растворам аминокислот. Дальнейший К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Содержа-
ние аминокислот в крови увеличивается при
расчет проводят по формуле:
экссудативном диатезе, заболеваниях печени,
фенилкетонурии, опухолях.


5.3.5. Индикан
где А — количество аминокислоты, мгк/л сыво-
ротки; а — количество аминокислоты в пробе,
найденное по калибровочному графику, мкг; Индикан представляет собой калиевую соль
в — количество экстракта, взятое для хромато- индоксилсерной кислоты.
графирования, мкл; с — общее количество экст- Методы определения. В практических лабо-
ракта, мкл; d — количество сыворотки (мл), раториях чаще применяют качественное иссле-
соответствующее общему количеству экстракта. дование (обнаружение) индикана в моче. Наи-
Построение калибровочных более распространенной является проба Обер-
г р а ф и к о в . Для построения калибровочных мейера, основанная на образовании синего и
графиков готовят растворы аминокислот красного индиго. Среди других исследований
0,01 моль/л, содержащие в 1 мкл 0,01 мкмоль применяют пробы с тимолом, а-нафтолом.
каждой аминокислоты. На бумагу наносят 5; 10; Проба Обермейера. П р и н ц и п . Индикан
15 и 20 мкл калибровочного раствора амино- превращают в индоксил, в результате окисления
кислот порциями по 5 мкл. Каждая точка гра- которого образуется синее индиго (индиготин)
фика будет соответствовать 0,05; 0,10; 0,15; 0,20 и красное индиго (индигорубин).
мкмоль аминокислоты. Линейная зависимость Р е а к т и в ы . 1. Свинца ацетат, 100 г/л.
между концентрацией вещества и интенсив- 2. Железо хлорное. 3. НС1 концентрированная,
ностью окраски сохраняется при концентрациях отн. плотность 1,19. 4. Реактив Обермейера:
от 0,025 до 0,2 мкмоль для каждой аминокис- 0,2—0,4 г хлорного железа и 100 мл НС1 кон-
лоты. центрированной. 5. Хлороформ.
Разделение смеси калибровочных растворов Х о д о б н а р у ж е н и я . Несколько милли-
аминокислот проводят п р и строгом соблюдении литров мочи смешивают с раствором ацетата
всех условий хроматографирования и определе- свинца в соотношении по объему 1 : 10, фильтру-
н и я о п и с а н н ы х выше. На основании найденной ют. Смешивают 1—2 мл фильтрата с реактивом
величины оптической плотности и взятых кон- Обермейера в соотношении 1 : 1 , прибавляют
центраций аминокислот строят калибровочные 0,5—1 мл хлороформа.
графики. Оценка результатов. Если слой
Большинство аминокислот, за исключением хлороформа окрашивается в синий или красный
фенилаланина, аспарагиновой кислоты, тиро- цвет, проба положительная.
зина, имеют очень близкие величины молярной Н о р м а . Индикан содержится в моче в не-
оптической плотности, поэтому для их количест- значительном количестве и не обнаруживается
венного определения можно пользоваться об- качественными пробами.
щим графиком.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы в сыворот-
П р и м е ч а н и е . При н а л и ч и и солей йода
ке крови по данным различных авторов (даны
в моче образуется красно-фиолетовая окрас-
пределы колебаний в м г / л ) : л е й ц и н — 12—19;
ка хлороформа, которая исчезает после при-
фенил-аланин — 10—28; валин — 13—29; тиро-
бавления раствора тиосульфата натрия.
зин — 4—20; а л а н и н — 18—50; глутаминовая
кислота — 7—49; глицин — 10—39; серии —
4—18; а с п а р а г и н о в а я кислота — 0,3—9,8; цис- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Увеличе-
тин -+- цистеин — 15—38; метионин — 3,8; трип- ние содержания индикана в моче происходит
тофан— 1 1 , 1 ; гистидин — 11—30; орнитин — при заболеваниях, связанных с усилением рас-
7,2; лизин — 8—30; аргинин — 8—15; цитрул- пада белка, или при интенсивном гниении бел-
ковых веществ в кишечнике.
лин — 5.


5.4. П И Г М Е Н Т Ы
незначительное их количество. Основное содер-
Пигменты, или окрашенные соединения не-
ж а н и е порфиринов приходится на долю гемо-
белкового характера, могут находиться в орга-
протеидов. Гем представляет собой протопорфи-
низме человека в свободном и связанном состоя-
рин, связанный с двухвалентным железом.
нии.
Желчными п и г м е н т а м и называют продукты
Основными структурными компонентами
распада гемоглобина и других хромопротеидов.
