<<

стр. 14
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

ной связи, которая легко распадается в щелоч- тоже активирует липазу. Хранение пробы не-
ной среде, а также под действием ферментов сколько дней, особенно если туда попадут
сыворотки или микроорганизмов. микроорганизмы, также может быть причиной
заниженных результатов.
Методы определения. Не существует х и м и -
Унифицированный метод по реакции с аце-
ческих реакций, специфичных для молекулы
тилацетоном после экстракции смесью гептана
триглицерида в целом; их количество опреде-
и изопропилового спирта. П р и н ц и п . Три-
ляют чаще всего по содержанию глицерина,
глицериды экстрагируются смесью гептана и изо-
который образуется при щелочном или фермен-
тативном гидролизе. Этот путь связан с той труд- пропилового спирта, в которую переходят толь-
ностью, что глицерин входит также в состав ко неполярные липиды, а более полярные
фосфолипидов, поэтому определение должно фосфолипиды остаются в водной фазе. Тригли-
начинаться с выделения фракции нейтрального цериды омыляются (гидролизуются) щелочью,
жира, свободной от фосфолипидов, или нужно глицерин окисляется йодной кислотой до форм-
проводить гидролиз очень специфическим фер- альдегида, который определяется по цветной
ментом, который бы отщеплял глицерин только реакции с ацетилацетоном.
от триглицеридов, но не от других соединений. Р е а к т и в ы : 1. Гептан. 2. Изопропило-
Очень точный и удобный ферментативный вый спирт .(изопропанол) 3. 0,08 н. серная
метод заключается в том, что фосфоэнолпиро- кислота (примерно 2,2 мл концентрированной
виноградная кислота в присутствии АДФ и H 2 SO 4 на 1 л воды). 4. Едкое кали, 6,25 моль/л:
ферментов глицерокиназы и пируваткиназы фос- 17,8 г K.ON растворяют в 50 мл, осторожно
форилирует глицерин, при этом освобождается добавляя гранулы щелочи в воду, охлаждая и
пировиноградная кислота, количество которой перемешивая. 5. Уксусная кислота, 50 г/л.
определяют по ее способности окислять НАД-Н 6. Йодная кислота: растворяют 0,6 г HIO4-2H2O
в присутствии лактатдегидрогеназы, при этом (перйодная кислота) в 100 мл 5 % уксусной
поглощение света с длиной волны 330—340 нм кислоты. 7. Аммония ацетат 2 моль/л: раство-
падает. Для реализации этого метода необхо- ряют 154 г ацетата аммония во воде, объем
димы три фермента и три кофактора, поэтому доводят до 1 л. 8. Ацетилацетоновый реактив:
он может быть налажен только в тех лаборато- 1,5 мл ацетилацетона (СН 3 СОСН 2 СОСН 3 )
риях, где имеются соответствующие наборы разводят раствором уксуснокислого аммония до
реактивов заводского изготовления. суммарного объема 200 мл. Хранят в сосуде
из темного стекла. 9. Калибровочный раствор
Химические методы основаны также на оп-
триолеина, 2 ммоль/л. Содержит 170 мг три-
ределении глицерина, который окисляют йод-
олеина в 100 мл изопропилового спирта. Мож-
ной кислотой до формальдегида, способного
но использовать и другие калибровочные раст-
давать темно фиолетовое окрашивание с хро-
мотроповой кислотой или желтое с ацетилаце- воры, перечисленные в примечании.
тоном. Последняя реакция имеет то удобство,
что образующееся вещество можно определять П р и м е ч а н и е . Если использовать для
не только спектрофотометрически, но и флюоро- калибровки раствор триолеина в изопро-
метрически. Заслуживает внимания и весьма пиловом спирте, то после экстракции и рас-
перспективный метод, основанный на измере- слоения объем верхней фазы в калибровоч-
нии светопоглощения в инфракрасной области; ных пробах оказывается больше, чем в
его преимущество — можно одновременно опре- опытных, что приводит к заниженным
делять несколько липидных соединений. результатам анализа. Чтобы избежать этой
246
ошибки, рекомендуют к а л и б р о в о ч н ы й рас- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Наиболь-
твор готовить по следующей п р о п и с и : 510 мг шее з н а ч е н и е имеет определение триглицеридов
триолеина растворяют в 100 мл изопро- для т и п и р о в а н и я эссенциальных гиперлипиде-
пилового спирта, получается исходный м и й , II частности дифференцирования типа ПА
калибровочный раствор с содержанием ( и з о л и р о в а н н а я гиперхолестеринсмия) и ПБ
6 ммоль/л, из которого готовят по мере не- (увеличение содержания и холестерина, и три-
обходимости рабочий калибровочный рас- глицеридов). Кроме того, повышение содержа-
твор с содержанием 1,2 ммоль/л, разводя 1 ния триглицеридов бывает при нефротическом
объем исходного калибровочного раствора синдроме, переломах костей, гипотиреозе и ал-
4 объемами воды. коголизме, но большого диагностического зна-
чения при этих заболеваниях не имеет. В прак-
Х о д о п р е д е л е н и я . К 0,5 мл сыворот-
тическом отношении надо всегда п о м н и т ь о
ки или п л а з м ы добавляют 2 мл гептана, 3,5 мл
существовании алиментарной гипертриглицери-
изопропилового спирта и 1 мл 0,08 н. серной
демии.
кислоты, перемешивают и через 5 мин центри-
фугируют. Из верхнего (гептанового) слоя от-
бирают 0,4 мл, добавляют 2 мл изопропилового 5.6.5. Инфракрасная
спирта и 1 каплю 6,25 н. КОН. Перемешивают, спектрофотометрия липидов
закрывают пробкой и нагревают на водяной
бане 10 мин при 70 °С. После о х л а ж д е н и я добав-
П р и н ц и п . Холестерин, его эфиры и
ляют 0,2 мл перйодатного реактива и 1 мл аце-
т р и г л и ц е р и д ы экстрагируются из исследуемой
тилацетонового реактива, после перемешивания
плазмы или сыворотки смесью гексан — изопро-
снова закрывают пробкой и нагревают еще
пиловый спирт — серная кислота, в которую
10 м и н при 70 °С. Развивается желто-зеле-
фосфолипиды не переходят. Растворитель вы-
ное окрашивание, интенсивность которого изме-
паривают, а исследуемые вещества растворяют
ряют, фотометрируя при длине волны 425 нм
в четыреххлористом углероде; и н ф р а к р а с н ы й
в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см
спектр этого раствора снимается. Все липиды
против холостой пробы, которую ставят так же,
имеют характерные пики поглощения в инфра-
как и опытную, но вместо исследуемого мате-
красной области спектра, поэтому не требуется
р и а л а берут 0,5 мл воды.
проведения дополнительных х и м и ч е с к и х реак-
Калибровочную пробу ставят так же, как и
ций. Пики поглощения триглицеридов и холе-
опытную, но вместо сыворотки или плазмы бе-
стерина пересекаются, поэтому расчет проводят
рут 0,5 мл калибровочного раствора и 0,5 мл
по э м п и р и ч е с к и подобранным ф о р м у л а м , кото-
воды; развивающаяся окраска соответствует
рые позволяют исключать в з а и м н у ю интерфе-
окраске опытной пробы, в которую взята плаз-
ренцию определяемых веществ.
ма с содержанием триглицеридов 2 ммоль/л.
Р е а к т и в ы . 1 . Гексан. 2 . Изопропиловый
Расчет проводят по правилу пропорций или по
спирт (изопропанол). 3. Смесь гексан — изо-
калибровочному г р а ф и к у . Если используется
пропиловый спирт — 0,1 н. серная кислота
калибровочный раствор, уже содержащий воду
6 : 9 : 1 . Готовят в день определения, смешивая
(см. п р и м е ч а н и е ) , то при постановке калибро-
6 объемов гексана, 9 объемов изопропилового
вочного опыта берут 0,5 мл рабочего калибро-
спирта и 1 объем 0,1 н. серной кислоты. 4. Че-
вочного раствора, а воду не добавляют.
тыреххлористый углерод. 5. Натрия хлорид.
