<<

стр. 13
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

nick S. J. biol. Chem., 1956, vol. 219, № 1,
p. 435—446.
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Выделе- где Е402, Е430, Е 380 — оптическая плотность рас-
ние дельта-аминолевулиновой кислоты с мочой твора при соответствующих длинах волн; А —
увеличивается при патологических процессах, содержание креатинина в пробе (г); 1,52 —
связанных с нарушением порфиринового об- коэффициент пересчета микрограммов КП в на-
мена, а также при интоксикации свинцом, бен- номоли; 2,093 — коэффициент для расчета
золом и другими токсическими веществами. содержания КП, предложенный Римингтон.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы К П в моче:
30,5—122 нмоль/г креатинина (20—80 мкг/г
5.4.5. Копропорфирин, уропорфирин креатинина).
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Содержа-
Для копропорфирина (КП) наиболее прием- ние КП в моче повышается при гепатитах, цир-
розах печени, свинцовой интоксикации и неко-
лемыми по аналитическим качествам являются
спектрофотометрические методы. Спектрофото- торых формах порфирии, наследственной копро-
метрический метод Соулсби в модификации порфирии, перемежающейся порфирии, эритро-
поэтической уропорфирии. Повышенное выделе-
Римингтона рекомендован в качестве унифици-
ние с мочой УП наблюдается при перемежаю-
рованного.
щейся порфирии, эритропоэтической уропор-
фирии.
Унифицированный метод Соулсби в модифи-
кации Римингтона. П р и н ц и п . Экстракция
Литература. Павловская Н. А.,
КП и копропорфириногена (КПГ) из мочи в
Кахн X. А., Семенова Л. С., Мере А. Т. — Лаб.
кислой среде с последующим переводом КПГ
дело, 1981, № 2, с. 86—89; Rimington С. Ass.
в КП йодом, реэкстракция КП кислотой и
clin. Pathol., 1971, vol. 70, p. 39—42; Soulsby 1.,
спектрофотометрическое определение его по раз-
Smith R. L. Brit. J. industr. Med., 1974, vol. 31,
нице оптической плотности при трех длинах
№ 1, p. 72—74.
волн.

5.5. УГЛЕВОДЫ И РОДСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ
5.5.1. Глюкоза сутствовать фруктоза и пентозы, а при патоло-
гии и галактоза. После еды увеличивается со-
Более 90 % всех растворимых низкомолеку- держание фосфорных эфиров гексоз, определя-
лярных углеводов крови приходится на глюкозу; емых некоторыми методами вместе с глюкозой.
кроме того, в небольших количествах могут при- Глюкоза распределена почти равномерно между

230
плазмой и эритроцитами, поэтому с равным деления глюкозы, и в обоих идет глюкозоокси-
успехом может определяться в цельной крови, дазная реакция, но в первом варианте датчик
плазме или сыворотке, но надо иметь в виду, что улавливает перекись водорода, а во втором
в уже взятой пробе крови, особенно если сгусток уменьшение содержания кислорода, израсходо-
для получения сыворотки формируется в термо- ванного на окисление глюкозы.
Редуктометрический ф е р р и ц и а н и д н ы й метод,
стате или если материал взят нестерильно, идет
интенсивный гликолиз и содержание глюкозы предложенный в 1926 г. Н. С. Hagedorn,
быстро падает. Часто принимают, что в венозной В. N. Jensen, малоспецифичен, но не нуждается
крови содержится на 0,5 ммоль/л (10 мг в ни в дефицитных реактивах, ни в дорогой аппа-
100 мл) меньше глюкозы, чем в капиллярной, ратуре, поэтому принят в качестве унифициро-
но эта величина, разумеется, условная. ванного и используется и в настоящее время,
Широко распространенный термин «сахар особенно в небольших лабораториях. Значи-
крови» надо считать неудачным, так же как и тельно точнее методы, основанные на способ-
термин «сахарная кривая», и использовать более ности глюкозы восстанавливать соли меди; так
точные выражения: глюкоза крови и глюкозо-то как образующаяся одновалентная медь легко
лерантный тест (ГТТ). окисляется кислородом воздуха, она обычно вы-
Методы определения глюкозы разделяют на ступает в качестве промежуточного вещества,
три г р у п п ы : ферментативные, редуктометриче- окончательным хромогеном служит мышьяково-
ские и методы с использованием цветных реак- молибденовая или фосфорно-вольфрамовая кис-
ций, в которых участвуют продукты, образую- лота. Однако, если в растворе присутствуют
щиеся при н а г р е в а н и и углеводов с концентри- комплексообразователи, например неокупреин,
рованными кислотами. восстановленная (одновалентная) медь не окис-
Ф е р м е н т а т и в н ы е м е т о д ы иссле- ляется кислородом воздуха, поэтому может быть
дования сочетают в себе высокую точность и непосредственно измерена. Методы, основанные
техническую простоту анализа, они основыва- на восстановлении глюкозой нитробензолов, в
ются на одной из двух реакций — гексокиназ- частности пикриновой кислоты, в некоторых
ной либо глюкозооксидазной. В первом случае странах широко распространены, эффективность
глюкоза сначала фосфорилируется за счет АТФ их, видимо, во многом зависит от степени
благодаря действию гексокиназы; образовав- чистоты реактивов. Ошибки редуктометрических
шийся глюкозо-6-фосфорный эфир в присутст- методов в значительной степени вызваны при-
вии глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы восста- сутствием восстанавливающих веществ неугле-
навливает NADP, количество которого опреде- водной природы — глютатиона и аскорбиновой
ляется по увеличению светопоглощения в ульт- кислоты. В связи с тем что глютатион находится
рафиолетовой области. Эти методы считаются в эритроцитах, при анализе плазмы или исполь-
зовании такого метода исследования цельной
наиболее точными, но для выполнения нужда-
крови, при котором эритроциты удаляются не-
ются в нескольких ферментах и кофакторах,
разрушенными, погрешности значительно сокра-
поэтому определение оказывается дорогостоя-
щаются.
щим для клинико-диагностических лабораторий.
Из многочисленных методов, которые осно-
Легче выполнимы глюкозооксидазные методы,
ваны н а ц в е т н ы х р е а к ц и я х с продук-
в которых глюкозооксидаза окисляет глюкозу
тами, образующимися при нагревании углеводов
кислородом воздуха с образованием перекиси
водорода, количество которой определяется либо с кислотами, наибольшее значение имеет орто-
толуидиновый метод. Он специфичен, прост в
химическим путем, либо по ее способности в при-
выполнении, но по ходу реакции надо кипятить
сутствии пероксидазы окислять диамины с обра-
пробу на водяной бане с концентрированной
зованием окрашенных продуктов. Практически
уксусной кислотой, поэтому работать надо под
очень удобен у н и ф и ц и р о в а н н ы й в 1974 г. глюко-
зооксидазный метод определения глюкозы по тягой или в специальном помещении. Антроно-
вый метод значительно менее специфичен, но
окислению ортотолидина. Он не требует ни на-
гревания до высоких температур, ни работы с п р и м е р н о в 5 раз чувствительнее; благодаря
концентрированными кислотами, но имеет тот малой специфичности он годится для определе-
недостаток, что орто-толидин токсичен (канце- ния любых углеводов в крови, в частности поли-
роген), кроме того, трудно получить препарат глюкина. Другие методы этой группы, основан-
глюкозооксидазы, полностью свободной от ка- ные на цветных реакциях с карбазолом, орци-
талазы, которая, хотя бы в небольшой степени, ном или резорцином, применяются лишь для оп-
разрушает образующуюся перекись водорода, ределения углеводов, входящих в состав глико-
поэтому всегда существует угроза получения протеидов и протеогликанов.
з а н и ж е н н ы х результатов. Входящий в эту же В клинической лабораторной диагностике
группу глюкозооксидазный метод, основанный чаще всего глюкозу определяют в крови, взятой
на окислении перекисью водорода фенолфта- из пальца, в этом случае предварительное уда-
лина, имеет то преимущество, что нуждается ление белка абсолютно необходимо. Но если
только в одном реактиве — глюкозооксидазе, анализировать сыворотку без гемолиза и жел-
зато метод более трудоемок. тухи, то многие методы позволяют обходиться
Особый вариант ферментативных методов — без депротеинизации.
ферментные электроды, которые представляют Определение глюкозы в моче имеет лишь
собой чувствительные электрохимические дат- вспомогательное значение, поэтому обычно ог-
чики, содержащие иммобилизованные ферменты. раничиваются лишь ее качественным исследо-
Существует два варианта электродов для опре- ванием. При количественном определении обыч-

231
но используют ортотолуидиновыи метод или ко часов после приготовления начинает выпа-
поляриметрический, основанный на измерении дать осадок, это значит, что ортотолидин недо-
вращения плоскости поляризации. статочно чистый и его надо перекристаллизо-
Как видно из краткого обзора методов, нет вать. 9. Калибровочные растворы глюкозы. Глю-
однозначности в том, какой метод или даже козу предварительно высушивают при 37°С и
какая группа методов должна быть принята хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной
в качестве у н и ф и ц и р о в а н н о й . Наибольшее прак-' раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего
тическое значение имеет определение глюкозы 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщен-
для выявления и контроля за лечением сахар- ного раствора (примерно 0,3 %) бензойной кис-
ного диабета, однако даже наименее точный с лоты. Из этого раствора готовят рабочие калиб-
аналитической точки зрения феррицианидный ровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15;
редуктометрическии методе успехом применялся 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8;
на протяжении многих лет; при правильном его 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят
использовании и интерпретации результатов он насыщенным раствором бензойной кислоты до
может применяться в КДЛ. объема 10 мл. Эти растворы содержат глюкозу
У н и ф и к а ц и я методов. В качестве у н и ф и ц и - в тех же концентрациях, в которых она бывает
в крови, что облегчает расчеты при калибровке.
рованных сейчас приняты три метода. Наиболее
точный глюкозооксидазный унифицирован в Х о д о п р е д е л е н и я . В центрифужные
1974 г.; менее удобный в работе ортотолуидино- пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида нат-
рия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл
выи метод унифицирован в 1972 г., тогда же
у н и ф и ц и р о в а н феррицианидный метод (Хаге- 0,3 н. раствора NaOH, перемешивают; при этом
дорна—Иенсена), который хотя и дает несколь- образуется очень тонкий гель гидрата окиси
ко завышенные результаты, но везде может быть цинка, в него выпускают 0,1 мл крови или калиб-
ровочного раствора, снова перемешивают и че-
налажен.
рез 10 мин центрифугируют при 3000 об/мин в
Унифицированный глюкозооксидазный ме-
течение 10 м и н .
тод по окислению о-толидина. П р и н ц и п .
Глюкозооксидаза окисляет глюкозу с образова- К 1 мл надосадочной жидкости добавляют
нием перекиси водорода, которая под действием 3 мл рабочего реактива и осторожно перемеши-
пероксидазы окисляет ортотолидин ( Н 2 N - С Н з - вают. Постепенно начинает развиваться окрас-
• С 6 Н 3 - С 6 Н 3 - С Н 3 - N H 2 ) с образованием синего ка, которая п р и обычной комнатной температуре
хромогена. Обе реакции протекают одновре- достигает м а к с и м у м а через 13—15 мин, а затем
менно при рН 4,8. постепенно уменьшается. Фотометрируют всегда
Р е а к т и в ы . 1. Натрия хлорид 9 г/л (изо- через один и тот же промежуток времени после
тонический раствор): готовят, растворяя 0,9 г добавления рабочего реактива в кюветах с дли-
NaCl в 100 мл воды. 2. Цинка сульфат, 50 г/л: ной оптического пути 1 см с красным светофильт-
5 г сульфата ц и н к а (ZnSO 4 ) растворяют в воде, ром (длина волны 625 н м ) против холостого
объем доводят до 100 мл. 3. Натр едкий, опыта, который ставят одновременно с рабочими
0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в пробами, но вместо крови берут физиологиче-
100 мл воды, концентрацию проверяют титро- ский раствор хлорида н а т р и я . При приготовле-
ванием (она должна быть 0,3 н . ) . 4. Ортотоли- н и и калибровочного г р а ф и к а вместо проб крови
дин, 1 % раствор: 1 г препарата растворяют берут 0,1 мл соответствующего калибровочного
в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно раствора.
хранить в холодильнике в склянке с притертой Р а с ч е т можно проводить по правилу про-
пробкой несколько месяцев. Имеющийся в про- порций или по калибровочному графику, для по-
даже препарат можно очистить перекристалли- строения которого на одной оси откладывают
зацией, для чего его растворяют в абсолютном концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой
спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы величину экстинкции.
отсасывают на фильтре, затем сушат над хлори-
П р и м е ч а н и я . 1 . Можно сначала вы-
дом кальция. 5. Ацетатный буферный раствор
пустить кровь из пипетки в изотонический
рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н. уксусной кис-
раствор хлорида н а т р и я , а затем добавить
лоты (проверить титрованием!) и 6 частей 0,25 н.
растворы сульфата цинка и NaOH. 2. При
ацетата натрия (содержит 34 г CH 3 COONa-
систематической работе нет необходимости
•ЗН2О в 1 л ) . 6. Глюкозооксидаза — сухой пре-
постоянно строить калибровочный график по
парат активностью 3000 ед/мг или больше.
всем точкам, достаточно ежедневно обраба-
7. Пероксидаза из хрена. Желательно исполь-
тывать холостую пробу и 2—3 точки в диапа-
зовать кристаллический препарат ф и р м ы «Реа-
зоне 3—9 ммоль/л, а полный калибровочный
нал» ( В е н г р и я ) : 1 мг растворяют в 5 мл ацетат-
график строить л и ш ь при смене реактивов
ного буфера (реактив 5), в холодильнике можно
или н а л а ж и в а н и и методики.
х р а н и т ь несколько дней. 8. Рабочий реактив:
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы натощак:
в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глю-
3,5—5,7 ммоль/л (60—100 мг в 100 м л ) .
козооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют
1 мл 1 % раствора ортотолидина, перемешивают Литература. Лаб. дело, 1976, № 6,
и доводят объем буферным раствором до 100 мл. 373—374.
Рабочий реактив должен быть прозрачным, бес-
Глюкозооксидазный метод по окислению фе-
цветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в
нолфталина. П р и н ц и п . Белки осаждают
этом случае он устойчив при хранении на холоду.
трихлоруксусной кислотой, рН безбелкового
Если же окраска интенсивна или через несколь-