пигментов являются пиррольные кольца, связан-
К желчным пигментам относятся билирубины
ные между собой метиновыми г р у п п а м и
и уробилиноиды. При распаде гемоглобина
(= СН ). С диагностической целью в био-
разрывается порфириновое кольцо тема, связь
логических жидкостях определяют п и г м е н т ы
между ним, железом и белковой частью молеку-
красного цвета — порфирины и желчные пиг-
лы гемоглобина нарушается, образуется били-
менты. Биосинтез иорфиринов происходит п р а к -
вердин, который восстанавливается до основ-
тически в каждой клетке живого о р г а н и з м а ,
ного желчного пигмента — билирубина.
однако в свободном состоянии находится очень

224
ференция желтых небилирубиновых пигментов.
5.4.1. Билирубин
Определение билирубина после окисления осно-
вано на образовании пигментов, имеющих раз-
Б и л и р у б и н — желто-красный пигмент; пред-
л и ч н у ю окраску. Методы этой г р у п п ы отли-
ставляет собой л и н е й н ы й тетрапиррол. Большая
чаются низкой чувствительностью, низкой точ-
часть его в организме образуется в ретикулоэн-
дотелиальной системе печени и селезенки при ностью и позволяют определить лишь общий
билирубин.
распаде гемоглобина, миоглобина, цитохромов.
Диазометоды основаны на взаимодействии
Образовавшийся в клетках ретикулоэндотелия
билирубина с диазотированной сульфаниловой
билирубин плохо растворим в воде, является
кислотой с образованием азопигментов, этими
токсическим веществом, медленно реагирует с
методами определяются количественно две ос-
диазореактивом, что требует добавления аксе-
лератора, поэтому он называется непрямореаги- новные фракции билирубина. Связанный били-
рубин дает быструю (прямую) реакцию азо-
рующим. При поступлении его с током крови в
сочетания. Реакция несвязанного билирубина
печень в гепатоцитах происходит его обезврежи-
значительно медленнее. Ее ускоряют вещества-
вание путем присоединения глюкуроновой кис-
акселераторы: гидроокись натрия, желчные кис-
лоты. Диглюкуронид б и л и р у б и н а в отличие от
лоты и их соли, некоторые органические кислоты
свободного билирубина — вещество индиф-
и их соли, мочевина, кофеин, ацетамид, смесь
ферентное, растворим в воде и быстро реагирует
НС1 и диметилсульфоксида, смесь антипирина,
с диазореактивом, т. е. является прямореаги-
рующим. Конъюгирование билирубина в гепа- мочевины и ацетата натрия, этиленгликоль и
другие вещества. Акселераторы освобождают
тоците с образованием диглюкуронида и неболь-
билирубин из белковых комплексов и тем самым
шого количества моноглюкуронида протекает
ускоряют реакцию азосочетания. Связанный би-
с помощью фермента уридиндифосфоглюкуро-
лирубин соединен с альбумином значительно
нилтрансферазы (УДФГА). Гепатоциты обла-
дают также способностью удалять связанный менее прочно, чем несвязанный, что обусловли-
вает характер реакции.
с глюкуроновой кислотой билирубин. Это обус-
ловлено главным образом свойствами мембраны Азокраситель, образовавшийся при азосоче-
гепатоцита и наличием в цитоплазме гепатоцита тании билирубина с диазотированной сульфани-
специального белка (лигандина). Выделение би- ловой кислотой, ведет себя как кислотно-основ-
лирубина происходит с желчью, вместе с ной индикатор с несколькими цветными пере-
желчью билирубин попадает в пищеваритель- ходами. В сильно кислой среде раствор азокра-
ный тракт, где происходит его дальнейшее прев- сителя окрашен в фиолетовый цвет, в слабо-
ращение. В сыворотке крови содержится били- кислой и слабощелочной среде — в розовый,
рубин, связанный с глюкуроновой кислотой, или в сильно щелочной среде — в синий. Опреде-
прямореагирующий (диглюкуронид и моноглю- ление билирубина в сильно щелочной среде
куронид); и билирубин, не с в я з а н н ы й с глюку- значительно повышает чувствительность метода.
роновой кислотой, или непрямореагирующий. Азобилирубин обладает свойствами комплексо-
Обе фракции билирубина в сыворотке крови образования, что повышает интенсивность
могут находиться в свободной форме или в виде окраски. На практике для определения билиру-
комплексов, соединенных с фосфолипидами или бина можно пользоваться азокомплексами
альбумином (связывающая способность альбу- с медью и цинком.
мина сыворотки составляет 2 моля билирубина Первый азобилирубиновый метод предложен
на 1 моль альбумина). V a n den Berg в 1916 г. В оригинальном методе
Комплексы с в я з а н н о г о б и л и р у б и н а с фосфо- Ван ден Берга не применяются акселераторы;
содержание фракций билирубина количественно
липидами могут встречаться в сыворотке крови
при длительной закупорке желчных путей. Их этим методом не определяется. Наиболее рас-
можно экстрагировать из сыворотки эфиром пространенными и п р и е м л е м ы м и являются диа-
зометоды с применением в качестве акселера-
(эфирорастворимый б и л и р у б и н ) . Свойства свя-
занного билирубина обусловливают появление торных веществ смеси кофеина с бензоатом
желтухи при значительно более низких цифрах натрия и ацетатом натрия, а также метанола.