Л и т е р а т у р а . Gottfried S. P., Rosenberg Х о д о п р е д е л е н и я . К 0,2 м л иссле-
В. C l i n . Chem. 1973. vol. 19, № 9, p. 1077—1078. дуемой сыворотки или плазмы крови прибав-
ляют 2 мл экстрагирующей смеси и энергично
Примечание. При отсутствии три-
встряхивают. Добавляют в пробирку щепотку
олеина или трибутирина для калибровки
натрия хлорида, при этом на дне образуется,
можно использовать растительное масло,
густая белая масса, над которой плавает про-
п р и н и м а я , что образующие его триглицери-
зрачная жидкость. Верхний слой осторожно
ды имеют ту же молекулярную массу, что и
переливают в сухую пробирку, где выпаривают
триолеин. Можно проводить калибровку, ис-
в токе азота или воздуха. Сухой остаток может
пользуя раствор глицерина в этаноле, в этом
храниться неограниченно долго. Его раство-
случае его непосредственно добавляют к
ряют в 1 мл четыреххлористого углерода и
щелочному раствору едкого кали.
снимают спектр поглощения в инфракрасной
Л и т е р а т у р а . Carlson L. A. Atheroscle- области в кювете с длиной оптического пути
rosis Research, I 1963, vol. 3, p. 334—336.— Лаб. 1 мм против аналогичной кюветы, заполненной
дело, 1976, № 6, с. 375—376. четыреххлористым углеродом. При работе на
приборе ф и р м ы «К. Цейс-10» в диапазоне
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В целом
1000—2000 с м ˜ ' работают с п р и з м о й NaCL,
н о р м а л ь н о й величиной содержания триглицери-
а в диапазоне 2000—3500 с м - 1 с призмой LiF.
дов в плазме крови считают 0,55—1,65 ммоль/л
Расчет проводят по эмпирической формуле:
(50—150 мг в 100 м л ) , но, так же как и для
холестерина, верхняя граница нормальных ве-
личин у мужчин зависит от возраста, особен-
ностей ж и з н и и т. д. В качестве ориентира верх-
ней границы возрастной нормы для м у ж ч и н
можно п р и н я т ь данные Института кардиоло-
гии АМН СССР (см. табл. 42).

247
где ХОЛ и ТГ — концентрации холестерина и центрифугируют. Отбирают 1,8 мл верхней фа-
триглицеридов (моль/л) в исследуемой плазме зы и добавляют к ней 0,5 мл раствора дифенил-
или сыворотке, а Е — величины экстинкции при карбазида, через 15 мин фотометрируют п р и
соответствующих волновых числах, выражен- длине волны 550 нм в кюветах с длиной опти-
н ы х в см (читается «обратные сантиметры»). ческого пути 1 см против холостого опыта, в
П р и работе на других т и п а х приборов или который берут 1,8 мл экстракционной смеси,
переюстировке прибора формулу для расчета к которой добавлено 0,5 мл Дифенилкарбазида.
желательно проверить путем сопоставления Расчет проводят по калибровочной кривой,
результатов вычисления по ней с результата- для построения которой используют рабочие
ми химического определения холестерина и три- калибровочные растворы, содержащие 400—
глицеридов в гексан-изопропаноловом экстрак- 1000 мкмоль ж и р н о й кислоты в 1 л хлорофор-
ма; 0,05 мл рабочего калибровочного раствора
те.
обрабатывают так же, как и исследуемую плаз-
му или сыворотку.
5.6.6. Неэтерифицированные
жирные кислоты
П р и м е ч а н и е . Основной источник оши-
Колориметрический метод определения мед- бок при определении неэтерифицированных
ных солей. П р и н ц и п . При нейтральных и ж и р н ы х кислот (НЭЖК), или, как их иногда
называют, свободных жирных кислот
слабощелочных значениях рН медные соли
ж и р н ы х кислот экстрагируются из водных рас- (СЖК), связан с тем, что в процессе полу-
творов р а з л и ч н ы м и неводными растворителями ч е н и я сыворотки или при ее хранении проис-
ходит гидролиз нейтральных жиров (тригли-
(в данном случае смесью хлороформ — геп-
церидов) и фосфолипидов и появляется
тан — метанол), в то же время в этих условиях
ионы меди остаются в водной фазе. Поэтому дополнительное количество НЭЖК, ко-
количество меди, перешедшее в органическую торые неотличимы от уже существовавших
фазу, отражает содержание неэтерифицирован- в плазме. Поэтому желательно исследовать
ных (свободных) ж и р н ы х кислот (НЭЖК). не сыворотку, а плазму, полученную на хо-
Медь определяют по цветной реакции с 1,5-ди- лоду без гепарина.
фенил-карбазидом.
Р е а к т и в ы . 1. Хлороформ. 2. Гептан. Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы неэтерифи-
3. Метиловый спирт (метанол). 4. Экстракцион-
цированных ж и р н ы х кислот в плазме: 400—
ная смесь. Смешивают 250 мл хлороформа, 800 мкмоль/л.
250 мл гептана и 12 мл метилового спирта.
Л и т е р а т у р а . Прохоров М. Ю., Тиу-
5. Меди нитрат 0,5 моль/л: готовят растворе-
нов М. П., Шакалис Д. А.—Лаб. дело, 1977,
нием 24, 16 г С u ( N О 3 ) 2 - З Н 2 О в 200 мл воды.
№ 9, 535—536.
6. Триэтаноламин, 1 моль/л: готовят, растворяя
29,8 г т р и э т а н о л а м и н а в воде (примерно 20,7
мл), объем доводят водой до 200 мл. 7. Е д к и й К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Увеличе-
натр, 1 н. раствор. 8. Натрия хлорид, насыщен- ние количества НЭЖК обусловлено приемом
пищи, а также различными факторами, стиму-
ный водный раствор. 9. Медный реактив. В день
л и р у ю щ и м и липолиз ( г е п а р и н , а д р е н а л и н и
определения смешивают 10 мл раствора меди
нитрата, 10 мл раствора триэтаноламина и различные близкие ему по х и м и ч е с к о й структу-
6 мл 1 н. NaOH. Объем доводят до 100 мл насы- ре или физиологическому действию вещества).
щенным раствором хлорида н а т р и я , после чего Обычно если содержание глюкозы в к р о п и
устанавливают рН 8,0, добавляя нужное коли- возрастает, содержание НЭЖК уменьшается.
чество 1 н. NaOH. 10. Дифенилкарбазида спир- Количество их возрастает при атеросклерозе,
после инфаркта миокарда.
товой раствор: 100 мг 1,5-дифенилкарбазида
растворяют в 25 мл этилового спирта, непосред-
о ценно перед употреблением добавляют 0,24 мл
5.6.7. Липопротеиды
т р и э т а н о л а м и н а . 1 1 . Калибровочный раствор.
Для его приготовления можно использовать
различные жирные кислоты с длинной цепью, Определение фракций методом дискэлектро-
но удобнее всего работать со стеариновой кис- фореза в полиакриламидном геле. П р и н ц и п .
лотой, так как она при комнатной температуре Предварительно окрашенные липопротеиды
существует в твердом состоянии (температура сыворотки подвергают электрофорезу в на-
плавления 70 °С). Исходный раствор с концент- правлении сверху вниз в колонке, заполненной
рацией 10 ммоль/л готовят, растворяя 284,5 мг четырьмя слоями полиакриламидного геля.
в 100 мл хлороформа, из него готовят рабочие Н и ж н и й слой геля с а м ы й мелкопористый, верх-
калибровочные растворы, содержащие 400— ний самый к р у п н о п о р и с т ы й . Липопротеиды в
1000 мкмоль/л, путем разведения хлорофор- зависимости от размера их молекул задержи-
мом. ваются в р а з н ы х участках геля.
Х о д о п р е д е л е н и я . К 0,05 мл сыво- Р е а к т и в ы . 1 . ТРИС — трис(оксиметил)
ротки или пл.азмы добавляют 3 мл экстракцион- аминометан. 2. А к р и л а м и д . 3. N, N'-метилен-
ной смеси и 0,9 мл медного реактива, закры- бисакриламид (МБА). 4. N, N, N', N' -тетраме-
вают пробирку пробкой (лучше всего полиэти- тилэтилендиамин (ТЕМЕД). 5. Рибофлавин.