232
и обрабатывают ее так же, как и надосадочную
раствора с помощью фосфата н а т р и я доводят
жидкость. В калибровочный опыт вместо над-
до точки, близкой к оптимому действия глюкозо-
осадочной жидкости берут по 1 мл р а з л и ч н ы х
оксидазы, и проводят ферментативную реакцию.
калибровочных растворов (реактив 6). Расчет
Образующаяся перекись водорода в присутст-
проводят по калибровочному графику или по
вии ионов меди окисляет фенолфталин до фенол-
п р а в и л у пропорций.
фталеина, который в нейтральной области бес-
цветен, а в щелочной области окрашен в крас-
П р и м е ч а н и я . 1 . Фенолфталин можно
ный цвет. Поэтому перед фотометрированием
добавляют щелочь. синтезировать из недефицитного фенолфта-
Р е а к т и в ы . 1 . Трихлоруксусная кислота, леина, который широко используется в ла-
раствор 50 г/л. При титровании щелочью кон- бораториях в качестве кислотно-основного
центрация кислоты должна быть 0,3 н. 2. Натрия индикатора. Для этого в колбу вместимостью
фосфат двузамещенный, 0,25 моль/л. Готовят, 1 л с обратным холодильником помещают
5 г фенолфталеина, 250 мл 20 % раствора
растворяя 9,7 г Na 2 HPO 4 -2H 2 O или 18 г
N а 2 H P O 4 - 1 2 Н 2 О в воде, объем доводят до КОН и 2,5 г цинковой пыли, а также несколь-
200 мл. При добавлении 2 мл этого раствора ко стеклянных бусинок для равномерного
к и п е н и я . Раствор становится темно-красного
к 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты рН
цвета, его кипятят до тех пор, пока он не
должен быть в пределах 5,0—6,0. 3. Раствор
станет слабо-розовым или совсем не обесцве-
глюкозооксидазы. Содержит около 3000 ед. в
тится, обычно на это уходит 1 рабочий день.
1 мг. Готовят, растворяя соответствующее коли-
Еще горячий раствор фильтруют через стек-
чество сухого препарата в 10 мл воды. Допуска-
л я н н ы й фильтр и добавляют 100 мг трилона.
ются значительные колебания активности фер-
К охлажденному прозрачному раствору в
мента, поэтому обычно нет необходимости прове-
большом химическом стакане добавляют не-
рять качество препарата. 4. Фенолфталин, 0,5 %
большими порциями при постоянном переме-
раствор. Готовят, растворяя 75 мг вещества
ш и в а н и и 5 н. НС1 до тех пор, пока реакция
в 15 мл 0,1 н. NaOH, раствор должен быть бес-
не станет сильнокислой (по конго красному
цветным или слегка розоватым, окрашенные
или универсальной индикаторной бумажке),
растворы для работы непригодны. Для увеличе-
на это идет около 200 мл кислоты. В ы п а в ш и й
н и я стойкости реактива к нему добавляют 3 мг
осадок отфильтровывают на бюхнеровской
трилона (натриевой соли этилендиаминтетраук-
воронке и высушивают, желательно в ваку-
сусной кислоты), который, связывая соли тяже-
уме.
лых металлов, препятствует самоокислению фе-
нолфталина кислородом воздуха. 5. Рабочий 2. Можно избежать удаления белков
реактив. Готовят в день определения, смешивая осаждением, если анализировать кровь, вы-
30 частей 0,3 н. NaOH, 2 части 0,5 % раствора сушенную на фильтровальной бумаге. Для
фенолфталина (реактив 4) и 1 часть 0,12 % этого 0,02 мл исследуемой крови в виде плот-
раствора сульфата меди (120 мг CuSO 4 - ного узора выпускают на фильтровальную
•5Н2О растворяют в 100 мл воды). 6. Калибро- бумагу, высушивают на воздухе, вырезают
вочные растворы. Глюкозу высушивают при и з а м а ч и в а ю т на 10—15 мин в 1 мл 5 %
37 °С и х р а н я т в эксикаторе. Сначала готовят трихлоруксусной кислоты. Фильтр с пятном
раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего крови удаляют, а экстракт обрабатывают
180 мг препарата растворяют в 20 мл 5 % три- так же, как и безбелковый фильтрат. В ка-
хлоруксусной кислоты. Разведением этого рас- честве холостого опыта используют 1 мл 5 %
твора в 50 раз той же 5 % трихлоруксусной кис- трихлоруксусной кислоты, в которой был за-
лотой получают раствор, содержащий 1 ммоль/л. мочен такой же по размеру кусочек фильтро-
Берут 0,6; 1,2; 1,8 и 2,4 мл раствора 1 ммоль/л вальной бумаги. Если окраска в холостом
и объем каждой порции доводят до 10 мл, добав- опыте оказывается значительной, фильтро-
ляя нужное количество 5 % трихлоруксусной вальную б у м а г у предварительно вымачивают
кислоты. Получаются растворы, содержащие 60; в горячей 5 % уксусной кислоте, а затем
высушивают.
120; 180 и 240 мкмоль/л. При построении калиб-
ровочного графика окраска проб, в которых
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы т е же, что и
обрабатывались эти растворы, будет соответст- в предыдущем методе.
вовать концентрации 3; 6; 9 и 12 ммоль глюкозы
в I л крови. Л и т е р а т у р а . Балаховский И. С., На-
Х о д о п р е д е л е н и я . 0,03 м л крови вы- точин Ю. В. Пробл. космич. биол., 1973, т. X X I I ,
ливают в 1,5 мл 5 % трихлоруксусной кислоты, с. 43; Городецкий В. К-, Селиванов И. А. При-
перемешивают и центрифугируют. К 1 мл про- кладная биохимия и микробиология, 1969, т. 5,
№ 3, 353.
зрачной надосадочной жидкости добавляют 2 мл
0,25 моль/л фосфата натрия и 2 капли (при-
мерно 0,1 мл) раствора глюкозооксидазы. Пере- Купрометрический метод с использованием
мешивают и оставляют п р и комнатной темпера- мышьяково-медного реактива (метод Сомоги —
туре на 1 ч, затем добавляют 2 мл рабочего реак- Нельсона). П р и н ц и п . Глюкоза восстанавли-
тива и еще через 30 м и н фотометрируют в кю- вает ионы двухвалентной меди, которые в свою
вете с длиной оптического пути 1 см п р и длине очередь восстанавливают мышьяково-молибде-
волны 520 нм (зеленый светофильтр). новую кислоту с образованием молибденовой
Одновременно ставят холостой опыт, в кото- сини, которая придает раствору устойчивое ок-
рый берут 1 мл 5 % трихлоруксусной кислоты рашивание.