Принцип первого способа положен в основу ме-
его в крови по сравнению с концентрацией несвя-
тода Ендрассика—Грофа, принцип второго —
занного б и л и р у б и н а . У новорожденного актив-
в основу метода Маллоя—Евелина. В настоящее
ность фермента УДФГА во много раз ниже, чем
у взрослых, ниже и уровень белка лигандина, время в автоанализаторах применяется кинети-
ческое определение билирубина, основанное на
что является причиной физиологической жел-
различных кинетических свойствах связанного
тухи новорожденных.
и несвязанного билирубина.
Методы определения билирубина. Для ис-
Оптимизация условий определения и унифи-
следования общего билирубина и его фракций
кация методов. Метод Ендрассика—Грофа ут-
применяются п р я м ы е спектрофотометрические
вержден приказом Министерства здравоохране-
методы, фотометрические методы после окисле-
ния СССР в 1972 г. в качестве унифицирован-
ния, диазометоды, электрохимические методы с
ного. Д а н н ы й п р и н ц и п положен в основу боль-
использованием платинового и ртутного элект-
шинства коммерческих наборов реактивов, в
родов, хроматографическое разделение отдель-
частности набора реактивов, выпускаемого «Ла-
ных фракций билирубина. Прямые спектрофото-
хема» (ЧССР). Концентрация сульфаниловой
метрические методы основаны на измерении
кислоты не оказывает заметного влияния на
абсорбции билирубина при 440—460 нм. Глав-
скорость реакции диазосочетания и на чувстви-
н ы м источником ошибок в них является интер-

225
8 п/р В. В. Меньшикова
Сыворотка крови, свободная от гемолиза. Сы-
тельность метода. Однако молярное соотноше-
воротку хранят в холодном темном месте не бо-
ние сульфаниловой кислоты к нитриту в реак-
лее 12 ч.
ционной смеси не должно быть менее 3 : 1. В на-
Х о д о п р е д е л е н и я . В 3 пробирки
боре реактивов Био-Ла-Тест («Лахема», ЧССР)
(2 опытные пробы и холостая) вводят реактивы,
такое соотношение равно 5 : 1; в унифицирован-
как указано в схеме.
ном методе 14 : 1. Избыток сульфаниловой кис-
лоты не влияет на азокраситель. Наибольшая
чувствительность достигается при рН 5,4. Сни-
Опытная проба, млХоло-
жение концентрации кофеина в 10 раз не ока-
стая
зывает существенного в л и я н и я на результаты. общий связан-
Ингредиенты проба,
били- ный били-
Унифицированный метод по диазореакции мл
рубин рубин
в присутствии акселератора (метод Ендрас-
сика—Клеггорна—Грофа). П р и н ц и п . Под
0,5
Сыворотка 0,5 0,5
воздействием НС1 разрывается тетрапирроловая
1,75
Кофеиновый реактив —
1,75
связь билирубина и образуются два дипиррола,
Раствор хлорида
которые диазотируются диазобензосульфоновой
— 1,75 0,25
натрия
кислотой с образованием розово-фиолетового
0,25
Диазосмесь 0,25
азобилирубина. Связанный билирубин реаги- "
рует быстро, несвязанный билирубин реагирует
после добавления кофеинового реактива.
Р е а к т и в ы . 1. Кофеин, фарм. 2. Натрия
Для определения связанного билирубина из-
бензоат ч. 3. Натрия ацетат 3-водный ч.д.а. или
мерение проводят спустя 5—10 мин после добав-
х.ч. 4. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г
ления диазосмеси, так как при длительном стоя-
бензоата натрия, 12,5 г ацетата натрия раство-
нии в реакцию вступает несвязанный билиру-
ряют в 90 мл воды, нагревают до 50—60 °С,
бин. Для определения общего билирубина пробу
хорошо перемешивают. После охлаждения до-
для развития окраски оставляют стоять 20 мин,
водят водой до 100 мл. Раствор стабилен в тече-
после чего измеряют на фотометре. При даль-
ние 2 нед. 5. Натрия хлорид ч.д.а. или х.ч.,
нейшем стоянии окраска не изменяется.
154 ммоль/л (изотонический раствор): 0,9 г хло-
Измерение проводят при длине волны 500—
рида натрия помещают в мерную колбу вмести-
560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщи-
мостью 100 мл и доводят до метки водой. 6. НС1
ной слоя 0,5 см против воды. Из показателей,
концентрированная ч.д.а. или х.ч. 7. Сульфани-
полученных при измерении общего и связанного
ловая кислота ч.д.а. 8. Диазосмесь. Диазоре-
билирубина, вычитают показатель холостой
актив I: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют
пробы.