леновой) и встряхивают 3 м и н , после чего 6. Сахароза. 7. Глицин (аминоуксусная кисло-

248
та, гликокол). 8. Судан черный — насыщенный
спиртовой раствор. Растворяют 100 мг в 5 мл Р а с п о л о ж е н и е Нижний 2-й 3-й Верх-
этилового спирта. 9. А м м о н и я персульфат (ам- слоя геля ний
снизу снизу
м о н и й надсернокислый), 0,14 % раствор. Раст- 14
22 14 9
Высота слоя
воряют 140 мг (NH4)2S2O8 в 100 мл воды. Го- геля, мм
ден пря х р а н е н и и в холодильнике в течение не- 8,9 8,9 8,9 6,7
рН
дели. 10. Электродный т р и с г л и ц и н о в ы й буфер, Концентрация
рН 8,3: в 1 л воды растворяют 0,6 г ТРИС и полиакрилами-
2,88 г г л и ц и н а ; с помощью НС1 или едкого нат- 10 5 3 3
Да, %
ра устанавливают рН 8,3. 1 1 . Трис-буфер рН 1 1 —
1
Раствор А (ре-
8,9 — раствор А: к 36,6 г ТРИС добавляют актив 11) *
около 40 мл воды, 48 мл 1 н. НС1 и 0,23 мл — — — 1
Раствор В (ре-
ТЕМЕД; после растворения объем доводят до актив 12)
100 мл водой и устанавливают рН 8,9. 12. Трис- — —
2,8 1,36
Раствор С (ре-
буфер рН 6,7, раствор В: к 5,98 г ТРИС добав- актив 13)
ляют около 40 мл воды, 48 мл I н. HCI и 0,46 мл — — 2 2
Раствор D (ре-
ТЕМЕД, доводят объем до 100 мл и у с т а н а в л и - актив 14)
вают рН 6,7. 13. 28 % раствор а к р и л а м и д а — — — 1 1
Раствор Е (ре-
реактив С: 28 г а к р и л а м и д а и 0,735 г МБА актив 15)
растворяют в воде и доводят объем до 100 мл. — — 4 4
Раствор F (ре-
14. 10 % раствор а к р и л а м и д а — реактив D: актив 16)
10 г а к р и л а м и д а и 2,5 г МБА растворяют в — —
4 4
Раствор пер-
воде и объем доводят до 100 мл. 15. Раствор сульфата ам-
рибофлавина — реактив Е: 4 мг рибофлавина мония (реак-
растворяют в 100 мл воды. 16. 40 % раствор тив 9)
сахарозы — реактив F: 40 г сахарозы раство- 1,64
0,2 —
Воды
ряют в воде и доводят объем до 100 мл.
Х о д о п р е д е л е н и я . Определение про-
водят в аппарате для вертикального электро- * Раствор для полимеризации готовят, с м е ш и в а я
фореза любой конструкции. Он представляет у к а з а н н ы е количества объемов исходных растворов.
собой пластмассовый штатив с вертикально
укрепленными с т е к л я н н ы м и трубками длиной
мешивают и оставляют на 1 ч в темноте. После
70 мм и диаметром 6—7 мм, в которых собствен-
этого 0,03—0,05 мл осторожно наносят на по-
но и проводится электрофорез. Н и ж н и е концы
верхность уже сформированного в трубке геля
трубок погружены в электродный буферный
и дают впитаться в течение нескольких минут,
раствор, соединенный с положительным элект-
заполняют трубку доверху электродным буфе-
родом источника тока, а верхний конец зали-
ром и проводят электрофорез в течение 1 ч в
вают таким же раствором, подсоединенным к
затемненном помещении п р и силе тока 4—5 мА
отрицательному электроду.
на трубку.
Перед началом работы в трубках форми-
Оценка р е з у л ь т а т о в . Н а самом
руются столбики четырехслойного геля, причем
верху трубки, на старте, расположена полоса
в н и ж н е м слое концентрация а к р и л а м и д а са-
х и л о м и к р о н и остатки не прореагировавшей
мая высокая и условия полимеризации подо-
с липидами краски. Медленнее всего в этой
браны так, чтобы размер пор был наимень-
системе движутся пре-в-ЛП, полоса которых
ш и м ; чем выше расположен слой геля, тем
расположена в 3 % геле. На границе 3 % и
больше размер его пор. Н и ж н и е три слоя назы-
5 % гелей оказывается две полосы (Will, а на
ваются разделяющими, в н и х рН 8,9, с а м ы й
верхний слой геля концентрирующий, его рН границе 5 % и 10 % гелей — две полосы а-ЛП,
еще ниже расположен альбумин, на котором
6,7. Для ф о р м и р о в а н и я столбика геля трубку
адсорбированы неэтерифицированные жирные
устанавливают вертикально, н и ж н и й конец
кислоты, обычно отличающиеся по цвету от
герметично п р и ж и м а ю т к резиновой пластине и
шприцем с длинной иглой последовательно липопротеидов.
заливают растворы, подлежащие полимериза- Предложено много разных способов коли-
чественно в ы р а ж а т ь результаты электрофоре-
ц и и , которые готовят как указано справа.
тического разделения липопротеидов в геле
После того как залит очередной раствор,
акриламида, используя для этого различные
который должен полимеризоваться в гель, на
в а р и а н т ы денситометрии и элюции, но для
него сверху наносят несколько капель воды,
практической лаборатории, которая з а н и м а е т -
под слоем которой гель и полимеризуется. Это
ся фенотипированием г и п е р л и п и д е м и й , доста-
обеспечивает горизонтальную поверхность. Два
точно визуальной оценки; констатации увели-
н и ж н и х слоя полимеризуют в темноте п р и ком-
чения количества хиломикрон, вi- или пре-в-
натной температуре, два верхних — при осве-
фракции.
щении л а м п о й дневного света на расстоянии
Л и т е р а т у р а . Маграчева Е. Я. Разде-
30—40 см.
ление липопротеидов сыворотки крови методом
Х о д о п р е д е л е н и я . К 0,3 мл иссле-
дискового электрофореза в п о л и а к р и л а м и д н о м
дуемой сыворотки добавляют 0,15 мл раствора
геле.— Вопр. мед. х и м и и , 1973, т. 19, №. 6,
Судана черного, 0,15 мл раствора сахарозы и
с. 652—655.
0,05 мл трис-буфера рН 6,7, после чего пере-

249
растворителя и наоборот; это очень затрудняет
5.7. Гормоны
точный отбор аликвоты из какой-либо фазы.
Если вещество плохо экстрагируется, часто ис-
Определение гормонов в методическом отно-
пользуют повторную экстракцию тем же раство-
шении наиболее сложный раздел клинической
рителем, а затем оба экстракта смешивают.
биохимии, которым занимаются л и ш ь специаль-
Очень в а ж н о проводить экстракцию так,
ные лаборатории или отделения больших клини-
чтобы не образовалась стойкая эмульсия, кото-
ческих лабораторий, так как для выполнения
рая препятствует разделению фаз. Часто это
большинства гормональных методов необхо-
зависит от не поддающихся учету примесей,
мы определенные условия, в том числе исполь-
поэтому надо в с т р я х и в а т ь очень осторожно, в
зование радионуклидов. В справочнике, который
то же время достаточно энергично, чтобы насту-
рассчитан на рядовые КДЛ лечебных учрежде-
пило равновесие; в этих случаях определить
ний, приводятся л и ш ь некоторые, относительно
нужную г р а н и ц у помогает только опыт. Обра-
более простые, х и м и ч е с к и е методы определе-
зованию эмульсии в какой-то мере препятствует
ния гормонов, их метаболитов и близких им
увеличение содержания соли в растворе,
биологически активных веществ. Для специа-
эмульсию можно попытаться разделить центри-
л и з и р о в а н н ы х лабораторий можно рекомендо-
фугированием, но это не всегда помогает.
вать вышедшее в 1980 г. справочное пособие
Некоторые авторы рекомендуют проводить
А. Г. Резникова «Методы определения гормо-
экстракцию в делительных воронках, но в усло-
нов» (Киев, «Наукова д у м к а » ) .