233
5.5.2. Углеводные компоненты
Р е а к т и в ы . 1 . Натрия фосфат двузаме-
гликопротеидов
щенный. Вместо 28 г безводной соли (Nа 2 НРО 4 >
можно взять 70,5 г ее гидрата (Na 2 HPO 4 -
• 12Н 2 О). 2. К а л и й , н а т р и й виннокислый (сегне- Вещества, содержащие белковый и углевод-
това соль). 3. Безводный сульфат натрия. ный компоненты, называются гликопротеидами.
Вместо 80 г безводной соли (Na2SO 4 ) можно Различают собственно гликопротеиды и протео-
взять 180 г ее кристаллического гидрата гликаны. В первую группу входят белки, содер-
( N a 2 S O 4 - 1 0 Н 2 О ) . 4. Меди сульфат CuSO 4 - жащие относительно короткие (не больше'15—
5Н2О. 5. Щелочной медный реактив: ра- 20 моносахаридов) углеводные цепи, в которых
створяют 28 г двузамещенного фосфата нат- нет периодически повторяющихся олигосаха-
рия и 40 г сегнетовой соли в 600—700 мл воды ридных последовательностей. Вторую подгруппу
и добавляют туда 100 мл 1 н. NaOH. Отдельно составляют протеогликаны или г л и к о з а м и н п р о -
растворяют 8 г сульфата меди в 80 мл воды и теогликаны, которые иногда называют амино-
приливают, перемешивая, к предыдущему рас- полисахаридами, или мукополисахаридами. Они
твору. Затем к смеси добавляют 80 г безводного значительно богаче углеводами,, каждая угле-
сульфата натрия, доводят объем до 1 л водой и водная цепь состоит из повторяющихся дисаха-
оставляют на 2—3 дня при 37 °С, после чего ридных фрагментов, содержащих аминосахар и
фильтруют. Х р а н я т в темноте, желательно в по- уроновую кислоту или галактозу. Углеводные
лиэтиленовом флаконе, так как стекло может компоненты протеогликанов называют гликоза-
выщелачиваться, н а р у ш а я кислотность среды. миногликанами (ГАГ).
6. Аммоний молибденовокислый ((NH 4 )5Mo 7 O 2 4 - Гликопротеиды. Большинство белков плазмы
•H 2 O). 7. Натрий мышьяковокислый двуза- крови содержит хотя бы некоторое количество
мещенный (Na 2 HAs 5 O 4 -7H 2 O). 8. Мышьяково- углеводов, поэтому формально относятся к гли-
копротеидам. Однако практически сывороточ-
молибденовый реактив: при легком подогрева-
ными гликопротеидами обычно называют л и ш ь
нии растворяют 25 г молибденовокислого аммо-
небольшую группу белков, особенно богатых
н и я в 450 мл воды, затем добавляют 21 мл кон-
углеводами, куда входят трансферрин, гаптогло-
центрированной серной кислоты и перемеши-
булин, макроглобулин и т. д. Содержание их
вают. К этому раствору добавляют 3 г двузаме-
увеличивается при воспалительных процессах,
щенного мышьяковокислого натрия, растворен-
в связи с чем их называют белками острой фазы
ного в 25 мл воды. Хорошо перемешивают и
и определяют в тех случаях, когда надо выявить
оставляют стоять на 1—2 сут в темном месте
при 37 "С. Реактив должен быть зеленоватого воспалительный процесс или оценить его актив-
цвета. К нему добавляют несколько капель ность. При этом возможно несколько подходов:
0,05 н. перманганата калия (0,79 % раствор 1) определение индивидуальных гликопротеидов
КМпО 4 ), так, чтобы раствор стал золотисто- острой фазы посредством специфических энзи-
желтым. Хранить в посуде из темного стекла. матических или иммунологических методов;
9. Вольфрамовокислый натрий, 10 %. 10. Серная 2) выявление электрофоретических фракций,
кислота, 0,66 н. 11. Калибровочные растворы особенно богатых гликопротеидами; 3) опреде-
глюкозы те же, что и в глюкозооксидазном ме- ление суммы углеводов, связанных с сывороточ-
тоде определения глюкозы по окислению орто- ными белками. Последний подход и рассматри-
толидина. вается в настоящем разделе.
Из более чем 100 известных природных са-
харов и их производных с белками бывает свя-
Х о д о п р е д е л е н и я . К 1,5 мл воды до-
зано лишь около 10. В состав гликопротеидов
бавляют 0,1 мл крови, перемешивают и прили-
входят следующие углеводы: I) гексозы — глав-
вают сначала 0,2 мл 10 % раствора вольфрамо-
ным образом галактоза и манноза, в очень не-
вокислого натрия, а затем 0,2 мл 0,66 н. серной
значительных количествах и глюкоза; 2) пен-
кислоты. Перемешивают и через несколько м и -
тозы — ксилоза и арабиноза; 3) дезоксисахара-
нут центрифугируют. К 0,5 мл прозрачной над-
фукоза и рамноза; 4) аминосахара — ацетил-
осадочной жидкости добавляют 0,5 мл щелоч-
глюкозамин и ацетилгалактозамин; 5) нейрами-
ного медного реактива и ставят на кипящую во-
новая кислота и ее уксуснокислые эфиры, кото-
дяную баню на 20 с. Затем охлаждают 1 м и н в
рые называются сиаловыми кислотами.
воде комнатной температуры и добавляют 0,5 мл
О количестве сывороточных гликопротеидов
мышьяково-молибденового реактива и 7,5 мл,
можно судить, определяя любой из этих компо-
воды.
нентов, но по практическим соображениям в кли-
Перемешивают и фотометрируют в кювете
нической практике находит широкое применение
с длиной оптического пути 1 см при длине волны
лишь определение связанных с белком гексоз и
700 нм против холостого опыта, при постановке
сиаловых кислот; методы определения фукозы,
которого вместо крови берут 0,1 мл воды. Одно-
аминосахаров и нейраминовой кислоты извест-
временно обрабатывают калибровочные пробы,
ны, но не получили такого широкого распростра-
в которые вместо крови берут калибровочные
нения из-за сложности и трудоемкости.
растворы. Расчет можно: проводить по кали-
Многие богатые углеводами белки обладают
бровочному графику или по п р а в и л у про-
в ы р а ж е н н ы м и кислотными свойствами, раство-
порций.
римы в хлорной и трихлоруксусной кислотах
Нормальныевеличиныиклини-
и составляют группу серомукоидов, диагности-
ч е с к о е з н а ч е н и е те же, что и в глюко-
ческое значение которых примерно такое же,
зооксидазном методе, т. е. 3,5—5,7 ммоль/л
как гликопротеидов. О количестве серомукоидов
(60—100 мг в 100 м л ) .
234
можно судить по содержанию белкового или уг- карбазоловая реакция интенсивнее развивается
леводного компонента, но последний путь на- с глюкуроновой кислотой, чем с идуроновой.
дежнее. Содержание в плазме гексоз, связанных На этом основан простой метод, позволяющий
с белком, свидетельствует об общем количестве судить об относительном содержании дерматан-
гликопротеидов, а определение гексоз, которые сульфатов по так называемому коэффициенту
растворимы в хлорной кислоте и нерастворимы К/О, который рассчитывают путем деления
в фосфорновольфрамовой, служит показателем содержания ГАГ, определенного по карбазоло-
количества серомукоидов. вой реакции, на их содержание, определенное
по реакции с орцином; разумеется, оба резуль-
Большинство цветных реакций на сахара
тата должны быть выражены в молях. Для
может быть также использовано для определе-
чистого образца дерматансульфата этот коэф-
ния углеводных компонентов гликопротеидов.
фициент равен 0,67, для прочих ГАГ (за ис-
Из них наиболее подходящим для определения
ключением, конечно, кератансульфата) он
гексоз орциновый метод, а для определения
выше.
сиаловых кислот — резорциновый метод и метод
Увеличение экскреции ГАГ с мочой служит
с уксусно-сернокислым реактивом.
признаком повреждения соединительной ткани
Хотя клиническая трактовка результатов
вследствие иммунного процесса, воспаления или
определения перечисленных выше веществ во
же врожденного дефекта обмена. При приобре-
многом схожа, содержание отдельных углевод-
тенных заболеваниях (ревматизм, склеродер-
ных компонентов изменяется не всегда строго
м и я ) увеличение коэффициента К/О характерно
параллельно, так как индивидуальные белки
острой фазы содержат их в р а з н ы х количествах для более тяжелых, деструктивных процессов,
и все зависит от того, какой конкретный протеид в то время как п р и преобладании фибротиче-
ских, склеротических и дистрофических процес-
преимущественно изменился. По этой причине
сов коэффициент падает, видимо, потому, что
в клинике, в частности в ревматологической,
появляются гетерогенные Протеогликаны с высо-
стремятся одновременно определять несколько
ким содержанием идуроновой кислоты.
р а з л и ч н ы х показателей.
Унификация методов. В 1972 г. унифициро-
Протеогликаны. Этими соединениями очень
в а н ы резорциновый метод определения сиало-
богато межклеточное вещество соединительной
вых кислот и определения связанных с белками
ткани, патологические процессы в которой отра-
жаются на обмене углеводного компонента — гексоз и гексоз, связанных с серомукоидом
гликозаминогликанов (ГАГ) и содержании их орциновым методом.
в моче. Протеогликаны весьма гидрофильны,
они способны впитывать большое количество Л ит е р а т у р а. Астахова Т. А, Балаба-
воды, чем и определяется их более старое назва- нова Р. М. Гликозаминогликаны мочи при
ние «мукополисахариды». Гистохимически они системной склеродермии.— Тер. арх., 1980,
выявляются по способности к метахроматиче- № 12, с. 100^104; Видершайн Г. Я. Биохимиче-
ской окраске, т. е. о к р а ш и в а н и ю в цвет, отлич- ские основы гликозидозов.— М.: Медицина,
1980.
ный от цвета красителя.
ГАГ состоят из повторяющихся дисахарид-
ных единиц, каждая из которых содержит
а м и н о с а х а р и уроновую кислоту или галактозу; 5.5.3. Сиаловые кислоты
другие углеводы (фукоза, сиаловые кислоты,
манноза и ксилоза) присутствуют л и ш ь в Унифицированный резорциновый метод.
ничтожных количествах. При определении ГАГ П р и н ц и п . При н а г р е в а н и и гликопротеидов
в крови или в моче их обычно сначала выделяют, плазмы с трихлоруксусной кислотой отщепля-
используя способность образовывать осадки ются сиаловые кислоты, которые в свою очередь
с четвертичными а м и н а м и , содержащими длин- гидролизуются с образованием свободной ней-
ную углеводную цепь, в частности с цетилтриме- раминовой кислоты и уксусной кислоты. Резор-
тиламмонием, а затем определяют углеводный цин в присутствии солей меди дает с нейрамино-
компонент специфической реакцией в карбазо- вой кислотой синее окрашивание.
лом или орцином. Результаты определения ГАГ Р е а к т и в ы . 1. Меди сульфат, 0,1 моль/л:
карбазоловым и орциновым методом очень часто растворяют 624 мг сульфата меди (медный купо-
не совпадают, что имеет определенное диагнос- рос, CuSO 4 -5Н 2 O) в 25мл воды. 2. Резорцин
тическое значение. 2 г/л. Резорциновый реактив готовят, растворяя
200 мг резорцина в 10 мл воды, затем добавляют
Известно 7 типов ГАГ, из них 5 содержат
в своем составе глюкуроновую кислоту, шес- 80 мл концентрированной НС1 (отн. плотность
той — идуроновую кислоту, называемую также 1,19) и 0,25 мл раствора сульфата меди, после
смешивания общий объем доводят до 100 мл
галактуроновой, а седьмой — галактозу. Глюку-
водой. Реактив годен к употреблению через 4 ч
роновую кислоту содержит гиалуроновая кисло-
после приготовления, п р и хранении в холодиль-
та, хондроитин-4-сульфат (хондроитинсуль-
нике стоек. 3. Экстрагирующий реактив: смеши-
фат А ) , хондроитин-6-сульфат (хондроитин-
сульфат С), гепарин и гепарансульфат; вают 85 мл бутилацетата и 15 мл бутилового
спирта. 4. Трихлоруксусная кислота, 50 г/л.
дерматансульфат (хондроитинсульфат В) со-
держит идуроновую кислоту, а кератосульфат 5. Калибровочные растворы. Основной раствор
содержит 0,5 мг кристаллической ацетилней-
или кератансульфат — галактозу. Глюкуроно-
вая кислота в реакции с орцином дает такое же раминовой кислоты (мол. масса 309) в 1 мл воды.
Из него готовят калибровочные растворы.
окрашивание, как и идуроновая, в то же время

235
док отмывают, растворяют в щелочи и опреде-
Основной ляют в нем гексозы по реакции с орцином.
Соответствует
раствор Содержание Количество гексоз характеризует общее содер-
Во- концентрации
ацетил-
жание гликопротеидов.
в плазме
нейрами-
Серомукоиды — это особый вид гликопротеи-
МЛ