при нагревании в 300—400 мл воды, прибавляют
Р а с ч е т производят п о калибровочному
15 мл концентрированной НС1. Если сульфани-
графику. Находят содержание общего и связан-
ловая кислота полностью не растворяется, колбу
ного билирубина.
помещают в теплую воду и помешивают. Только
Построение калибровочного
после растворения и охлаждения раствор доли-
г р а ф и к а . Способ 1 — Шелонга—Венде с ис-
вают водой до I л. Реактив стабилен при хране-
пользованием стабилизирующего свойства бел-
нии в посуде из темного стекла. Диазореактив
ка сыворотки крови. Основной раствор билиру-
II: натрия нитрит ч.д.а. или х.ч., 5 г/л (0,07
бина: в колбе вместимостью 50 мл растворяют
моль/л): 0,5 г нитрита натрия помещают в мер-
40 мг билирубина в 30—35 мл 0,1 моль/л рас-
ную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой
твора карбоната натрия Na 2 CO 3 . Хорошо взбал-
до метки. Реактив стабилен в течение 2—3 нед
тывают, не допуская образования пузырьков.
п р и хранении в посуде из темного стекла. Перед
работой смешивают 10 мл диазореактива I и Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором
Na 2 CO 3 и несколько раз перемешивают. Раствор
0,3 мл диазореактива П. 9. Билирубин для по-
строения калибровочного графика, 800 мг/л, стоек только в течение 10 мин от начала приго-
товления. В дальнейшем происходит окисление
или 1368 мкмоль/л. Коммерческие препараты
кристаллического билирубина содержат разные билирубина.
примеси, которые могут мешать реакции азосо- Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл све-
жей негемолизированной сыворотки здорового
четания. Рекомендуется использовать набор
Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон» (ЧССР), со- человека добавляют 2 мл свежеприготовленного
держащий билирубин высокой степени чистоты основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л
раствора уксусной кислоты. Хорошо перемеши-
с коэффициентом молярной экстинкции не менее
6,05-10 4 л - м о л ь - 1 •см при 453 нм и растворе- вают. При этом выделяются пузырьки углекис-
лого газа. Рабочий раствор стоек в течение не-
нии в хлороформе. Растворы билирубина не-
скольких дней. Этот раствор содержит точно на
стойкие, поэтому их готовят с добавлением белка
100 мг/л, или 171 мкмоль/л, билирубина больше,
в качестве стабилизатора. Коммерческие препа-
раты билирубина не связаны с глюкуроновой чем сыворотка, взятая для приготовления рас-
твора. Чтобы исключить при расчетах количество
кислотой. 10. Натрия карбонат, 0,1 моль/л:
билирубина, содержащегося в этой сыворотке,
10,6 г безводного Nа 2 СОз растворяют и доводят
при измерении на фотометре из величин эксти-
до 1 л водой. 1 1 . Уксусная кислота, 4 моль/л:
нкции калибровочных проб вычитают величины
25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до
экстинкции соответствующих разведений ком-
100 мл водой.
пенсационной жидкости.
Материал для исследования.

226
Для приготовления компенсационной жид- Р е а к т и в ы . 1. Однозамещенный фосфат
кости смешивают 13,9 мл той же сыворотки, ко- н а т р и я (NaH 2 PO 4 ), 0,2 моль/л. 2. Натр едкий,
торая использовалась для приготовления калиб- 5 моль/л. 3. Фосфатный буфер рН 5,0; 0,2 моль/л
ровочного раствора билирубина, 2 мл 0,1 моль/л раствор NaH 2 PO 4 доводят до необходимого рН
раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствором едкого натра 5 моль/л. 4. Этилацетат.
раствора уксусной кислоты. Для построения 5. п-Бутиловый спирт. 6. Билирубин-эталон лио-
калибровочного графика готовят ряд разведе- филизированный.
н и й с различным содержанием билирубина. Материал для исследования.
К полученным разведениям прибавляют по Сыворотка крови, свободная от гемолиза.
1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазо- Х о д о п р е д е л е н и я . В 2 центрифужные
смеси. При появлении помутнения можно до- пробирки вносят по 0,2 мл сыворотки. В первую
бавить по 3 капли 30 % раствора едкого натра. приливают 1,8 мл фосфатного буфера и 3 мл
Измерение проводят при тех же условиях, что и этилацетата, во вторую — 2,2 мл фосфатного
в опытных пробах, через 20 мин. буфера и 3 мл бутанола. Пробирки закрывают,
Из компенсационной жидкости готовят раз- энергично встряхивают и центрифугируют 5—
ведения, аналогичные калибровочным (как ука- 10 мин, после чего все три образовавшихся слоя
зано ниже) и далее обрабатывают их так же, переносят осторожно в кюветы спектрофото-
как калибровочные пробы. метра для измерения. Этилацетатный экстракт
содержит свободный билирубин, бутаноловый
экстракт — свободный билирубин и моноглюку-
ронид, буферный водный слой — диглюкуронид.