виях клинической практики, когда жизнь вы-
В клинической эндокринологии все боль-
нуждает м а к с и м а л ь н о экономить время и реак-
шее распространение получает метод конку-
тивы, они неудобны. Лучше экстрагировать в
рентного связывания (так называемое радио-
конических колбах или в пробирках с пришли-
•иммунное определение), область применения
фованными стеклянными или полиэтиленовыми
которого, однако, значительно шире, чем опре-
пробками. Если работают с колбами, надо
деление гормонов, поэтому он вынесен в спе-
использовать мешалки, лучше всего магнит-
циальный раздел '.
ные, в этом случае один лаборант может одно-
временно обрабатывать несколько проб, в то
же время удобно дозировать степень переме-
5.7.1. Экстракция и очистка шивания. При работе с пробирками их встря-
растворителей хивают вручную или на встряхивающем (шют-
тель) аппарате, пробирки удобны тем, что если
образуется эмульсия, ее можно постараться
Многие методы определения гормонов вклю-
разрешить центрифугированием.
чают схожие способы экстракции и нуждаются
После экстракции один слой отделяют от
в растворителях п р и м е р н о одинаковой степени
другого, обычно значительно легче отсосать
чистоты. Чтобы не повторяться при описании
верхний слой и количественно перенести его в
каждого метода; ниже приводятся общие све-
чистую посуду, чем н и ж н и й . Удобно отсасы-
дения по этим вопросам.
Экстракция. Для экстракции используют вать пастеровской пипеткой с грушей, перенося
не смешивающиеся с водой растворители, в верхний слой небольшими порциями, при этом,
если по ошибке будет захвачена небольшая
которые переходят экстрагируемые вещества.
порция нижнего слоя, ее легко вернуть на мес-
В целом чем больше в экстрагируемом ве-
то. Работа с грушей требует определенной точ-
ществе полярных кетоновых, альдегидных и
ности движений, которая вырабатывается со
спиртовьц групп, тем лучше оно переходит в
временем; н а ч и н а ю щ и м можно рекомендовать
не смешивающиеся с водой полярные раство-
укрепить пипетку в штативе строго вертикаль-
рители — высшие спирты, этилацетат и т. д.,
но и соединить верхний конец резиновой или
чем меньше полярных групп, тем больше подхо-
лучше хлорвиниловой трубкой со шприцем,
дят неполярные растворители (гексан, хлоро-
который укреплен на том же штативе. Надо не
форм, д и х л о р м е т а н ) ; эфир занимает промежу-
забывать смазывать поршень шприца специаль-
точное положение. Эффективность экстракции
ной смазкой или вазелином.
часто зависит также от рН водного раствора
и его ионной силы (содержание солей). Эффек- Если верхний слой для дальнейшей работы
тивнее всего экстракция происходит, если пер- не нужен, н а п р и м е р при п р о м ы в а н и и хлоро-
воначально образуется одна фаза, которая за- формного экстракта, его иногда отсасывают
тем разделяется на две добавлением избытка пастеровской пипеткой, подсоединенной к водо-
одного из ингредиентов, на такие условия струйному насосу, при этом весь слой сразу же
удается подобрать не всегда, значительно чаще удаляется в канализацию. Это ускоряет работу,
просто встряхивают две несмешивающиеся но имеет тот недостаток, что, если ошибочно
жидкости. Надо иметь в виду, что объемы засосана порция нижней фазы, ее спасти уже
фаз после экстракции очень часто не соответ- невозможно.
Очистка этанола. Абсолютный этанол гото-
ствуют объемам взятых растворов или раство-
вят из 90—96 % этилового спирта кипячением
рителей, так как вместе с экстрагируемым ве-
с СаО или ВаО на водяной бане с электроподо-
ществом в другую фазу часто переходит и часть
гревом с обратным холодильником до тех пор,
пока точка кипения не станет 78,3 °С при нор-
мальном барометрическом давлении. Дла обна-
р у ж е н и я альдегидов к 5 мл этанола добавляют
См. с. 30.
250
0,2 мл раствора калия перманганата, содер- Очистка этилацетата. Несколько раз про-
жащего 200 мг в I л (1:5000); раствор не дол- мывают яркоокрашенным водным раствором
жен обесцвечиваться на протяжении 20 мин, перманганата калия. Промывание повторяют
изменение окраски указывает на присутствие до тех пор, пока раствор не перестанет приобре-
альдегидов. Пищевой спирт обычно содержит тать фиолетовый оттенок, затем отмывают во-
больше альдегидов, чем гидролизный. дой 3—5 раз, осушают безводным сульфатом
Для удаления альдегидов можно использо- натрия и перегоняют.
вать два способа: с 2,4-динитрофепилгидрази-
ном и с серебра нитратом. В первом случае
5.7.2. 17-Кетостероиды
к 1 л этилового спирта добавляют 2 г гидро-
хлорида 2,4-динитрофенилгидразина и 0,5 мл
концентрированной НС1, закрывают пробкой Унифицированный метод по цветной реакции
и оставляют стоять 2 сут в темноте, затем пере- с метадинитробензолом. П р и н ц и п . Эфиры
гоняют. При очистке с помощью серебра нитра- 17-кетостероидов (17-КС) с глюкуроновой и
та в 100 мл горячего этанола растворяют 7 г серной кислотами гидролизуют нагреванием в
AgNO 3 и добавляют туда 15 г едкого кали, кислой среде в присутствии формальдегида,
раствор выливают в 4 л подлежащего очистке который уменьшает образование темноокра-
этилового спирта. Выпадает темный осадок, шенных продуктов. Кетостероиды экстраги-
который постепенно оседает на дно. Через сут- руют эфиром и определяют по цветной реак-
ки его отделяют декантацией или фильтрова- ции с метадинитробензолом. Побочные окра-
нием, этанол перегоняют, отбрасывая первую и шенные продукты, мешающие фотометрирова-
последнюю порции. нию, удаляют избирательной экстракцией.
Очистка хлороформа и дихлорметана (ме- Р е а к т и в ы . 1 . НС1 концентрированная.
тиленхлорида). Для определения гормонов луч- 2. Уксусная кислота ледяная. 3. Формальдегид,
ше всего использовать хлороформ марки «для водный раствор: 50 мл имеющегося в продаже
наркоза», содержащий небольшое количество 40 % раствора формалина смешивают с 250 мл
спирта, что делает его более стабильным. Для воды. 4. Едкий натр, 100 г/л: 10 г NaOH раст-
очистки хлороформа или дихлорметана других воряют в 50—60 мл воды, после охлаждения
марок, а также для регенерации тех порций объем доводят водой до 100 мл. 5. Этиловый
эфир, свободный от перекисей. 6. Хлороформ
растворителя, которые уже один раз использо-
вались для экстракции гормонов, их взбалты- очищенный. 7. Этиловый спирт 50 %. Смеши-
вают с концентрированной серной кислотой на вают равные объемы этилового спирта и воды.