дов, которые растворимы в хлорной кислоте, но
мг/л
мкг ММ ОЛЬ /Л
КИСЛОТЫ НМОЛЬ
нерастворимы в фосфорновольфрамовой кисло-
те. Для их определения остальные белки
0,65
0,9 200
162
0,1 50
осаждают хлорной кислотой; добавляя к надоса-
0,2 324 400 1,29
0,8 100
дочной жидкости фосфорновольфрамовую кис-
600 1,94
0,3 0,7 150 485
лоту, осаждают серомукоиды, осадок отмывают,
800 2,59
0,4 647
0,6 200
растворяют в щелочи и определяют содержание
1 000 3,24
0,5 0,5 250 809
гексоз по реакции с орцином. Количество гексоз
характеризует общее содержание серомукоидов.
Р е а к т и в ы . 1. Орциновый реактив. Гото-
вят смешиванием двух реактивов: А — серная
Х о д о п р е д е л е н и я . К 0,1 мл плазмы или
кислота и Б — раствор орцина, 16 г/л. Реактив
сыворотки приливают 1,9мл раствора трихлор-
А готовят, осторожно добавляя к 40 мл воды
уксусной кислоты, ставят на 7 м и н на кипящую
водяную баню для гидролиза, затем охлаждают 60 мл концентрированной серной кислоты; реак-
и фильтруют через бумажный фильтр. К 0,5 мл тив Б готовят, растворяя 1,6 г орцина в 100мл
прозрачного фильтрата добавляют 0,5 мл воды воды. Оба реактива стойкие. Непосредственно
и 1 мл резорцинового реактива, закрывают перед определением смешивают 7,5 мл реактива
стеклянными пробками и ставят на водяную А и 1 мл реактива Б. 2. 96 % этиловый спирт
кипящую баню еще на 15 мин. После этого (этанол). 3. Натр едкий, 0,1 н. раствор. 4. Хлор-
охлаждают, добавляют 3 мл экстрагирующего ная кислота, 0,6 моль/л, содержит 6 % HCIO4.
5. Фосфорновольфрамовая кислота, 50 г/л.
реактива, встряхивают и оставляют на 15 м и н
для расслоения фаз. Окраска переходит в верх- Готовят, растворяя 5 г ее в 100 мл 2 н. НС1.
ний слой, который отсасывают и фотометрируют 6. Калибровочный раствор, содержащий 45 мг
при длине волны 575—590 нм в кювете с длиной галактозы и 45 мг маннозы в 100 мл воды.
оптического пути 0,5 см против холостого опыта, Сахара высушивают в эксикаторе над фосфор-
при постановке которого к 1 мл воды добавляют н ы м ангидридом. В связи с тем, что оба вещест-
1 мл резорцинового реактива. Остальные про- ва имеют одинаковую молекулярную массу,
цедуры те же, что и в основном опыте. Для получается раствор, содержащий смесь гексоз
построения калибровочного графика берут но в общей концентрации 5 ммоль/л.
1 мл калибровочных растворов, приготовленных О п р е д е л е н и е общего количест-
согласно таблице, добавляют по 1 мл резорцино- ва с в я з а н н ы х с б е л к а м и гексоз.
вого реактива и обрабатывают так же, как К 0,1 мл исследуемой сыворотки или плазмы
в основном опыте. приливают 5 мл 96 % этилового спирта, переме-
Р а с ч е т проводят п о калибровочному гра- шивают и центрифугируют 5 м и н . Осадок тща-
тельно взбалтывают в 5 мл 96 % этанола, снова
фику.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В норме центрифугируют и .удаляют надосадочную
содержание сиаловых кислот составляет жидкость. Осадок растворяют в 1 мл 0,1 н.
NaOH, добавляют 8,5 мл орцинового реактива,
2,0—2,33 ммоль/л независимо от того, выра-
жаются результаты определения в свободной перемешивают и ставят на водяную баню при
нейраминовой кислоте или же в ее ацетилиро- 80 °С точно на 15 мин; следует избегать попада-
ванной форме — сиаловых кислотах. При выра- ния прямого дневного света. Охлаждают в тем-
жении результатов в весовых единицах содержа- ноте в холодной воде и фотометрируют в кювете
ние нейраминовой кислоты составляет 620— с длиной оптического пути 1 см при длине волны
560 нм против холостого опыта, при постановке
730 мг/л.
которого берут вместо осадка, растворенного
Л и т е р а т у р а . Svennerholm L. The q u a n - в щелочи, воду или 0,1 н. NaOH.
t i t a t i v e e s t i m a t i n g of cerebrosides in nervous
Построение калибровочной
tissue.— J. of Neurochemistry, 1956, v o l . 1 ,
к р и в о й . 0,05—0,3 мл. основного калибровоч-
№ 1, p. 42—53.
ного раствора доводят водой до объема 1 мл,
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Содержа- приливают 8,5 мл орцинового реактива и обра-
ние сиаловых кислот возрастает при с а м ы х батывают дальше так же, как и опыт. Окраска
разнообразных воспалительных процессах, а раствора, в который взято 0,3 мл калибровоч-
также при опухолях, инфаркте миокарда. В це- ного раствора, соответствует окраске опытной
лом диагностическое значение такое же, как пробы, в которую взята сыворотка, содержащая
и остальных гликопротеидных показателей. 15 ммоль/л гексоз. Окраска раствора, в кото-
рый взято 0,2 мл калибровочного раствора,
соответствует содержанию 10 ммоль/л гексоз
5.5.4. Связанные с белком гексозы и т. д.
Определение гексоз, связан-
н ы х с с е р о м у к о и д о м . К 1 м л сыворотки
Унифицированный орциновый метод.
П р и н ц и п . Гликопротеиды осаждают вместе или плазмы добавляют 1 мл воды и после пере-
с белками сыворотки или плазмы спиртом, оса- м е ш и в а н и я осторожно по стенке приливают 2 мл

236
0,6 н. хлорной кислоты, перемешивают и остав- крепкой серной кислоты. Глюкуроновая кислота
ляют стоять 10 мин, после чего центрифугируют дает такое же окрашивание, как и галактуроно-
10 м и н при 4000 об/мин. Надосадочную жид- вая (идуроновая) кислота при обработке орци-
кость сливают в чистую пробирку, добавляют новым реактивом, но с карбазоловым реактивом
2 мл 5 % раствора фосфорновольфрамовой идуроновая кислота дает о к р а ш и в а н и е на 21 %
кислоты, перемешивают и центрифугируют. менее интенсивное, чем глюкуроновая кислота.
Надосадочную жидкость удаляют, к осадку Р е а к т и в ы . I . Раствор цетавлона. Водный
добавляют 2 мл 96 % этилового спирта, снова раствор цетилтриметиламмонийбромида, 25 г/л.
перемешивают и центрифугируют 10 мин при 2. 95 % этиловый спирт, насыщенный хлоридом
4000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, натрия при комнатной температуре. 3. Карбазо-
осадок растворяют в 1 мл 0,1 н. NaOH, прили- ловый реактив. Раствор карбазола 1 г/л в этило-
вают 8,5 мл орцинового реактива. Дальнейшее вом спирте. 4. Орциновый реактив: 0,2 г орци-
определение проводят так же, как определение на растворяют в 100 мл концентрированной
общего количество связанных с белками гексоз. серной кислоты х. ч., отн. плотности 1,84. Реак-
тив может храниться до 2 нед в посуде из тем-
Построение калибровочного
графика. 0,05—0,5 м л калибровочного ного стекла в холодильнике. 5. Серная кислота
раствора доводят водой до объема 1 мл и прили- х. ч. 6. 1 н. NaOH. 7. 2 н. HCI. 8. Универсальная
индикаторная бумага. 9. Калибровочные раство-
вают 8,5 мл орцинового реактива; дальнейшее
определение проводят так же, как и в опыте. ры глюкуроновой кислоты в воде, содержащие
Окраска раствора, в который взято 0,5 мл калиб- 5—100мг/л.
ровочного раствора, соответствует содержанию Ход определения. Выделение
гексоз, связанных с серомукоидом 2,5 ммоль/л. ц е т а в л о н о в ы х о с а д к о в . Собирают су-
Окраска раствора, в который взято 0,4 мл точную мочу, отдельные порции до объединения
калибровочного раствора, соответствует содер- хранят в холодильнике. Если плотность мочи
жанию в сыворотке 2 ммоль/л связаных с серо- ниже 1,020, для исследования берут 30мл,
мукоидом гексоз и т. д. в противном случае берут 15 мл и добавляют
15 мл воды. Перед отбором пробы суточное
П р и м е ч а н и е . Препараты орцина обыч-
количество мочи тщательно перемешивают и не
но нуждаются в дополнительной очистке.
фильтруют. Добавлением 2 н. НС1 под контро-
Для этого препарат нагревают на водяной
лем рН метра или индикаторной бумаги кислот-
бане п р и 60—65 °С, при этом образуются
ность исследуемой пробы доводится до рН 5,0.
два слоя — собственно расплавленный орцин
Затем добавляют 1 мл раствора цетавлона и
и вода, нагревание продолжают до тех пор,
оставляют на ночь в холодильнике. На следую-
пока вся вода не испарится. Осадок при
щий день центрифугируют при комнатной тем-
н а г р е в а н и и растворяют в минимальном коли-
пературе 15 мин при 2000 об/мин. Надосадочную
честве бензола, добавляют активированный
жидкость осторожно удаляют, а пробирки остав-
уголь, перемешивают, в горячем виде
ляют в перевернутом положении на 1 мин, чтобы
фильтруют и охлаждают. При этом выпадают
с осадка успела стечь жидкость. Осадок дважды
кристаллы орцина. Перекристаллизацию
промывают п о р ц и я м и по 5—10 мл 95 % этило-
повторяют дважды.
вого спирта, насыщенного хлоридом натрия,
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Общее ко-
каждый раз тщательно измельчая осадок палоч-
личество гексоз, связанных с белками сыворотки
кой и центрифугируя его. Отмытый осадок раст-
или плазмы, составляет в норме 5,8—6,6 ммоль/л,
воряют в 1,5 мл воды, подщелоченной 2 к а п л я м и
из них с серомукоидом связано 1,2—1,6 ммоль/л. 1 н. NaOH, затем объем доводят до 5 мл. Если
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Самые раз- раствор окажется мутным и его оптическая
нообразные воспалительные процессы приводят плотность будет выше 0,7, то добавляют еще
к увеличению содержания связанных с белками
5 мл воды, доводя с у м м а р н ы й объем до 10 мл.
или серомукоидом сыворотки гексоз. Наиболь-
Осадок, не растворившийся в щелочи, удаляют.
шее диагностическое значение имеет их опреде-
Цветная реакция с карбазолом
ление для выявления вяло текущих воспали-
(п о Д и ш е). К 1 мл растворенного цетавлоно-
тельных процессов, повышение этих показате-
вого осадка приливают при охлаждении 6 мл
лей свидетельствует об активации процесса,
концентрированной серной кислоты, нагревают
даже если клинические симптомы еще не про-
на кипящей водяной бане 20 м и н , охлаждают
явились. Чаще всего связанные с белками гексо-
до комнатной температуры и добавляют 0,2 мл
зы исследуют ревматологи.
карбазолового реактива. Появляется розовое
окрашивание, которое усиливается на протяже-
5.5.5. Гексуроновые кислоты нии 2 ч, а потом в течение 1 ч остается стабиль-
ным. Фотометрируют через 2 ч в кювете с длиной
оптического пути 1 см при длине волны 540 нм
Содержание гексуроновых кислот, входящих
против холостого опыта, при постановке кото-
в состав гликозаминогликанов мочи, опреде-
рого вместо цетавлонового осадка берут воду.
ляется карбазоловым и орциновым методами.
Ц в е т н а я р е а к ц и я с о р ц и н о м (по
Принцип. Гликозаминогликаны мочи
С в е н н е р х о л ь м у ) . К 2 мл растворенного
осаждаются в виде комплексов с цетилтриметил-
цетавлонового осадка добавляют 4 мл орцино-
аммонийбромидом, осадки отмывают и раство-
вого реактива и оставляют на 15 мин, затем тща-
ряют в слабой щелочи. Входящие в состав ГАГ
гексуроновые кислоты определяют по цветным
Очистку орцина см. с. 237, левая колонка.
реакциям с орцином и карбазолом в присутствии