Каждую пробу измеряют при 450 и 575 нм (из-
мерение при 575 нм проводят для исключения
поглощения за счет гемоглобина).
Из значения экстинкции при 450 нм вычи-
тают значение экстинкции при 575 нм. Даль-
нейший расчет производят по калибровочной
кривой. Для построения калибровочной кривой
можно использовать «Билирубин-эталон лиофи-
лизированный» («Лахема», ЧССР), из которого
готовят рабочие калибровочные растворы раз-
ной концентрации согласно инструкции. Из каж-
дого раствора берут по 0,2 мл и добавляют соот-
ветствующий растворитель (этилацетат, п-бута-
нол, фосфатный буфер). Калибровочные пробы
обрабатывают и измеряют при тех же условиях,
С п о с о б I I . Калибровочный график стро- что опытные пробы.
ится по готовому набору реактивов «Билирубин- О ц е н к а р е з у л ь т а т о в . Непрямореа-
эталон» («Лахема», ЧССР). гирующий билирубин и моноглюкуронид били-
Набор Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон» рубина определяют в бутаноловом экстракте;
включает: 1) билирубин лиофилизированный в этилацетатном экстракте определяют непрямо-
(точная концентрация билирубина приведена на реагирующий билирубин; в фосфорно-буферном
этикетке флакона); 2) альбумин лиофилизиро- слое — диглюкуронид билирубина; моноглюку-
в а н н ы й . Способ приготовления растворов били- ронид билирубина определяют по разнице содер-
рубина указан в инструкции к набору. жания билирубина в бутаноловом и этилацетат-
Калибровочная кривая л и н е й к а до 170 ном экстрактах.
мкмоль/л. Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы т е же, что в
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В сыво- унифицированном методе.
ротке крови содержится 8,5—20,5 мкмоль/л об- Л и т е р а т у р а . Eberlein W. R. Pediatrics,
щего билирубина (0,5—1,2 мг/100 мл), из ко- 1960, vol. 25, p. 878.
торого 75 % приходится на долю свободного К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Причины,
(непрямореагирующего) билирубина. На пра- .вызывающие гипербилирубинемию, различны.
вильность метода влияет способ построения ка- Желтуха появляется, когда уровень билирубина
либровочной кривой. Ряд веществ — гидрокор- в крови превышает 43 мкмоль/л (2,5 мг/100 мл).
тизон, андрогены, эритромицин, глюкокорти- Предложены различные классификации патоло-
коиды, фенобарбитал, аскорбиновая кислота — гических желтух, при которых в зависимости от
вызывают интерференцию. механизма их возникновения повышаются раз-
личные фракции билирубина.
Л и т е р а т у р а . Jendrassik L., Cleghorn R.
Заболевания, вызывающие повышение свя-
Biochem'J., 1936, vol. 289, p. 1.
занного прямореагирующего билирубина: ви-
Спектрофотометрический метод определения русный гепатит, цирроз печени, опухоль печени
общего билирубина и его фракций (метод Эбер- и метастазы, жировая дистрофия, синдром Ду-
лейна). П р и н ц и п . Измерение характерного бина—Джонсона.
для билирубина максимума абсорбции при Заболевания, вызывающие повышение не-
450 нм после фракционирования билирубина в связанного непрямореагирующего билирубина:
фосфатном буфере, этилацетате и бутиловом гемолитическая анемия, пернициозная а н е м и я ;
спирте. несвязанный билирубин бывает также повышен

227
флюоресценции в ультрафиолетовом свете ха-
при желтухе новорожденных, болезни Жиль-
бера, синдроме Криглера—Найяра, синдроме рактерны для н а л и ч и я порфиринов. В норме
Ротора. с мочой выделяется их немного — до 30 мкг/сут.
При механической желтухе связанный с глю-
куроновой кислотой билирубин увеличивается
5.4.3. Порфобилиноген
в основном за счет билирубиндиглюкуронида,
при паренхиматозной желтухе — билирубин-
моноглюкуронида. Прямореагирующий билиру- Методы определения порфобилиногена (ПБГ)
бин при гемолитической желтухе новорожден- и дельта-аминолевулиновой кислоты в моче ос-
нованы на их разделении с помощью адсорбции
ных состоит г л а в н ы м образом из билирубинмо-
на колонках с ионообменной смолой, окисью
ноглюкуронида.