протяжении 1 или 2 рабочих дней, при этом 8. Этиловый спирт абсолютный. 9. Едкое кали,
серная кислота темнеет тем скорее, чем более раствор 5 моль/л в метаноле: растворяют 28 г
загрязнен растворитель. Встряхивание надо КОН в дважды перегнанном метиловом с п и р -
проводить в темноте; удобно пользоваться маг- те, объем доводят до 100 мл и немедленно
нитной мешалкой, закрывая колбу светонепро- фильтруют (в противном случае раствор может
ницаемым колпаком. После этого кислоту отса- потемнеть) и проверяют концентрацию титро-
сывают, хлороформ или дихлорметан промы- ванием 0,1 н. кислотой, используя в качестве
вают водой, а затем на протяжении нескольких индикатора метиловый оранжевый. Хранят в
часов концентрированным раствором аммиака, темной склянке в холодильнике. 10. Метади-
1 н. NaOH или насыщенным раствором натрия нитробензол, раствор 20 г/л в абсолютном эти-
карбоната, затем опять промывают водой и осу- ловом спирте: 400 мг метадинитробензола
шают безводным натрия сульфатом или натрия растворяют в 20 мл абсолютного этанола. В
карбонатом. После осушения растворитель случае необходимости метадинитробензол
перегоняют, используя стеклянный перегонный можно очистить перекристаллизацией, для это-
аппарат на шлифах, нагреватель обязательно го в колбу вместимостью 3 л помещают 20 г
должен быть электрический с водяной баней. препарата, которые растворяют в 750 мл этило-
Конкретный режим очистки во многом зави- вого спирта, нагревая до 40 °С. Затем прибав-
сит от качества исходного растворителя; не- ляют 100 мл 2 н. NaOH, перемешивают, охлаж-
которые партии этими методами вообще очис- дают и быстро добавляют 2,5 л холодной воды,
тить не удается. Об эффективности очистки при этом должны выпасть мелкие кристаллы,
л у ч ш е всего судить, поставив холостой или которые собирают, фильтруя раствор в воронке
калибровочный опыт. Бюхнера. 1 1 . Калибровочный раствор. Навеску
Очистка эфира. Для удаления перекисей в несколько м и л л и г р а м м о в дегидроэпиандро-
эфир взбалтывают с 10 % раствором железа стерона или андростерона растворяют в таком
сульфида (сернистого железа — FeS) в 1 н. количестве этилового спирта, чтобы концентра-
серной кислоте, затем промывают водой. Для ция составила 100 м к г / м л .
проверки н а л и ч и я перекисей 200 мл эфира вы- Х о д о п р е д е л е н и я . Суточную мочу
паривают, остаток растворяют в 2 мл абсо- собирают в чистую посуду; если выпадает оса-
лютного этанола. Из этого количества отби- док, его тщательно перемешивают и из всего
рают 0,2 мл, к которым добавляют 0,2 мл 2 % количества отбирают 5—20 мл в зависимости
спиртового раствора метадинитробензола и от содержания кетостероидов. Объем доводят
0,2 мл 5 н. раствора едкого к а л и в метаноле; изотоническим раствором натрия хлорида до
окраска не должна превышать той, которая 20 мл, добавляют 3 мл HCI, 1 мл уксусной
развивается при добавлении к тем же реакти- кислоты и 0,2 мл раствора формальдегида.
в а м Г) м к г к р и с т а л л и ч е с к о г о кетостероида. Колбу закрывают стеклянной затычкой груше-
видной формы (можно использовать воронки Р е а к т и в ы . 1 . НС1 примерно 30%.
или неплотноприлегающие стеклянные пробки) К 80 мл концентрированной HCI добавляют
и ставят на 15 мин на кипящую водяную баню; 20 мл воды. 2. Дихлорметан (метиленхлорид).
этот этап надо проводить под тягой или в хо- 3. Этиловый эфир, л у ч ш е использовать марки
рошо проветриваемом помещении. «для наркоза». 4. Этиловый спирт 30 %. К 35 мл
После охлаждения содержимого колбы его 96 % этилового спирта добавляют воды до
дважды экстрагируют п о р ц и я м и по 10 мл эфи- объема 100 мл. 5. Едкое кали, спиртовой рас-
ра, экстракты сливают вместе, сначала промы- твор 200 г/л. Растворяют 2 г КОН в 10 мл эти-
вают 10 мл 10 % раствора едкого натра, затем лового спирта, нерастворившиеся примеси отде-
водой. Экстракцию и п р о м ы в а н и е можно про- ляют центрифугированием. Раствор нестоек.
водить в делительных воронках, но лучше в 6. Метадинитробензол, спиртовой раствор 5 г/л.
колбочках, используя для перемешивания маг- Растворяют 250 мг метадинитробензола в 50 мл
н и т н у ю мешалку, или в пробирках с притерты- этилового спирта. 7. Едкое кали или едкий натр
ми с т е к л я н н ы м и пробками. Вместо п р о м ы в а н и я г р а н у л и р о в а н н ы й . 8. Калибровочный раствор.
10 % раствором NaOH можно добавлять гра- Навеску в несколько м и л л и г р а м м о в дегидро-
нулы едкого натра в э ф и р н ы й экстракт, кото- эпиандростерона или андростерона растворяют
р ы й затем сливают в чистую посуду. Промытый в таком количестве этилового спирта, чтобы
эфирный экстракт небольшими порциями пере- концентрация составила 500 мкг/мл.
носят в пробирку, в которой выпаривают на Ход определения. И з тщательно
водяной бане п р и температуре не выше 50 °С перемешанной суточной мочи отбирают 10 мл
при в с т р я х и в а н и и , под струей воздуха или луч- в большую пробирку или колбочку, желательно
ше азота. Сухой экстракт можно оставить на с притертой пробкой, добавляют 10 мл 30 %
несколько дней в ожидании окончания анализа. HCI и к и п я т я т на водяной бане 10 м и н . Этот
В пробирку с сухим экстрактом добавляют этап надо проводить под тягой. После охлажде-
0,2 мл 5 н. раствора едкого кали в метаноле, ния добавляют 10 мл дихлорметана или эфира
0,2 мл абсолютного этанола и 0,2 мл 2 % спир- и тщательно встряхивают; когда слои разде-
тового раствора метадинитробензола, переме- ляются, водный слой удаляют. Если для эк-
шивают и оставляют в темноте при комнатной стракции используют дихлорметан, который тя-
температуре на 1 ч. После этого добавляют желее воды, то водный слой оказывается свер-
4 мл 50 % этанола и 2 мл хлороформа, энер- ху, поэтому его легче удалить, чем при
г и ч н о встряхивают и дают образоваться двум экстракции эфиром, который оказывает-
слоям. Верхний, водно-спиртовой, слой корич- ся в верхнем слое. После удаления водной
невого цвета, содержащий загрязнения, отса- фазы к органической добавляют 10—20 гранул
сывают, н и ж н и й слой фиолетового цвета фото- КОН или NaOH для осушения. Они должны
метрируют в кюветах с длиной оптического быть добавлены в таком количестве, чтобы
п-ути 0,5 см против холостого опыта при длине образовался конгломерат, впитавший всю
волны 520 нм; кюветы закрывают к р ы ш к а м и . оставшуюся водную фазу, а дихлорметановый
Одновременно ставят холостой опыт, в который слой был подвижным, прозрачным и однород-
вместо п р о б и р к и с в ы с у ш е н н ы м и экстрактами ным. Отбирают 5 мл экстракта, которые пере-
берут ч и с т у ю пробирку, в которую помещают носят в чистую сухую пробирку, где в ы п а р и -
по 0,2 мл этанола, 5 н. раствора едкого кали вают в токе воздуха или азота при температу-
в метаноле и 2 % раствора метадинитробензола, ре не выше 50 °С.
дальнейшую обработку проводят так же, как К сухому остатку добавляют 0,4 мл раство-
и опытных проб. ра метадинитробензола и 0,2 мл раствора ед-
Для калибровки к 20 мл изотонического кого кали и выдерживают 40 м и н в темноте п р и
раствора н а т р и я хлорида добавляют 0,5 мл 35 °С для р а з в и т и я реакции. После этого до-
калибровочного раствора, т. е. 50 мкг кетосте- бавляют 2 мл этилового спирта и 5 мл эфира,
роида; в дальнейшем калибровочную пробу встряхивают и дают разделиться слоям. Верх-
обрабатывают так же, как и опытную пробу ний (эфирный) слой переносят в кювету дли-
мочи. ной оптического пути 1 см, закрывают крышкой
При н а л а ж и в а н и и методики или смене ре- и фотометрируют при трех длинах волн — 440;
активов рекомендуется построить калибровоч- 520 и 600 нм против кюветы, заполненной во-
н ы й график, для приготовления которого берут дой. Следует иметь в виду, что в результате
(1,5; 1; 1,5 и 2 мл калибровочного раствора. испарения эфира температура проб понижает-
Р а с ч е т проводят п о п р а в и л у пропорций. ся, они мутнеют, что мешает фотометрии,
Получается содержание кетостероидов в 20 мл поэтому кюветы с пробами обязательно надо
мочи. Чтобы узнать выведение за сутки, полу- закрывать к р ы ш к а м и .