237
5.5.6. Гликозилированный гемоглобин
тельно перемешивают и ставят еще на 20 мин
в водяную баню при 80 °С; охлаждают на льду
и фотометрируют при длине волны 505 нм Белки, в том числе гемоглобин, если их дли-
в кювете с длиной оптического пути 1 см против тельное время выдерживать в растворе, содер-
холостого опыта, при проведении которого к 2 мл жащем глюкозу или другой редуцирующий
растворенного цетавлонового осадка добавляют моносахарид, присоединяют ее остатки за счет
вместо орцинового реактива 4 мл серной кисло- химических, неэнзиматических процессов. Чем
ты из той же самой партии, которая была выше концентрация глюкозы в растворе и чем
использована для приготовления реактива 4; длительнее инкубация, тем больший процент
холостую пробу обрабатывают так же, к а к молекул гемоглобина гликозилируется, поэтому
опытную. содержание гликозилированного гемоглобина
(Gly-Hb) характеризует средний уровень кон-
Построение калибровочного
центрации глюкозы в крови за время жизни
г р а ф и к а . При построении калибровочных
молекулы гемоглобина. Лечение диабета прово-
графиков для карбазоловой и орциновой реак-
дят с помощью лекарств, понижающих содержа-
ций используют одну и ту же серию калибровоч-
ние глюкозы в крови лишь на ограниченный
ных растворов, содержащих 5—100мкг глкжу-
промежуток времени, очень важно подобрать
роновой кислоты в 1 мл воды. Калибровочные
пробы обрабатывают так же, как и опытные. такие схемы терапии, которые позволили бы
По калибровочному графику вычисляют содер- добиться стойкой нормализации гликемии. Ис-
жание глюкуроновой кислоты в м и к р о г р а м м а х следование гликозилированного гемоглобина
в 1 мл растворенного цетавлонового осадка. оказывается ценным лабораторным показате-
Эту величину делят на 1,5; 3 или 6 в зависи- лем, характеризующим некоторый средний уро-
мости от того, какому количеству мочи соответ- вень глюкозы в крови на протяжении длитель-
ствует 1 мл растворенного осадка. ного промежутка времени, который соизмерим
Окончательный результат выражают в мил- с длительностью полужизни молекулы гемогло-
л и г р а м м а х за сутки. Можно выражать его и в бина (3—4мес). Количество гликозилирован-
ного гемоглобина выражают в молярных про-
м и л л и г р а м м а х на 1 г креатинина, для этого
концентрацию гексуроновых кислот (мг/л) центах, т. е. в количестве остатков моносахарида,
делят на концентрацию креатинина (г/л). Для которые приходятся на 100 молекул гемоглоби-
пересчета результатов в молекулярные вели- на. Его уровень повышается при сахарном
диабете и характеризует степень его компенса-
чины найденное количество делят на молекуляр-
ную массу глюкуроновой кислоты, т. е. на 196; ции, уменьшается он при омоложении популя-
ции молекул гемоглобина, что бывает при актив-
в связи с тем что молекулярные массы глюкуро-
новой и идуроновой кислот одинаковы, расчеты ном синтезе гемоглобина, н а п р и м е р при регене-
совпадают. Для вычисления коэффициента рации после кровопотерь.
К/О количество гексуроновых кислот, опреде- Методы определения. Для определения
ленное карбазоловым методом, делят на гликозилированного гемоглобина предложено
их количество, определенное орциновым ме- много способов, включающих хроматографию
тодом. или электрофорез на различных фазах. Хими-
ческие методы заключаются в том, что связь
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Выведение между молекулой белка и моносахаридным
гексуроновых кислот у детей 10—15 лет состав- остатком разрушается гидролизом и освободив-
ляет 5—10 мг/л, у взрослых 2,4—3,9 мг/л, или шиеся молекулы моносахарида определяются по
около 2 мг на 1 г креатинина. Коэффициент цветной реакции. Результаты определения во
К/О в норме близок к единице. многом зависят от выбранного метода. Наиболее
точными в настоящее время считаются хромато-
Л и т е р а т у р а . Меркурьева Р. В., Гу-
графические методы, но они трудоемки и тре-
сев М. Р. Сравнительная оценка методов опре-
деления гликозаминогликанов мочи.— Лаб. де- буют специальной аппаратуры и реактивов.
Поэтому в настоящем справочнике приводится
ло, 1974, № 3, с. 162— 166; DiFerrante N., Rich С.
относительно менее точный х и м и ч е с к и й метод,
The d e t e r m i n a t i o n of acid aminopolysaccharide in
который, однако, проще и может быть выполнен
urine.— J. Lab. and C l i n . Med., 1956, vol. 48, № 3,
в КДЛ.
p. 491—499; Dische Z. A specific color reaction
for glucuronic acid.— J. Biol. Chem., 1947, Метод по реакции с тиобарбитуровой кисло-
vol. 71, p. 725—730. той. П р и н ц и п . Эритроциты отмываются от
белков плазмы и глюкозы; содержащийся в них
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Увеличение Гликозилированный гемоглобин гидролизуется
содержания в моче гексуроновых кислот бывает нагреванием со щавелевой кислотой, при этом из
при приобретенных заболеваниях, поражающих остатков моносахарида образуется 5-оксиметил-
соединительную ткань,— ревматизме, склеро- фурфурол, количество которого определяется по
дермии. Уменьшение коэффициента К/О в этом цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой.
случае характерно для более тяжелых, деструк- Одновременно определяют концентрацию гемо-
тивных процессов. Значительное увеличение глобина в гемолизате, результаты выражают
имеет место также при врожденной патологии — процентами молекул гемоглобина, которые
мукополисахаридозах; в этом случае увеличение гликозилированы.
коэффициента К/О характерно для болезни Реактивы. 1. Кислота щавелевая,
Гурлера, а уменьшение этого коэффициента — 0,5 моль/л: растворяют 22,5 г Н 2 СгО 4 в 0,5 л
для болезни Хантера. воды. Реактив стоек. 2. Кислота щавелевая,

238
0,2 моль/л: готовят из 0,5 моль/л, смешивая в кювете с длиной оптического пути 1 см при
40 мл реактива Г и 60 мл воды. 3. Трихлор- длине волны 443 нм против холостого опыта,
уксусная кислота, 400 г/л (40%); хранят в окраска стабильна на протяжении по крайней
мере 2 ч.
холодильнике. 4. Натрия хлорид, 9 г/л (изото-
нический раствор). 5. Тиобарбитуровая кислота, На всю серию определений ставят один
50 ммоль/л: растворяют 0,72 г тиобарбитуровой холостой опыт. Для этого смешивают остатки
кислоты примерно в 80 мл воды, доводят рН до нескольких гемолизатов и из верхнего слоя
6,0, добавляя 1 н. едкий натр; переливают в мер- отбирают 1 мл, в нем проводят гидролиз и
ную колбу и доводят объем водой до 100 мл. осаждение белков трихлоруксусной кислотой;
6. Реактивы, необходимые для определения так же как и в опыте, отбирают 1,5 мл надоса-
гемоглобина в гемолизате . 7. Калибровочный дочной жидкости, но к ней добавляют вместо
раствор 5-оксиметилфурфурола: 1 2 6 м г неокра- раствора тиобарбитуровой кислоты 0,5 мл воды.
шенного препарата растворяют в 100 мл Смесь инкубируют вместе с пробами 30 мин при
0,25 моль/л раствора щавелевой кислоты; полу- 40 °С.
чается раствор, содержащий 10 ммоль/л. Его Для построения калибровочного графика к
разводят в 100 раз тем же раствором щавелевой 1 мл калибровочного раствора, содержащего
кислоты; получается раствор с концентрацией 5-оксиметилфурфурол в концентрации 12,5—
100 мкмоль/л. Из него путем соответствующего 100 мкмоль/л, добавляют 0,5 мл воды и 1 мл
разведения 0,25 моль/л щавелевой кислотой раствора трихлоруксусной кислоты, из пробы
готовят серию калибровочных растворов с кон- отбирают 1,5мл, к которым добавляют 0,5мл
центрациями 12,5—100 мкмоль/л. Хранят в раствора тиобарбитуровой кислоты и ставят
замороженном состоянии при —20 °С. Вместо цветную реакцию, и н к у б и р у я на водяной бане
калибровочного раствора 5-оксиметилфурфуро- при 40 °С в течение 30 мин, так же как и в основ-
ла можно использовать растворы фруктозы, ном опыте. Калибровочные пробы фотометри-
которые готовят точно так же, только для исход- руют против холостой калибровочной пробы,
ного раствора с концентрацией 10 ммоль/л в которую вместо калибровочного раствора
берут 180 мг фруктозы, которые растворяют 5-оксиметилфурфурола берут 1 мл раствора ща-
в 100 мл раствора щавелевой кислоты велевой кислоты 0,25 моль/л.
0,25 моль/л. Для выполнения расчета сначала вычисляют
содержание гликозилированного гемоглобина в
Х о д о п р е д е л е н и я . Кровь для исследо-
1 л эритроцитов, для этого содержание 5-окси-
вания берут, используя в качестве антикоагу-
метилфурфурола, вычисленное по калибровоч-
лянта этилендиаминтетрауксусную кислоту или
ному графику, умножают на 15 (разведение
ее соли. В 10 мл изотонического раствора хлори-
при получении гемолизата). Затем вычисляют
да натрия выливают 0,3—0,5 мл цельной крови,
содержание гемоглобина в той же эритроцитяр-
перемешивают и центрифугируют. Надосадоч-
ную жидкость удаляют, к осадку эритроцитов ной массе, умножая содержание его в гемолиза-
те на 15; чтобы перевести полученный результат
снова добавляют 10 мл изотонического раствора
хлорида натрия, перемешивают и снова центри- в ммоль/л, его делят на 64. Чтобы количество
гликозилированного гемоглобина выразить в
фугируют. Отмытые эритроциты могут хранить-
ся в ожидании анализа при —4 °С до 15 дней. молярных процентах, его содержание в эритро-
Взвесь плотноупакованных эритроцитов в цитарной массе, выраженное в ммоль/л, делят
на содержание гемоглобина в тех же единицах
количестве 0 , 1 м л переносят в 1 , 4 м л воды
и перемешивают, в растворе определяют гемо- и умножают на 100. Для расчета можно вос-
пользоваться формулой:
глобин любым методом. При этом надо иметь
в виду, что концентрация гемоглобина в раство-
ре примерно в 7 раз меньше, чем в цельной крови,
т. е. около 20 г/л. Результаты выражают в мо-
лях на 1 л. где Гли-НЬ — содержание оксиметилфурфурола
в гемолизате ( м м о л ь / л ) ; НЬ — содержание
К 1 мл гемолизата добавляют 0,5 мл щаве-
гемоглобина в гемолизате ( г / л ) .
левой кислоты 0,5 моль/л и закрывают пробирку
плотной резиновой пробкой, в которую вставле-
П р и м е ч а н и е . В данном методе после
на тонкая игла для инъекций. Закрытую пробкой
гидролиза и осаждения белков трихлоруксус-
пробирку ставят на кипящую водяную баню и
ной кислотой раствор оказывается слегка окра-
через 10 мин вынимают иглу, а плотно закрытую
шенным, поэтому вводят специальную холо-
пробирку продолжают нагревать при 100 °С
стую пробу. Ее оптическая плотность очень
еще 5 ч. После этого охлаждают в ледяной воде
мало варьирует от одного гемолизата к дру-
и добавляют I мл охлажденной на льду трихлор-
гому, поэтому можно ставить только одну
уксусной кислоты. Тщательно перемешивают и
пробу на всю серию.
осадок отделяют центрифугированием в течение
10 мин при l000g. К 1,5мл надосадочной жид- 'Согласно данным автора метода, содержание
кости добавляют 0,5 мл раствора тиобарбитуро- 5-оксиметилфурфурола в калибровочном растворе
вой кислоты и помещают на 30 мин в водяную может быть рассчитано по формуле:
баню при 40 °С, после этого фотометрируют


где Е 443 — оптическая плотность при длине
волны 443 нм.
См. с. 107.