алюминия, каменным углем и др. После разде-
5.4.2. Порфирины ления для определения дельта-аминолевулино-
вой кислоты применяют метод, основанный на
реакции с реактивом Эрлиха — п-диметил-
Порфирины представляют собой азотистые
аминобензальдегидом или на модифицирован-
пигменты пиррольного ряда, обладающие общей
ной реакции Яффе с щелочным пикратом.
основной структурой — порфином, который со-
стоит из 4 пиррольных колец. В зависимости от Для определения порфобилиногена в моче
применяют прямой метод с реактивом Эрлиха
того, к а к и м и радикалами замещены атомы водо-
рода в порфине, образуются различные типы и непрямой метод после выделения порфобили-
порфиринов — уропорфирины, копропорфири- ногена при помощи адсорбции на колонке с
ны, протопорфирины. Названия «уропорфи- окисью алюминия. В качественной пробе Ват-
рины» и «копропорфирины» были даны по источ- сона—Шварца с реактивом Эрлиха вызывают
интерференцию — уробилиноген, производные
нику их первоначального выделения. Все соеди-
нения, имеющие в основе молекулы кольцо пор- индола, скатола и других веществ. Для повы-
фирина, флюоресцируют и характеризуются ин- шения специфичности пробы добавляют ацетат
тенсивным поглощением на границе видимой натрия и проводят экстракцию хлороформом
и ультрафиолетовой областей спектра. Восста- и бутанолом. При добавлении ацетата натрия
новленные формы порфиринов называют пор- образуется слабая уксусная кислота, в то время
фириногенами. Они являются бесцветными как для реакции индола и скатола с реактивом
предшественниками порфиринов. Дельта-амино- Эрлиха необходимо присутствие сильных мине-
левулиновая кислота является предшествен- ральных кислот. После экстракции хлороформом
ником порфобилиногена, который в свою очередь в водной фазе, помимо порфобилиногена, могут
является предшественником уропорфириногена остаться и другие вещества (меланоген, оксо-
пирролдикарбоксильная кислота и др.). Для их
и копропорфириногена. Для порфиринов харак-
удаления применяют экстракцию бутанолом, в
терно наличие изомерии, что обусловлено
котором растворяются вещества, интерферирую-
различным расположением ра-
щие реакцию. Порфобилиноген-альдегид - сое-
дикалов.
Порфирины входят в состав ряда сложных динение, образующееся при взаимодействии
белков: гемоглобина, миоглобина, цитохромов, порфобилиногена и реактива Эрлиха, не раство-
каталазы. ряется ни в хлороформе, ни в бутаноле. Пред-
Определение порфиринов в биологическом ложены и другие способы экстракции, например
смесью амилбензила. Метод обнаружения пор-
материале имеет диагностическое значение при
ряде патологических состояний — анемиях, ге- фобилиногена в моче реакцией с п-диметил-
патите, отравлении свинцом и особенно при пор- аминобензальдегидом утвержден в качестве уни-
фириях. Повышение содержания порфиринов фицированного в 1979 г.
может быть связано с увеличением их синтеза Унифицированный метод по реакции с п-ди-
в различных клетках организма или недоста- метиламинобензальдегидом. Принцип.
точностью ферментов, участвующих в их обмене. Порфобилиноген (ПБГ) реагирует с п-диметил-
Порфирии представляют собой заболевания, аминобензальдегидом с образованием окрашен-
чаще всего обусловленные генетическим нару- ного в красный цвет соединения.
шением функций различных ферментных систем. Р е а к т и в ы . 1 . п-Диметиламинобензаль-
Существуют различные формы порфирии — пе- дегид. 2. НС1 концентрированная х.ч. 3. Реактив
ченочная, эритропоэтическая и др. Эрлиха: 0,7 г п-диметиламинобензальдегида
Методы определения порфиринов. Исследо- растворяют в 150 мл концентрированной НС1,
приливают к 100 мл воды и смешивают. Раствор
вание порфиринов в биологическом материале
представляет определенные трудности, так как должен быть бесцветным или слегка желтым.
Хранят в посуде из темного стекла. Реактив
содержание их невелико, существуют разные
типы порфиринов, их изомеры, определение стабилен. 4. Натрия ацетат 3-водный х.ч., ч.д.а.,
которых требует п р и м е н е н и я специфических и насыщенный раствор: 375 г ацетата натрия
высокочувствительных методов. Количественные 3-водного (или 226 г безводной соли) раство-
ряют в 250 мл теплой воды, охлаждают до ком-
методы определения порфиринов сложны и тре-
буют наличия дорогостоящей аппаратуры — натной температуры. Хранят при комнатной тем-
спектрометров, флуорометров. Качественные пературе. Раствор должен быть бесцветным и
пробы существуют лишь для немногих видов прозрачным. 5. Хлороформ. 6. Бутиловый спирт.