ченную величину делят на 20 и умножают на Для построения калибровочного графика в
н е л и ч и н у суточного диуреза. сухие чистые пробирки вносят 0,05—0,15 мл
Упрощенный метод по реакции с метади- калибровочного раствора, т. е. 25—75 м к г кето-
нитробензолом. П р и н ц и п . П р и н ц и п и ход стероида, и выпаривают досуха в токе воздуха
определения такой же, к а к и в у н и ф и ц и р о в а н - или л у ч ш е азота. В темном месте такие под-
ном методе, но некоторые детали упрощены, готовленные пробы могут храниться несколько
что практически не сказывается на точности месяцев. В каждую пробирку вносят 0,4 мл
метода. Чтобы у м е н ь ш и т ь ошибки, вызванные раствора динитробензола и 0,2 мл спиртового
посторонними веществами, э к с т и н к ц и ю изме- раствора едкого кали, дальнейшая обработка
ряют трехволновым методом. такая же, как и для опытных проб.
252
Для проведения расчета сначала вычисляют тать с одной и той же партией. 310 мл концент-
рированной серной кислоты осторожно выли-
исправленную величину экстинкции (Е и с п ) по
вают в 190 мл воды, охлаждая колбу водой
формуле:
со льдом, чтобы избежать нагревания, кото-
рое может сказаться на качестве реактива,
100 мл разведенной таким образом кислоты
осторожно смешивают с 50 мл этилового спир-
Строят калибровочный график, откладывая на
т а . 9. Фенилгидразиновый реактив: 21,7 мг
одной оси Еисп а на другой — содержание кето-
стероида в калибровочной пробе. В связи с тем гидрохлорида фенилгидразина растворяют в
50 мл серно-спиртового реактива. В случае
что в конечном итоге в исследуемой пробе
необходимости гидрохлорид фенилгидразина
оказываются все кетостероиды, содержавшиеся
в 5 мл мочи, чтобы узнать концентрацию, вы- можно приготовить из фенилгидразина осно-
раженную в мг/л, полученную величину делят вания, нейтрализуя его НС1 из расчета 10 мл
10 н. HCI на 9,4 г фенилгидразина основания.
на 5; чтобы узнать выведение за сутки, кон-
центрацию умножают на суточный диурез. Препарат очищают перекристаллизацией из
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Экскреция этилового спирта, для этого 5—10 г вещества
17-КС у мужчин 23—80 мкмоль/сут (8—29 растворяют в 30—40 мл этанола, затем охлаж-
мг/сут), у женщин 22—60 мкмоль/сут (8— дают в холодильнике, кристаллы отделяют на
22 мг/сут). фильтре и высушивают. 10. Ацетатный буфер
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Повыше- рН 4,5. Растворяют в воде 5,79 г ацетата нат-
ние 17-КС свидетельствует о гиперсекреции рия, добавляют туда 3,25 мл ледяной уксусной
глюкокортикоидов (синдром Кушинга), чаще кислоты, доводят рН до требуемой величины
всего вследствие опухоли надпочечника, гипо- уксусной кислотой или NaOH и доливают водой
физа или АКТГ продуцирующей опухоли лег- до 1 л. 11. в-Глюкуронидаза, активность
ких, уменьшение — признак пониженной выра- 100 000 ЕД в 1 г препарата. Растворяют в воде
ботки глюкокортикоидов и мужских половых в таком количестве, чтобы активность была
гормонов. 500 ЕД в 1 мл, раствор хранят 1—2 дня. Пре-
п а р а т плохо растворим в воде, поэтому при
приготовлении раствора его надо перемеши-
5.7.3. 17-Оксикортикостероиды вать не менее 30 мин, лучше на магнитной ме-
шалке, после чего осадок удаляют центрифуги-
Определение в моче по реакции с фенил- рованием или фильтрацией. Можно готовить
раствор и на ацетатном буфере, но в этом слу-
гидразиновым реактивом после ферментатив-
ного гидролиза. П р и н ц и п . 17-Оксикортико- чае надо убедиться, что препарат действитель-
стероиды (17-ОКС), т.е. глюкокортикоидные но растворяется (см. примечание 3). 12. Ка-
либровочный раствор, содержащий 20 мкг гор-
гормоны и их метаболиты, содержащие гидро-
мона в 1 мл. Для его приготовления 1 мг гидро-
ксильные группы в положениях 17 и 10 и кето-
кортизона или кортизона растворяют в 50 мл
группу в положении 20, при нагревании с фе-
этилового спирта.
нилгидразином в смеси серной кислоты и спир-
та дают окрашенные в желтый цвет соедине- Х о д о п р е д е л е н и я . И з хорошо пере-
ния. Одновременно с основным опытом ставят мешанного объема суточной мочи отбирают не-
холостой, в котором учитывают неспецифи- большое количество и доводят рН до 6,5, до-
ческую окраску, которая в этих условиях разви- бавляя по каплям 2 н. NaOH или НС1, кислот-
вается без фенилгидразина. В связи с тем что ность контролируют рН-метром или универсаль-
большая часть 17-ОКС мочи присутствует в ной индикаторной бумагой. Отбирают 2 пробы
виде парных соединений с глюкуроновой и сер- (опытную и холостую) по 5 мл и нагревают их
ной кислотами, предварительно проводят гид- на кипящей водяной бане 3—5 мин для разру-
ролиз с помощью фермента глюкуронидазы, шения ингибитора фермента. Если по какой-
затем 17-ОКС экстрагируют хлороформом или либо причине моча сразу не может быть про-
дихлорметаном и переводят в смесь серной анализирована, желательно х р а н и т ь ее после
кислоты и спирта. кипячения, которое одновременно убивает и
Р е а к т и в ы . 1 . Хлороформ или дихлорме- микробную флору. После охлаждения и к опыт-
тан, лучше всего марки «для наркоза» 1 . 2. Эти- ной, и к холостой пробе добавляют по 5 мл
ловый спирт 2 . 3. 2. н. раствор едкого натра. ацетатного буфера, по 5 мл раствора фермента
и ставят в термостат на 18—20 ч при 37 °С.
4. 2 н. раствор НС1. 5. Универсальная индика-
торная бумага; вместо нее можно пользоваться После ферментации каждую пробу экстра-
рН-метром. 6. 0,1 н. раствор едкого натра. гируют 75 мл хлороформа ( п я т и к р а т н ы й объем),
7. Натрия сульфат или натрия карбонат после расслаивания удаляют верхний слой (мо-
безводный. 8. Серно-спиртовой реактив. Для ч у ) , хлороформенный экстракт промывают 7,5 мл
его приготовления используют наиболее чистую 0,1 н. NaOH и затем еще 3 мл воды, после
серную кислоту марки «выдерживает пробу чего осушают безводным натрия сульфатом
Саваля», стараясь как можно дольше рабо- или натрия карбонатом. Из опытной пробы от-
меривают точно 50 мл хлороформенного экс-
тракта и экстрагируют его 4 мл фенилгидра-
зинового реактива, из холостой пробы также
1
Очистку см. с. 251.
2
Очистку см. с. 250.
Очистку см. с. 250.

253
точно отмеривают 50 мл хлороформенного чи и 4 мл фермент-буферного раствора, а
экстракта и экстрагируют их 4 мл серно-спир- экстрагировать их 50 мл хлороформа или
тового реактива. Каждая из этих экстракций дихлорметана, в этом случае из суммар-
должна занимать около 2 мин. После этого ного экстракта отбирают по две порции по
осторожно удаляют нижние, хлороформенные, 20 мл — одну для экстракции фенилгидра-
слои, а верхние, т. е. соответственно фенил- зиновым реактивом (опыт), другую для
гидразиновый и серно-спиртовой реактивы, пе- экстракции серно-спиртовым реактивом (хо-
реносят в отдельные пробирки и нагревают на лостой опыт). Экстракцию в этом случае
водяной бане при 60 °С в течение 20 мин. проводят порциями по 2 мл серно-спирто-
Одновременно ставят калибровочный опыт, вого и фенилгидразинового реактива; этого
для чего 1 мл калибровочного раствора, содер- количества оказывается достаточно, чтобы
жащий 20 мкг/мл, выпаривают досуха в про- измерить светопоглощение на спектрофото-
бирке, растворяют в 50 мл хлороформа и экстра- метре типа СФ даже без специальных мик-
гируют 4 мл фенилгидразинового реактива, хо- рокювет, а просто приподнимая стандарт-
лостой опыт при калибровке не ставят. Все ные кюветы с помощью вкладышей. Это
три раствора — опытный с фенилгидразино- сокращает расход растворителя почти в 3
вым реактивом, холостой с серно-спиртовым раза — с 150 до 50 мл. 4. В качестве экстра-
реактивом и калибровочный — фотометрируют тента могут быть использованы и хлоро-
в кюветах с длиной оптического пути 1 см при форм, и дихлорметан, но последний труднее
длине волны 410 нм против прогретого серно- получить достаточно высокого качества.