239
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Содержа- формамида. 4. 5 % трихлоруксусная кислота
ние гликозилированного гемоглобина, опреде- (0,3 н . ) .
ленное этим методом, 4,5—6,1 молярных %, Х о д о п р е д е л е н и я . 0,02 м л крови выли-
коэффициент в а р и а ц и и методики, по данным вают в 1 мл 5 % трихлоруксусной кислоты, через
авторов, 5,7 %. несколько минут центрифугируют. К 0,2 мл
безбелкового фильтрата прибавляют 0,1 мл
Л и т е р а т у р а . Standefer J. С., Eaton R. Р. смеси медного купороса и фосфорной кислоты
Evolution of colorimetric method for d e t e r m i n a - и 2,5 мл концентрированной серной кислоты.
Энергично встряхивают и точно через 3 мин ста-
tion of glycosilated hemoglobin.— C l i n . Chem.,
1983, № 1, vol. 29, p. 135—137. вят ровно на 3 мин в кипящую водяную баню,
затем еще 3 м и н охлаждают в ледяной воде.
Добавляют 1 каплю раствора параоксидифени-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Количество
ла в диметилформамиде, эта капля должна
гликозилированного гемоглобина — важный по-
сразу попасть в центр пробирки; встряхивают
казатель эффективности лечения диабета. Чем
и оставляют стоять 10 мин при комнатной темпе-
ближе к норме его содержание, тем лучше
ратуре. После этого нагревают на кипящей
подобрана терапия.
водяной бане 1 ' / 2 М и н , охлаждают в воде и
фотометрируют при длине волны 565 нм.
Одновременно ставят холостой опыт, в кото-
5.5.7. Молочная кислота рый вместо безбелкового фильтрата берут 5 %
раствор трихлоруксусной кислоты, и калибро-
Метод по реакции с параоксидифенилом. вочные опыты, в которые берут растворы три-
П р и н ц и п . Из молочной кислоты в присут- хлоруксусной кислоты, содержащие в 0,2 мл
ствии серной, фосфорной кислот и солей меди 2—20 нмоль молочной кислоты или молочно-
образуется уксусный альдегид, который, реаги- кислого л и т и я ; их обрабатывают так же, как
руя с параоксидифенилом (С 6 Н 5 С 6 Н 4 ОН), дает опытные. Окраска калибровочной пробы, в кото-
фиолетово-окрашенные продукты. Реакция рую взято 2 нмоля молочной кислоты, соответ-
очень чувствительна, поэтому надо строго вы- ствует пробе с содержанием 0,5 ммоль/л; соот-
держивать все условия выполнения исследова- ветственно окраска пробы, содержащей 20 нмоль,
ния. соответствует концентрации 5 ммоль/л.
Р е а к т и в ы . 1 . Концентрированная серная
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В хорошо
кислота, выдерживающая пробу Саваля. От ее
артериализованной крови содержание молочной
качества зависит возможность выполнения кислоты должно быть ниже 1 ммоль/л.
анализа, иногда качество кислоты можно улуч-
Л и т е р а т у р а . Балаховский И. С., Нато-
шить, нагревая ее и по к а п л я м добавляя в
чин Ю. В. Проблема космической биологии.—
нагретую кислоту перекись водорода. 2. Смесь М.: Наука, 1973, т. X X I I , с. 32.
из 3 г медного купороса (CuSO 4 -5H 2 O) и 9 мл
ортофосфорной кислоты. Должен образоваться Клиническое значение. Любая
форма гипоксии — при наркозе, физической
гомогенный раствор, на что уходит некоторое
нагрузке, местном нарушении кровообраще-
время. 3. 1,5 % раствор параоксидифенила
ния — приводит к увеличению содержания мо-
(С 6 Н 5 С 6 Н 4 ОН) в диметилформамиде. Раство-
лочной кислоты в крови.
ряют 15 мг параоксидифенила в 1 мл диметил-



5.6. ЛИПИДЫ
протеидов низкой плотности (LDL), которые
Липиды нерастворимы в воде, поэтому
содержат апопротеиды г р у п п ы В, при электро-
в плазме крови они присутствуют только в
форезе попадают главным образом в (3-полосу.
составе липопротеидов, которые образуют устой-
Самые мелкие частицы у липопротеидов высо-
чивые коллоидные растворы и по многим свой-
кой плотности (HDL), в состав которых входят
ствам близки к белкам. Для каждого липопро-
апопротеиды А, при электрофорезе они попада-
теида специфична его белковая часть — апо-
ют в а-полосу.
протеид, которая и определяет свойства ком-
плекса в целом и его клинико-физиологическое Поскольку современная лабораторная диаг-
ностика не располагает простыми и надежными
значение. Л и п и д н а я часть менее специфична,
так как разные липопротеиды содержат одни методами количественного определения индиви-
и те же липидные вещества, но в разных соотно- дуальных липопротеидов по их апопротеидам,
шениях. Исследовав липидный состав плазмы, приходится использовать косвенные методы;
можно лишь приблизительно оценить ее лиио- электрофоретическое исследование, осаждение
протеидный состав. гепарином и определение содержания отдельных
Различают три группы, или семейства, липо- липидов.
протеидов. Наиболее крупные частицы у хило- В плазме крови человека присутствуют
микронов и липопротеидов очень низкой плот- четыре основных класса липидов: 1) холестерин
ности ( V L D L ) , они богаты триглицеридами, и его эфиры; 2) триглицериды; 3) фосфолипиды;
содержат апопротеиды, обозначаемые л а т и н - 4) неэтерифицированные ж и р н ы е кислоты
ской буквой С. Менее крупные частицы у липо- (НЭЖК). Первые три класса веществ образуют

240
чивость остатков ж и р н ы х кислот, образующих
комплексы с апопротеидами и входят в состав
эфиры, осложняет анализ.
липопротеидов, НЭЖК главным образом адсор-
В эритроцитах, так же как и в других клет-
бированы на альбумине. Наибольшее к л и н и -
ческое значение имеет определение холестерина ках, содержится л и ш ь свободный холестерин,
количество которого значительно отличается от
и триглицеридов — клиническое значение НЭЖК
содержания в плазме, поэтому, хотя и прослежи-
значительно скромнее; фосфолипидам крови
вается общий параллелизм между его содержа-
сейчас также не придают большого клиниче-
нием в плазме и цельной крови, практически для
ского значения.
исследования пригодна лишь плазма или сы-
Для определения холестерина используются
воротка.
обычно характерные для него цветные реакции,
Методы определения. С а м ы м точным мето-
триглицериды определяют по количеству входя-
дом определения холестерина считается фер-
щего в их состав глицерина, НЭЖК — титро-
метрическим методом, а фосфолипиды — по ментативный, основанный на действии холесте-
риноксидазы, в результате чего образуются
входящему в их состав фосфору. В настоящем
разделе рассматриваются лишь методы опреде- холестенон и перекись водорода. Оба эти
вещества могут быть определены сравнительно
ления холестерина, триглицеридов и НЭЖК;
простыми методами: холестенон — по измене-
определение фосфолипидов излагается вместе
нию светопоглощения при длине волны 240 нм,
с методами определения фосфорных соединений.
перекись водорода — теми методами, которые
Перспективен метод инфракрасной спектроско-
используются при определении глюкозы. Слож-
пии, позволяющий одновременно определять
концентрацию нескольких различных липидов. ность ферментных методов определения холесте-
Сложноэфирная связь, соединяющая остат- рина в первую очередь определяется дефицитом
ки ж и р н ы х кислот с глицерином в триглицери- соответствующих ферментов, которые трудно
очистить от каталазы, разрушающей перекись
дах и фосфолипидах, а также участвующая
в образовании эфиров холестерина, очень водорода, а также тем, что фермент активен
нестойка, она разрушается в щелочной среде, л и ш ь в отношении свободного холестерина,
а также под влиянием присутствующей в плаз- поэтому эфирносвязанный холестерин должен
ме диацилглицеролипазы, которая активируется быть предварительно гидролизован. Преиму-
гепарином, вероятно, и под действием других щество ферментного метода состоит в том, что он
гидролитических ферментов. Поэтому кровь для может быть применен непосредственно к сыво-
исследования липидов необходимо брать с со- ротке или плазме без предварительного разру-
блюдением ряда предосторожностей: лучше шения липопротеидных комплексов. В условиях
всего анализировать плазму, полученную с лаборатории лечебного учреждения можно на-
ЭДТА (трилоном Б) в качестве антикоагулянта; ладить такое определение холестерина только
получение плазмы должно проводиться по с помощью выпускаемых промышленностью
возможности на холоду, а хранение должно наборов реактивов, поэтому в справочнике эти
быть ограниченным по времени. методы не приводятся.
При окислении холестерина, так же как и при
его дегидратировании, могут образовываться
5.6.1. Холестерин и его эфиры самые разнообразные окрашенные или флюо-
ресцирующие продукты. На этом основано не-
Находящийся в тканях свободный (неэтери- сколько цветных реакций на холестерин. Из н и х
ф и ц и р о в а н н ы й ) холестерин входит в состав в аналитических целях широкое распростране-
клеточных мембран. Переходя в плазму крови, он ние получили две: Либермана — Бурхарда и
там этерифицируется, образуя сложные эфиры Златкиса—Зака. Первая из них заключается
с ж и р н ы м и кислотами, источником которых слу- в том, что в сильно кислой среде в присутствии
жит фосфатидилхолин ( л е ц и т и н ) . Реакция пере- уксусного ангидрида от холестерина отщепляет-
ся вода и образуется окрашенное в зеленовато-
этерификации ускоряется плазмаспецифическим
синий цвет соединение, содержащее несколько
ферментом фосфатидилхолинхолестеринацил-
сопряженных двойных связей, предположитель-
трансферазой, которая вырабатывается пе-
но бисхолестадиенилмоносульфоновую кислоту.
ченью. При заболеваниях печени, когда нару-
Реакция может протекать в самых разнообраз-
шена выработка фермента, количество эфиров
ных растворах, содержащих, помимо уксусного
холестерина в плазме крови уменьшается. Среди
ангидрида, уксусную и серную кислоты, а также
ж и р н ы х кислот, которые соединяются эфирной
органические растворители, л и ш ь бы среда была
связью с холестерином, больше всего линолевой
абсолютно безводной. Протеканию реакции спо-
(18:2), олеиновой (18:1) и пальмитиновой (16:0)
собствуют арилсульфоновые кислоты — сульфо-
кислот. В меньших количествах присутствуют
салициловая, паратолуенсульфоновая, диметил-
и другие жирные кислоты с 16—20 атомами угле-
бензолсульфоновая. Эфиры холестерина в этих
рода; соотношение их может сильно варьировать
условиях расщепляются и окрашивание разви-
и зависит главным образом от состава поступаю-
вается, но реакция идет медленнее, чем со сво-
щих с пищей жиров. Помимо холестерина, в
бодным холестерином. Реакция ускоряется при
организме, в частности в плазме крови, присут-
п о в ы ш е н и и температуры, я р к и й свет разрушает
ствуют в небольших количествах продукты его
окрашенные продукты. Помимо холестерина,
неполного биосинтеза и распада, растительные
ряд других родственных продуктов дает такое
стероиды из пищи, с у л ь ф и т и р о в а н н ы о производ-
же окрашивание, но в связи с тем что в биологи-
ные и т. д. Присутствие этих производных, хотя
ческих жидкостях их мало, реакция оказывается
и в небольших количествах, так же как и измен-