порфиринов. Пурпурно-красная окраска мочи, 7. Бумага индикаторная для измерения рН
а также о б н а р у ж е н и е оранжевой или красной (в интервале 4,0—5,0).

228
Материал для исследования. ацетон ч.д.а. 7. п-Диметиламинобензальдегид
Моча в первые 2—3 ч после мочеиспускания. ч. 8. Раствор А: 11,55 мл ледяной уксусной кис-
Х о д о б н а р у ж е н и я и о ц е н к а ре- лоты разводят водой в мерной колбе вмести-
з у л ь т а т о в . Смешивают в пробирке 2,5 мл мостью 1 л. 9. Раствор Б: 27,2 г ацетата натрия
реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют растворяют в воде в мерной колбе вместимостью
5 мл насыщенного раствора ацетата натрия 1 л. 10. Ацетатный буфер рН 3,6: готовят, сме-
и перемешивают. Измеряют рН индикаторной шивая 463 мл раствора А и 37 мл раствора Б;
бумагой; значение рН должно быть в интервале доводят до метки водой в мерной колбе вмести-
4,5—5,0; если рН меньше 4,0 добавляют раствор мостью 1 л. 1 1 . Калибровочный основной раст-
ацетата натрия для установления нужного рН. вор АЛК, 0,75 ммоль/л ( 1 0 0 м к г / м л ) в пересчете
Если окраски не образуется — результат отри- на основание: 0,00635 г АЛК гидрохлорида
цательный. При образовании розовой или крас- растворяют в ацетатном буфере рН 3,6 в мерной
ной окраски добавляют 5 мл хлороформа и колбе вместимостью 50 мл. Хранят в холодиль-
встряхивают. Если окраска переходит в слой нике не более месяца. 12. Рабочий калибровоч-
хлороформа, а верхний водный слой становится ный раствор АЛК, 1 мкг/мл. Готовят перед
бесцветным или желтым — результат отрица- употреблением разведением основного калибро-
тельный. При сохранении о к р а ш и в а н и я водной вочного раствора ацетатным буфером в 100 раз.
фазы переносят 6—8 мл водного слоя в другую 13. Взвесь угля: 0,25 г активированного угля
пробирку, добавляют бутиловый спирт в соот- помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл
ношении 2 : 1 и встряхивают. Обычно фазы раз- и разбавляют ацетатным буфером рН 3,6. Перед
деляются быстро; в противном случае смесь цент- употреблением тщательно встряхивать. 14. Реак-
рифугируют. При переходе окраски в бутиловый тив Э р л и х а : 1 г п-диметиламинобензальдегида
слой — результат отрицательный. Если водная растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл
часть остается окрашенной — результат поло- в 35 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют
жительный для ПБГ. 8 мл 57 % хлорной кислоты и доводят до метки
ледяной уксусной кислотой. Хранят в посуде из
Нормальное значение. В норме
темного стекла в холодильнике не более недели.
ПБГ в моче не обнаруживается (0—2 м г / л ) .
15. Беззольные фильтры (синяя лента).
Данным методом ПБГ обнаруживается при кон-
Материал для исследования.
центрации, превышающей 6 мг/л.
Отбирают не менее 2 мл мочи. Допускается
П р и м е ч а н и е . При хранении мочи свы-
хранение мочи в холодильнике, рН мочи должен
ше 3 ч п р и комнатной температуре реакция
быть равен 6, для чего добавляют на 10 мл мочи
может стать ложноотрицательной, что, по-
0,1 мл ледяной уксусной кислоты.
видимому, связано с превращением ПБГ в
Специальное оборудование.
порфирины и образованием ингибиторов
Спектрофотометр.
реакции. Если нет возможности исследовать
Х о д о п р е д е л е н и я . К 1 м л мочи в про-
мочу в первые 2—3 ч, ее хранят в холодиль-
бирке с притертой пробкой добавляют 9 мл взве-
нике при 4 °С или в замороженном состоя-
си угля в ацетатном буфере рН 3,6. Суспензию
н и и . При х р а н е н и и в холодильнике и дове-
взбалтывают 1 мин и фильтруют через бумаж-
дении рН мочи до 6,0—7,0 ПБГ стабилен
ный фильтр ( с и н я я лента). В две пробирки от-
длительное время.
бирают по 2 мл фильтрата. Первая пробирка
Л и т е р а т у р а . Clinical c h e m i s t r y . P r i n - для холостой пробы. Во вторую пробирку (опыт-
c i p l e s a n d t e c h n i c s . 2ed/Eds. R.J. Henry, ную) добавляют 0,05 мл ацетилацетона и тща-
тельно перемешивают. Затем обе пробирки по-
D. C. C a n n o n , J. W. W i n k e l m a n . — Hagerstown
мещают на 20 м и н в к и п я щ у ю водяную баню.
etc.: Harper and Row, 1974, p. 1251 — 1263.