спиртового реактива. Экстрагирование дихлорметаном удобнее,
Р а с ч е т проводят по правилу пропорции, так как он легче серно-спиртового и фенил-
учитывая, что из 5 мл мочи, взятых для иссле- гидразинового реактивов, в то время как
дования, на стадии хлороформенного экстракта хлороформ тяжелее их. По этой причине
отбрасывается 1/3 часть, поэтому фактически дихлорметановый слой оказывается сверху
в фенилгидразиновый реактив переходят 17- и его проще полностью удалить, оставив на
оксикортикостероиды из 3,33 мл мочи. Вводит- дне пробирки тот слой, который в дальней-
ся также поправка на неспецифические хромо- шем используют для анализа. 5. Если нет
гены, о которых судят по экстинкции холостой достаточно чистых реактивов, иногда можно
пробы. Окончательный расчет проводят по вводить поправку на их небольшие загряз-
формуле: нения, используя измерение экстинкции
при трех длинах волн — 370; 410 и 450 нм,
как это делается при анализе крови. 6. Иногда
после ферментативного гидролиза моча рез-
ко темнеет; это признак того, что обследуе-
мый получил с пищей или принял в виде
фармацевтических препаратов какие-то
Умножая полученную величину на суточный вещества, которые образовали парные соеди-
диурез, получают выведение 17-ОКС с мочой нения с глюкуроновой кислотой. Как прави-
за сутки. ло, это не влияет на дальнейший ход
анализа.
П р и м е ч а н и я . 1. Серно-спиртовой и фе-
нилгидразиновый реактивы очень агрессив- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Суточное
ны как в отношении кювет и прибора, так выведение 17-ОКС составляет 4—20 мкмоль/сут
и в отношении платья и рук лаборанта, (1,4—7,2 мг/сут).
поэтому работать с ними надо очень осто- Определение 17-ОКС в плазме крови по
рожно. 2. Результаты работы по этой мето- реакции с фенилгидразином. П р и н ц и п ме-
дике во многом зависят от чистоты реакти- тода аналогичен определению 17-ОКС в моче
вов — растворителя, спирта, кислоты и даже с той разницей, что определяются лишь не свя-
солей, используемых для осушения, поэто- занные с глюкуроновой кислотой соединения,
му при налаживании методики или смене поэтому ферментативный гидролиз не прово-
реактивов желательно провести контрольное дится. Для экономии плазмы крови холостой
определение, в котором вместо мочи взять опыт не ставят, а поправку на неспецифическое
воду. Оптические плотности серно-спиртово- поглощение проводят путем вычитания сосед-
го и фенилгидразинового реактивов в этом них участков спектра.
случае должны быть не более 0,1—0,2 при Р е а к т и в ы . 1. Хлороформ'. 2. Фенил-
измерении против воды, в противном случае гидразина гидрохлорид. 3. Фенилгидразиновый
надо искать тот реактив, который вносит реактив 2 . Сначала готовят смесь серной кисло-
загрязнения. 3. Приведенный унифициро- ты, спирта и воды, для чего осторожно, избе-
ванный метод требует значительного рас- гая нагревания, смешивают 62 мл концентри-
хода реактивов, поэтому появилось много рованной серной кислоты, 38 мл воды и 50 мл
предложений о том, как можно проводить этилового спирта. В день определения раство-3
определение более экономно. С нашей точ- ряют 4,3 мг гидрохлорида фенилгидразина
ки зрения заслуживают в н и м а н и я предло-
1
жения, направленные на уменьшение рас- Очистку см. с. 251.
2
хода хлороформа. Это можно сделать, если Требования к чистоте спирта и серной
растворять фермент непосредственно в бу- кислоты см. с. 253.
3
ферном растворе и брать в опыт по 4 мл мо- Очистку см. с. 253.

254
в 10 мл этой смеси. 4. 0,2 н. раствор натрия
5.7.4. 11-Оксикортикостероиды
карбоната. 5. Калибровочный раствор гидро-
кортизона, содержащий 0,5 мкг в 1 мл. Гото-
Унифицированный метод по флюоресцен-
вят, растворяя 1 мг препарата в 5 мл метило-
ции в серно-спиртовом реактиве. П р и н ц и п .
вого или этилового спирта, и доводят объем
водой до 2 л. Кортикостероиды, имеющие гидроксилы в по-
Х о д о п р е д е л е н и я . Для анализа же- ложениях 11 и 21 и кетогруппу в положении 3,
лательно использовать гепаринизированную после обработки смесью серной кислоты и спир-
плазму, полученную на холоду, но можно про- та флюоресцируют зеленым светом. Их опре-
водить определение и в сыворотке, полученной делению мешают холестерин и другие липиды,
которые в этих условиях также образуют
обычным методом. Экстрагируют 5 мл плазмы
флюоресцирующие соединения, поэтому их уда-
25 мл хлороформа, плазму удаляют, экстракт
ляют предварительной экстракцией гексаном, в
промывают два раза порциями по 2,5 мл 0,2 н.
который кортикостероиды не переходят.
натрия карбоната, затем таким же количеством
воды. Отмытый экстракт упаривают при темпе- Р е а к т и в ы . 1. Гексан. 2. Дихлорметан.
ратуре не свыше 40 °С до объема 1 —1,5 мл, 3. 0,2 н. раствор натрия карбоната. 4. Серно-
который переносят в центрифужную пробир- спиртовой реактив: смешивают 3 объема кон-
ку. Стенки посуды, где проводилось выпари- центрированной серной кислоты и 1 объем эти-
лового спирта, смесь охлаждают до комнатной
вание, смывают еще 1 — 1,5 мл хлороформа, кото-
рый переносят в ту же центрифужную пробир- температуры, реактив годен только в день при-
ку. К суммарному экстракту добавляют 0,2 мл готовления. Требования к качеству серной ки-
фенилгидразинового реактива, экстрагируют слоты и спирта те же '. 5. Калибровочные
взбалтыванием и дают отстояться не менее растворы. Желательно, чтобы калибровочные
растворы содержали гидрокортизон и кортико-
20—30 мин. После этого хлороформенный слой
стерон в тех же соотношениях, в которых они
(нижний) осторожно отсасывают, опасаясь
присутствуют в крови человека, т.е. 4:1, но
захватить фенилгидразиновый экстракт. Про-
можно обойтись и одним гидрокортизоном.
бирку с кислотным экстрактом прогревают 30
Основной калибровочный раствор содержит
мин при 60 °С, при этом остатки хлороформа
200 мкг гидрокортизона и 50 мкг кортикосте-
выпариваются. Прогретый реактив, приобрет-
рона в 1 мл; его готовят, растворяя кортикоиды
ший желтоватую окраску, пастеровской пипет-
в 1 мл спирта и добавляют воду до нужного
кой переносят в микрокювету и измеряют свето-
объема. Ампулированные фармацевтические
поглощение при длинах волн 370; 410 и 450 нм
препараты обычно содержат гемисукцинат и
против фенилгидразинового реактива, который
для калибровки не годятся.
прогревают так же, как и опытную пробу.