241
ловым спиртом быстрее и эффективнее, поэтому
достаточно специфичной для холестерина,
она рекомендована в унифицированных методах.
превосходя в этом отношении другие химические
реакции. Наиболее вероятная причина завышен- Поскольку холестерин обычно определяют в тех
ных результатов — присутствие билирубина или же случаях, что и триглицериды, желательно
гемоглобина. использовать реактив, одинаково хорошо
Другая цветная реакция, получившая широ- экстрагирующий оба вещества, например смесь
гексан—изопропиловый спирт—серная кислота.
кое распространение в медицинской практике,
называется реакцией Златкиса—Зака. Она В целом при ручной работе экстракционные
методы оказываются точнее и надежнее.
основана на том, что при окислении холестерина
хлорным железом в концентрированной серной В некоторых случаях, например при проведе-
кислоте развивается красно-фиолетовое окра- нии эпидемиологических исследований, жела-
шивание. Эта реакция в 4—5 раз чувствитель- тельно анализировать высушенный материал,
нее, чем реакция Либермана—Бурхарда, но который удобно пересылать и хранить. Для
менее специфична, поскольку более широкий этого плазму крови высушивают на фильтро-
вальных бумажках; сложность анализа в этом
круг веществ, в частности витамин А, дает такое
же окрашивание, как и холестерин. Как и в случае определяется тем, что прочность связи
холестерина с белками увеличивается и прихо-
случае реакции Либермана—Бурхарда, эфирно-
связанный холестерин дает окрашивание, но дится предварительно обрабатывать белково-
медленнее, чем свободный. липидный комплекс щелочью, которая гидроли-
зует большинство сложноэфирных связей.
Присутствующие в плазме крови эфиры
Унификация методов. Учитывая разнообра-
холестерина образуются непосредственно в
плазме в результате переноса остатков ж и р н ы х зие как возможностей, так и потребностей лабо-
кислот фосфатидилхолинов (лецитина) на сво- раторий различных лечебных учреждений,
бодный холестерин. Эта реакция ускоряется унифицировано несколько методов определения
плазмаспецифическим ферментом ЛХАТ, кото- холестерина. Для небольших лабораторий не-
рый вырабатывается печенью. При ее пораже- специализированных лечебных учреждений
подходит унифицированный в 1972 г. метод
нии синтез фермента нарушается и количество
эфиров холестерина уменьшается. Поэтому определения общего холестерина по реакции
степень этерификации холестерина имеет опре- с уксусным ангидридом, а также унифициро-
деленное клинико-диагностическое значение. ванный в 1972 г. прямой метод определения об-
Для ее определения чаще всего используют щего и эфирносвязанного холестерина по реакции
способность свободного холестерина образовы- с хлорным железом. Для более крупных лабора-
вать нерастворимые соединения с дигитонином, торий лечебных учреждений кардиологического
томатином, пиридинсульфатом и другими веще- или эндокринологического профиля более подхо-
ствами, по большей части гликозидами; исполь- дит унифицированное в 1979 г. определение
зуют также хроматографическое разделение общего и свободного холестерина по реакции
свободного и эфирносвязанного холестерина, с хлорным железом после экстракции изопропа-
существуют и так называемые кинетические нололом.
методы, которые основываются на том, что сво- Общий холестерин. Унифицированный метод
бодный холестерин образует цветное окраши- по реакции с уксусным ангидридом (метод
вание, значительно быстрее, чем его эфиры. Илька). П р и н ц и п . Присутствующий в плаз-
Для рядовых лабораторий, где работа выпол- ме или сыворотке крови холестерин и его эфиры
няется вручную, хроматографические методы дают цветное окрашивание при обработке
слишком громоздки, кинетические мало надеж- смесью уксусного ангидрида, серной и уксусной
ны, поэтому практически пригодны лишь методы кислот.
с осаждением дигитонином. При определении Р е а к т и в ы . 1. Ледяная уксусная кислота.
эфиров холестерина всегда надо иметь в виду, 2. Концентрированная серная кислота. 3. Уксус-
что эти соединения непрочные, легко гидроли- ный ангидрид. 4. Абсолютный этиловый спирт.
зуются в щелочной среде. 5. Кислотная смесь: в сухую колбу наливают
Присутствующие в плазме крови белки и 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл уксус-
пигменты мешают количественному определе- ного ангидрида, затем при постоянном переме-
нию холестерина посредством цветных реакций, шивании и охлаждении добавляют 10 мл кон-
обуславливая дополнительное окрашивание или центрированной серной кислоты. Смесь должна
мутность раствора, поэтому наиболее точные быть бесцветной или слегка желтоватой, хра-
методы предполагают выделение холестерина нить в холодильнике в темной склянке с притер-
путем экстракции различными комбинациями той пробкой. 6. Калибровочный раствор:
232 мг холестерина растворяют в 2—3 мл хлоро-
смесей этилового и изопропилового спирта,
эфира, ацетона и т. д. и омыление (гидролиз) форма и доводят до объема 100 мл абсолют-
эфиров щелочью. В последние годы, особенно ным этиловым спиртом. Приготовленный
после появления автоанализаторов, разработа- раствор содержит холестерин в концентрации
ны достаточно совершенные прямые методы, т. е. 6 ммоль/л.
без предварительного выделения холестерина Х о д о п р е д е л е н и я . К 2 , 1 м л кислотной
путем экстракции. Более старые, классические смеси медленно по стенке пробирки добавляют
методы определения холестерина предусматри- 0,1 мл плазмы или сыворотки без признаков
вали использование в качестве экстрагентов гемолиза, перемешивают встряхиванием и ста-
смесей спирт — эфир или спирт — петролейный вят на 20 мин в термостат или водяную баню при
эфир, но оказалось, что экстракция изопропи- 37 °С, затем фотометрируют в кювете с длиной
242
оптического пути 0,5см против реактива при ны 530 нм в кювете с длиной оптического пути
длине волны 625 нм. 1 см против холостого опыта, в который берут
Построение калибровочной 1,3мл уксусной кислоты, 0,05мл исследуемой
к р и в о й и р а с ч е т . К 0,05—0,2 м л калибро- сыворотки или плазмы и 1 мл концентрирован-
вочного раствора добавляют такое количество ной серной кислоты.
кислотной смеси, чтобы общий объем был 2,2 мл, Для приготовления калибровочного г р а ф и к а
перемешивают и выдерживают 20 мин при 37 "С, вместо исследуемого материала берут 0,05—
так же как и опытные пробы, а затем фотомет- 0,2 мл калибровочного раствора, к которому
рируют. Окраска калибровочной пробы, в кото- добавляют уксусную кислоту до суммарного
рую взято 0,05 мл калибровочного раствора, объема 1,35мл, а затем добавляют 1 мл цвет-
соответствует содержанию холестерина в плазме ного реактива. Проба, в которую взяли 0,05 мл
3 ммоль/л, пробы, в которую взято 0,1 мл,— калибровочного реактива, по окраске соответст-
содержанию 6 ммоль/л и т. д. вует опытной пробе с содержанием холестерина
в исследуемом материале 3 ммоль/л; проба,
П р и м е ч а н и я . 1 . Попадание воды приво-
в которую взяли 0,1 мл калибровочного раство-
дит к помутнению раствора. 2. Следы гемо-
ра, соответствует содержанию холестерина
лиза или желтушность исследуемой плазмы
6 ммоль/л и т. д. Расчет проводят по калибро-
или сыворотки служат причиной завышенных
вочному графику.
результатов. 3. Можно использовать для
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы см. табл. 4 2
фотометрии и кюветы с длиной оптического
пути 1 см, тогда количество кислотной смеси Л и т е р а т у р а . Zlatkis A., Zak В.,
удваивают, а количество исследуемого мате- Boyle A. J. Lab. C l i n . Med., 1957, v o l . 50, №2,
риала остается п р е ж н и м . p. 318; Rosenthal N. I. et al. J. Lab. C l i n . Med.,
1953, v o l . 41, p. 486.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы см. табл. 42.
Л и т е р а т у р а . Пса S. Zschr. ges. inn.
Med., 1962, В. 17, H. 2, S. 83.
5.6.2. Экстракционные методы
определения холестерина и его эфиров
Унифицированный метод по реакции с хлор-
ным железом (метод Златкис—Зака). П р и н -
ц и п . Содержащийся в плазме или сыворотке Унифицированный метод по реакции с хлор-
крови свободный и эфирносвязанный холесте- ным железом после экстракции изопропанолом.
рин окисляется хлорным железом в присутствии П р и н ц и п . Холестерин и его эфиры экстраги-
уксусной, серной и фосфорной кислот с образо- руют из плазмы или сыворотки изопропанолом.
ванием ненасыщенных продуктов, окрашенных Для определения общего содержания холестери-
в красно-фиолетовый цвет. Фосфорная кислота на он весь окисляется хлорным железом в
повышает стойкость реактива, содержащего растворе уксусной, серной и фосфорной кислот
хлорное железо. с образованием ярко окрашенных красно-
Р е а к т и в ы . 1 . Ледяная уксусная кислота. фиолетовых продуктов. Для определения сво-
Для проверки качества реактива к 2—4 мл бодного холестерина он осаждается в виде
уксусной кислоты добавляют несколько кристал- комплекса с дигитонином, осадок промывается
лов перманганата калия, перемешивают. На ацетоном и содержание холестерина опреде-
протяжении 40 м и н раствор не должен менять ляется по той же цветной реакции.
окраски. Кислоту, которая не выдерживает Р е а к т и в ы . 1 . Изопропиловый спирт (изо-
этого испытания, можно очистить, прокипятив пропанол). 2. Уксусная кислота ледяная.
с хромовым ангидридом и затем подвергнув 3. Ортофосфорная кислота; содержит 85%
перегонке. 2. Серная кислота концентрирован- Н3РО4. 4. Серная кислота концентрированная.
ная. 3. Железо хлорное FеСl 3 -6Н 2 О. 4. Орто- 5. Железо хлорное, раствор в фосфорной
фосфорная кислота; содержит 85% Н3РО4. кислоте: 2,5 г FeCI 3 -6H 2 O растворяют при
5. Раствор хлорного железа: 2,5 г хлорного нагревании примерно в 80 мл ортофосфорной
железа растворяют в 80 мл ортофосфорной кислоты, объем доводят ортофосфорной кисло-
кислоты, нагревая до полного растворения той до 100мл. 6. Цветной реактив: к 8 мл
препарата, затем охлаждают и доводят объем раствора хлорного железа осторожно при пере-
до 100 мл ортофосфорной кислотой. 6. Цветной м е ш и в а н и и приливают серную кислоту до сум-
реактив: к 8 мл раствора хлорного железа марного объема 100 мл. 7. Дигитонин, раствор
добавляют серную кислоту так, чтобы суммар- 10 г/л: 1 г дигитонина растворяют при нагрева-
ный объем был 100 мл. 7. Калибровочный нии в 50 мл этилового спирта, добавляют 50 мл
раствор холестерина в уксусной кислоте: воды и через некоторое время, после охлажде-
116 мг холестерина растворяют в 100 мл ледяной ния, фильтруют. 8. Ацетон. 9. Калибровочный
уксусной кислоты. Раствор содержит холестерин раствор: 38,7 мг холестерина растворяют в
в концентрации 3 ммоль/л. 100мл изопропанола, получают раствор, содер-
ж а щ и й 1 ммоль/л; его разводят в 5 раз изопро-
Х о д о п р е д е л е н и я . К 1,3мл уксусной
панолом, получая раствор, содержащий
кислоты осторожно добавляют 0,05 мл плазмы
или сыворотки без следов гемолиза, перемеши- 200 мкмоль/л.
Х о д о п р е д е л е н и я . К 0,2 мл исследуе-
вают, а затем добавляют 1 мл цветного реакти-
ва, хорошо перемешивают встряхиванием и мой плазмы или сыворотки добавляют при
оставляют на 30 мин при комнатной темпера- постоянном встряхивании 4,8 мл изопропанола,
туре, после чего фотометрируют при длине вол- тщательно перемешивают и через 10 м и н

243
15 мин фотометрируют при длине волны 560 нм
центрифугируют 5 мин, отсасывают надосадоч-
в кюветах с длиной оптического пути 0,5см
ную жидкость (экстракт); 1 мл экстракта
против холостой пробы, в которую берут 1 мл
используется для определения общего холесте-
изопропанола, 2 мл уксусной кислоты и 2 мл
рина, а 2 мл — для определения свободного
цветного реактива.
холестерина.
К а л и б р о в к а и р а с ч е т . Для калибров-
Для определения общего холестерина к 1 мл
ки к 1 мл калибровочного раствора добавляют
экстракта добавляют 2 мл уксусной кислоты,
2 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл цветного
тщательно перемешивают, а затем добавляют
реактива и через 10—15 м и н фотометрируют
2 мл цветного реактива, опять перемешивают и
в таких же условиях, как и опытные пробы.
оставляют стоять 10—15 мин. Фотометрируют в
При расчете количества общего холестерина
кювете с длиной оптического пути 0,5 см п р и
калибровочная проба соответствует содержанию
длине волны 560 нм против холостой пробы,
5 ммоль/л холестерина, а при расчете содержа-
в которую берут вместо экстракта плазмы 1 мл
ния свободного холестерина — 2,5 ммоль/л.
изопропанола.
Для определения свободного холестерина
Л и т е р а т у р а . Сентебова Н. А. Предло-
к 2 мл экстракта добавляют 1 мл раствора
жения по у н и ф и к а ц и и методов определения
дигитонина, закрывают пробкой и оставляют
свободного и этерифицированного холестерина
на 30 мин, после чего 10 мин центрифугируют.
в сыворотке крови.— Лаб. дело, 1976, № 6,
Надосадочную жидкость осторожно удаляют
и выбрасывают, к осадку добавляют 3 мл аце- с. 375—380; Leffler H. Amer. J. C l i n . P a t h o l . ,
1959, v o l . 31, p. 310—313.
тона, перемешивают и снова центрифугируют
5 м и н . Надосадочную жидкость удаляют и
оставляют пробирки открытыми на несколько Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Содержа-
минут для испарения остатков ацетона. К сухо- ние общего холестерина составляет 3,9—
му осадку добавляют 1 мл изопропанола и 2 мл 6,5 ммоль/л (150—250 мг в 100 мл), из н и х
уксусной кислоты, перемешивают и затем добав- 70% этерифицированный, а 30% свободный.
ляют 2 мл цветного реактива, при этом осадок Более подробная возрастная норма приведена
должен полностью раствориться. Через 10 — в табл. 40.