После охлаждения проб и доведения объема
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Увеличе-
жидкости ацетатным буфером до 2 мл в каждую
ние выделения ПБГ с мочой наблюдается п р и
пробирку добавляют по 2 мл реактива Эрлиха
острой перемежающейся порфирии, при ане-
и перемешивают. Через 15 мин опытную пробу
м и я х , связанных с нарушением порфиринового
измеряют против холостой пробы при длине
обмена, при свинцовой интоксикации.
волны 553 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
Окраска раствора стабильна в течение 1 ч.
5.4.4. Дельта-аминолевулиновая Р а с ч е т ведут п о калибровочному графи-
кислота ку (готовят разведения, как у к а з а н о н и ж е ) .
Рабочий АЛК в пробе
Унифицированный метод по реакции с п-ди- Ацетат-
калибро- (2 мл)
№ про-
метиламинобензальдегидом. Принцип. ный буфер
вочный
бирки
раствор, мл рН 3,6, мл
Дельта-аминолевулиновая кислота (АЛК) опре-
мкг мкмоль
деляется по реакции с реактивом Эрлиха после
удаления ПБГ и д р у г и х мешающих определению
0,1 0,04 0,0003
1 До 5 мл
веществ сорбированием их на а к т и в и р о в а н н о м
То же
2 0,12
0,3 0,0009
угле.
» » 0,2
3 0,5 0,0015
Р е а к т и в ы . 1 . У к с у с н а я кислота ледяная
» »
4 0,7 0,28 0,0021
х.ч. 2. Хлорная кислота, 57 %, х.ч. 3. Натрия ацетат
» »
5 1,0 0,4 0,003
3-водный х.ч. 4. Дельта-аминолевулиновой
» »
6 2,0 0,8 0,006
кислоты гидрохлорид ч. 5. Уголь а к т и в и р о в а н -
н ы й с дисперсностью 0,25—1 мм. 6. Ацетил-

229
Из каждой пробы отбирают по 2 мл раствора Р е а к т и в ы . 1. Уксусная кислота ледяная
в 2 пробирки (холостую и опытную), которые х.ч. 2. Эфир медицинский. 3. HCI х.ч. 1,4 моль/л.
обрабатывают, как указано выше. По получен- 4. Йод ч.д.а., спиртовой раствор, 0,039 моль/л.
ным данным строят калибровочный график. 5. Раствор йода в НС1. Готовят ежедневно, сме-
шивая реактивы № 3 (200 объемов) и № 4
П р и м е ч а н и е . Поскольку диурез за сут-
(1 объем).
ки может быть различным, более достовер-
Специальное оборудование.
ным показателем считается содержание АЛК
Спектрофотометр.
в пересчете на 1 г креатинина.
Материал для исследования.
Расчет. Содержание АЛК в моче Свежевыделенная моча. Срок хранения мочи не
(мкмоль/г креатина) рассчитывают с использо- более 3 ч.
ванием калибровочного графика по формуле: Х о д о п р е д е л е н и я . В делительную во-
ронку вносят 2 мл мочи, 0,2 мл ледяной уксусной
кислоты, 5 мл эфира и встряхивают в течение
1 мин. После разделения фаз нижний водный
где С — количество АЛК в пробе (мкмоль), слой отбрасывают. К эфирному слою добавляют
найденное по калибровочному графику; А — 5 мл раствора йода в НС1 и встряхивают в тече-
содержание креатинина в пробе (г) ; 10 — коэф- ние 1 мин. После разделения фаз нижний слой
переносят в пробирку, термостатируют при 37°С
фициент разведения мочи, 2 — объем фильтра-
в течение 5 мин. Затем содержимое пробирки
та ( м л ) .
встряхивают и измеряют оптическую плотность
Коэффициент пересчета микрограмм АЛК в
раствора в кюветах с толщиной слоя 1 см при
микромоли — 0,0076.
трех длинах волн: 380; 402; 430 нм против
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы содержа-
1,41 моль/л раствора НС1.
ния АЛК в моче 3,9 — 19 мкмоль/г креатинина
Р а с ч е т . Учитывая, что диурез за сутки
(0,52—2,5 мг/г креатинина).
может быть разным, более достоверным показа-
Оценка а н а л и т и ч е с к о й надеж-
телем считают содержание КП в пересчете на
н о с т и . Нижняя граница чувствительности
креатинин. Содержание КП в моче (нмоль/г
0,15 мкмоль/л. Воспроизводимость: коэффи-
креатинина) рассчитывают по формуле:
циент в а р и а ц и и около 5 %.
Л и т е р а т у р а . Mauzerall D. S., Gra-

<<

стр. 12
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>