Т а б л и ц а 40. Верхние границы содержания холестерина в сыворотке здоровых мужчин в зависи-
мости от возраста (по данным Института кардиологии АМН СССР)
Возрастные группы (годы)
40—49 50—59
30—39
20—29
10—19 60 и более

5,84 6,18 6,54 6,88 7,22
Содержание холестерина, ммоль/л 5,5
1,82 2,21 2,71 3,27 3,94
Триглицериды, ммоль/л 1,53


К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Повышение Р е а к т и в ы . 1 . Бумага для в ы с у ш и в а н и я
содержания холестерина свидетельствует об крови. Используют хроматографическую бумагу
или беззольные фильтры. Если при постановке
угрозе развития атеросклероза; чаще всего
холестерин увеличен при II типе гиперлипо- холостого опыта выясняется, что в бумаге
протеидемии, повышается он также при диабете содержатся вещества, дающие цветную реакцию
и нефритах. Понижение 1 содержания холестери- с уксусным ангидридом, ее обрабатывают в
на чаще всего бывает при гипертиреоидизме. аппарате Сокслета на протяжении 1—2 рабочих
дней метанолом и дихлорметаном. 2. 0,3 н.
Определение холестерина в биологическом раствор едкого натра ( N a O H ) . 3. Смесь
дихлорметан-метанол 2:1. В день определения
материале, высушенном на бумаге. П р и н -
смешивают 2 объема дихлорметана и 1 объем
ц и п . При проведении эпидемиологических
метанола (метилового спирта), готовят в таком
исследований возникает необходимость пересы-
количестве, которое будет израсходовано за
лать пробы, собранные для исследования; в этом
случае удобно предварительно высушивать их I рабочий день. Вместо дихлорметана можно
брать хлороформ. 4. Кислотная смесь: готовят
на бумаге, так как это не только упрощает
в день определения путем смешивания 2,5 мл
пересылку, но и обеспечивает консервацию.
концентрированной серной кислоты, 25 мл уксус-
Пробы биологического материала — кровь,
ного ангидрида и 50 мл хлороформа. 5. Кали-
плазму, сыворотку — наносят на специально
отмытую фильтровальную бумагу и высушивают бровочный раствор, 3 ммоль/л. Готовят, раство-
ряя 58 мг холестерина в 50 мл хлороформа.
на воздухе. Липопротеидный сгусток высушен-
Х о д о п р е д е л е н и я . Н а сухую фильтро-
ного материала растворяют в щелочи, затем
вальную бумагу наносят микропипеткой иссле-
разделяют в смеси хлороформ—метанол на
липидную и водорастворимую фракции. Липид- дуемый материал так, чтобы определенный
участок б у м а ж к и был равномерно смочен, и
ную фракцию выпаривают и в сухом остатке
дают высохнуть на воздухе. На краю бумаги,
определяют холестерин по цветной реакции
не смоченной плазмой, к а р а н д а ш о м записы-
с у к с у с н ы м ангидридом. В процессе обработки
вают номер пробы, фамилию и другие паспорт-
щелочью эфиры холестерина разрушаются.

244
электрофоретической подвижностью в и пре-в
ные данные. Проба высыхает на воздухе
осаждаются гепарином в присутствии солей
обычно за 2—3 ч, после чего ее можно пересы-
лать по почте, упаковывать в конверт и т. д. м а р г а н ц а и удаляются центрифугированием,
при этом хиломикроны всплывают, образуя
Ножницами аккуратно вырезают пятно высу-
пленку. В растворе остаются только а-липо-
шенного биологического материала, удаляя
протеиды, в которых содержание холестерина
поля, на которых сделаны записи, б у м а ж к у
определяют любым из описанных методов.
разрезают на несколько кусочков и кладут в
Р е а к т и в ы . 1 . Марганца хлористого
колбочку или стаканчик, куда наливают также
1 моль/л раствор: 197,90 г МnСl 2 -4Н 2 О раство-
1,5мл 0,3 н. NaOH и оставляют на несколько
ряют в воде и объем доводят в мерной колбе до
часов, желательно на ночь. Если исследуют
1 л. Препарат гигроскопичен, поэтому лучше
кровь, полноту с м ы в а н и я легко контролировать
сразу приготовить большое количество раство-
по виду бумажки; если исследуется сыворотка,
ра, который разливают в несколько флаконов и
то конец растворения сгустка не виден,
используют по мере надобности. 2. Гепарин —
поэтому лучше оставить ее стоять на большее
время. После этого добавляют 15 мл смеси фармакопейный раствор, содержащий 5000 ЕД
в 1 мл. Разные препараты несколько отличаются
метанол—дихлорметан или метанол—хлоро-
по осаждающим свойствам, поэтому рекомен-
форм, при этом образуется однородный раствор,
дуют сделать запас из одной партии и всегда
который перемешивается л е г к и м и п о к а ч и в а н и я -
им пользоваться.
ми. Для расслоения добавляют 3 мл воды и
слегка перемешивают стеклянной палочкой, Х о д о п р е д е л е н и я . В пробирку, уста-
внизу оказывается бесцветная неводная фаза, новленную в штативе на ледяной бане, поме-
а наверху водная, которая может быть окрашен- щают сначала 1 мл исследуемой плазмы или
ной, если высушивалась кровь или гемолизиро- сыворотки, затем 0,04 мл препарата гепарина,
ванная сыворотка. Нижнюю фазу отсасывают перемешивают, после чего добавляют 0,04 мл
тонкой пипеткой, выпаривают в токе воздуха, 1 М раствора м а р г а н ц а хлорида, снова тща-
к сухому остатку прибавляют 3 мл кислотной тельно перемешивают и оставляют стоять на
смеси и оставляют в темноте на 30 мин, после льду еще на 30 м и н . Центрифугируют 30 м и н
при 2500 об/мин желательно при температуре
чего фотометрируют при длине волны 625 нм.
4—6 °С. Пробирки из центрифуги надо выни-
Одновременно ставят холостой опыт, в кото-
мать осторожно, так как легко взмутить осадок.,
рый вместо высушенного материала берут кусоч-
Н и ж н и й слой содержит осажденные в-липо-
ки той же самой фильтровальной бумаги, на
которой высушивали плазму; обычно исполь- протеиды, верхний — растворенные а-липопро-
зуют обрезки от фильтров. Если холостой опыт теиды, над которым может плавать еще кольцо
хиломикронов. Пипеткой с тонким носиком
дает заметную величину порядка 0,05—0,1,
осторожно отсасывается слой, содержащий
надо фотометрировать на трех длинах волн (525,
а-липопротеиды, который используют для опре-
625 и 725 нм) и результаты рассчитывать по
деления холестерина любым из описанных выше
формуле:
методов.
Если сыворотка хилезная, сверху может
быть большой слой хиломикронов, из-под кото-
В Противном случае достаточно фотометриро- рого трудно взять пробу. В этом случае реко-
вать против холостого опыта.
мендуют повторить определение, взяв несколько
Построение калибровочной
миллилитров сыворотки и соответственно увели-
к р и в о й и р а с ч е т . Для построения калибро- чив другие реактивы, при этом прозрачный
вочной кривой в три пробирки вносят 0,1; 0,2 слой оказывается больше и из него легче взять
и 0,3 мл калибровочного раствора, содержащего пробу.
3 ммоль холестерина в 1 л хлороформа, т. е.
Калибровку проводят так же, как и в методе
в первую пробирку берут 0,3 мкмоля, во вторую
определения холестерина, с той разницей, что
0,6 мкмоля, а в третью 0,9 мкмоля. Калибровоч-
содержание холестерина а-липопротеидов зна-
ные растворы выпаривают и ставят цветную чительно ниже, чем общего, поэтому калибровоч-
реакцию так же, как и в опыте. По полученным
ный раствор должен соответствовать содержа-
точкам строят калибровочную кривую, учиты-
нию 1—2 ммоля холестерина в 1 л.
вая, что первая точка соответствует содержа-
Нормальные величины. 0,9—
нию холестерина в крови 3 ммоль/л, вторая —
1,9 ммоль/л.
6 ммоль/л, а третья — 9 ммоль/л.
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Содержа-
Нормальные величины:
ние холестерина а-липопротеидов в крови здоро-
2,5—4 ммоль/л (100—160 мг в 100 мл) в цельной вых людей мало меняется с возрастом и не
крови. подвержено колебаниям вследствие различных
Л и т е р а т у р а . Балаховский И. С., Нато- других п р и ч и н . Величины ниже 0,9 ммоль/л
чин Ю. В. Проблемы космической биологии.— свидетельствуют о нарушении липидного обмена
М.: Наука, 1973, т. 22, с. 36—56. и угрозе развития атеросклероза. Повышение
содержания холестерина а-липопротеидов, к а к
5.6.3. Холестерин а-липопротеидов и .повышение общего холестерина в результате
увеличения этой фракции, является доброка-
Определение после осаждения в-липопротеи- чественным состоянием.
Л и т е р а т у р а . Титов В. Н., Брснер Е. Д.,
дов гепарином в присутствии солей марганца.
Задоя А. А. и др. Метол и д и а г н о с т и ч е с к а я
Принцип. Липопротеиды, обладающие

245
значимость исследования содержания холесте- Унификация методов. В 1974 г. был унифи-
рина в а-липопротеидах.— Лаб. дело, 1979, цирован широко распространенный в то время,
№ 1, с. 36—41. но трудоемкий метод определения триглице-
ридов, предложенный Карлсоном. Трудоемкость
его была вызвана тем, что липидный экстракт,
содержащий Триглицериды, очищался адсорб-
5.6.4. Триглицериды
цией на кремниевой кислоте от фосфолипидов,
а формальдегид, образовавшийся при окисле-
Триглицериды или нейтральные жиры пред-
нии глицерина, определялся по реакции с хро-
ставляют собой сложные эфиры глицерина и
мотроповой кислотой, которая идет только в
трех остатков жирных кислот, чаще всего
определенных условиях. Разработанные затем
с 16 или 18 атомами углерода. Точный состав
методы избирательной экстракции триглицери-
жирнокислотных остатков может колебаться
дов позволяют за один этап получать доста-
в определенных пределах и зависит главным
точно чистый экстракт. Метод упростился так-
образом от характера питания. Поэтому говорят
же благодаря использованию менее капризной
о триглицериде не как об индивидуальном
реакции на формальдегид с ацетилацетоном.
химическом веществе, а как о группе родствен-
На этом основан метод, унифицированный
ных соединений. Это осложняет выражение
результатов анализа в весовых единицах, т. е. в 1979 г.
в г/л или м г / 1 0 0 м л , так как существующие Условия взятия материала для исследова-
аналитические методы позволяют определять ния. В связи с тем что Триглицериды — нестой-
количество молекул триглицеридов, но молеку- кие соединения, легко разрушающиеся под
л я р н а я масса в разных образцах может быть влиянием сывороточных ферментов, исследова-
несколько отличной. Другая аналитическая ние предпочтительнее делать в плазме, получен-
сложность вызвана нестойкостью сложноэфир- ной с использованием трилона, так как гепарин

<<

стр. 13
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>