Для калибровки аналогичным образом экс- Ход определения. Исследуемую
плазму или сыворотку в количестве 1 мл экстра-
трагируют 25 мл хлороформа 1 мл калибровоч-
гируют 3 мл гексана, верхний (гексановый)
ного раствора (0,5 мкг гидрокортизона), экс-
слой удаляют, остаток гексана упаривают под
тракт упаривают и реэкстрагируют фенилгидра-
вакуумом на водяной бане при 40 °С. Плазму
зиновым реактивом так же, как и опытную
пробу. экстрагируют 10 мл дихлорметана, дают хоро-
Для проведения расчета сначала вычисляют шо отстояться (по крайней мере 20 м и н ) , дожи-
исправленную величину экстинкции (?„ гп ) по даясь полного просветления раствора, промы-
формуле: вают его 0,5 мл 0,2 н. раствора натрия карбо-
ната, затем 0,5 мл воды и 8 мл переносят в
чистую пробирку, куда добавляют 2,5 мл сер-
Е„са = ?410 — 0,5 • (?з?о + ?450)
но-спиртового реактива, встряхивают и через
несколько минут удаляют дихлорметановый
слой (верхний). Через час измеряют флюорес-
как для опытной, так и для калибровочной
ценцию серно-спиртового экстракта в диапазо-
проб. Содержание 17-ОКС в 5 мл плазмы кро-
не 540—550 нм при возбуждении светом с дли-
ви рассчитывают по правилу пропорций,
ной волны 475 нм.
сопоставляя Е исп опытной и калибровочной
Одновременно с опытными пробами обраба-
проб. В 1 л содержится в 200 раз больше
17-ОКС. тывают и калибровочные с той разницей, что
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 140—550 экстракцию гексаном пропускают, а 1 мл кали-
нмоль/л (5—20 мкг в 100 м л ) . бровочного раствора непосредственно экстра-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Нестойкое гируют 10 мл дихлорметана; дальнейшая обра-
увеличение 17-ОКС бывает при нервно-эмо- ботка такая же, как и в опытных пробах.
циональных напряжениях, тяжелой физической Р а с ч е т проводят п о формуле:
работе у нетренированных людей, травмах,
хирургических операциях и т. д. Стойкое уве-
-=с„,
личение свидетельствует о развитии гиперкор-
тицизма (синдром Кушинга) чаще всего в
результате опухоли надпочечника, гипофиза и
где Фоп и Фк — соответственно величины флюо-
эктопической АКТГ продуцирующей опухоли.
ресценции опытной и калибровочной проб,
Снижение свидетельствует о гипокортицизме
вследствие поражения надпочечников (болезнь
См. с. 253.
Аддисона) или длительной стероидной терапии.

255
и высушенной. Остатки окиси алюминия пере-
а Ск — содержание 11-ОКС в калибровочном
растворе. Результаты выражают в мкг/л. носят в колонку еще 2—3 порциями воды. 15 мл
мочи наносят на колонку и дают стечь под
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 140—230
действием силы тяжести, затем промывают
нмоль/л (5—8 мкг в 100 мл).
10 мл воды, к которым добавлена 1 капля 0,5 н.
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е такое же,
NH 4 OH; создавая вакуум водоструйным насо-
как и определения 17-ОКС.
сом, катехоламины элюируют 6 мл 0,25 н. уксус-
ной кислоты. Время между промывкой колонки
5.7.5. Адреналин, норадреналин
подщелоченной водой и окончанием элюции не
должно превышать 30 мин.
Метод раздельного определения. П р и н-
В кислотных элюатах рН бывает в пределах
ц и п. Адреналин и норадреналин выделяются
из мочи адсорбцией на окиси алюминия, как 3,5—3,9, их можно хранить 2—3 дня до анализа.
и в других методах. Адреналин окисляется во Перед исследованием остатки взвеси окиси
флюорофор феррицианидом при рН 4,2, нор- а л ю м и н и я удаляют центрифугированием. Для
адреналин при рН 6,2. Чтобы при рН 6,2 не определения адреналина к 1 мл холодного элюата
происходило образование флюорофоров из адре- добавляют 1 мл холодного фосфатного буфер-
налина, в реакционную смесь добавляют тио- ного раствора рН 4,2, 1 каплю 0,5 н. NH 4 OH
гликолевую кислоту и формалин; гидросуль- (рН должен быть в пределах 4,1—4,3) и
фит натрия, удаляя растворенный кислород, 0,5 мл 0,25 % раствора феррицианида калия.
способствует стабилизации флюорофоров, обра- На этом этапе исследуемая проба и все реактивы
зовавшихся из норадреналина. должны находиться в бане со льдом. Точно
через 2 мин окисление останавливают, добавля-
Р е а к т и в ы . 1. НС1, 6 моль/л. Готовят
ют 0,2 мл 0,3 % раствора аскорбиновой кислоты
разведением п р о м ы ш л е н н о изготовляемой кон-
в 5 н. NaOH, а еще через 3 м и н 1 мл воды, охлаж-
центрированной 10 н. НС1 до концентрации
денной на льду, перемешивают и флюорометри-
6 н. 2. Этилендиаминтетрауксусная кислота или
руют, измеряя флюоресценцию в области 500—
ее соли (версен, трилон, хелатон, ЭДТА).
550 нм при возбуждении светом с длиной волны
3. Гидрат окиси аммония (NH 4 OH), растворы
400 нм.
0,5 н. и 1 н. 4. Окись алюминия очищенная и
активированная по Брокману I I . 5. Уксусная Для определения норадреналина, которое
кислота, 0,25 н. раствор. 6. Фосфатные буфер- также проводят при постоянном охлаждении
ные растворы рН 4,2 и 7,4, концентрация 1/15. всех реагентов в бане с ледяной водой, к 1 мл
7. Калия феррицианид (железистосинеродистый отцентрифугированного элюата добавляют
калий, красная кровяная соль, КзFе/СN/ 6 ), 1 мл холодного фосфатного буфера рН 7,3 (при
растворы концентрации 5 и 2,5 г/л. Готовят этом рН смеси устанавливают в пределах
из препарата, очищенного перекристаллиза- 6,2—6,5) и 0,4 мл 0,5 % раствора феррицианида
цией. 8. Аскорбиновая кислота, 3 г/л. В день калия. Перемешивают и точно через 2 мин
опыта растворяют 30 мг перекристаллизованно- добавляют 1,2 мл смеси, которая приготовлена
го препарата в 10 мл 5 н. NaOH. 9. Тиоглико- за несколько минут до этого путем смешива-
левая кислота, раствор 0,58 моль/л: 5,34 г (что ния 3 мл охлажденной тиогликолевой кислоты
и 8 мл охлажденного раствора едкого натра с
составляет 4 мл) доводят водой до объема 100
формалином, еще через 3 мин добавляют на
мл. 10. Формальдегид, раствор 0,05 моль/л на
кончике стеклянной палочки 2—3 мг порошка
2,5 н. NaOH. На 100 мл 2,5 н. раствора едкого
гидросульфата натрия, перемешивают и изме-
н а т р а берут 0,375 мл имеющегося в продаже
ряют флюоресценцию в тех же условиях, что
40% раствора формалина. 1 1 . Гидросуль-
п р и определении адреналина.
фит натрия (натрий гидросернистокислый,
Для калибровки анализируют в таких же
Na 2 S 2 O 4 ), сухой препарат в виде порошка.
12. Калибровочные растворы адреналина и нор- условиях пробы, содержащие 25—100 нг кате-
холамина, по этим данным строят калибро-
адреналина, содержащие по 100 нг основания
вочный график. При повседневной работе ка-
в 1 мл. Могут быть использованы как кристал-
лические, так и ампулированные фармацевти- либровочные пробы не проводят через стадию
ческие п р е п а р а т ы ; если используются соли, то элюции, а обрабатывают их так же, как и
надо пересчитать на чистое основание. элюаты. Чтобы рассчитать концентрацию кате-
холамина в моче, его содержание в элюате
Х о д о п р е д е л е н и я . Моча, подкислен-
(нг/мл или нмоль/мл) умножают на 0,4, так
ная 6 н. НС1 до рН 3,0, может храниться в за-
как 1 мл элюата соответствует 2,5 мл мочи.
мороженном состоянии без потерь в течение
месяца. Для анализа берут подкисленную мо- П р и м е ч а н и я . 1 . Флюоресцирующие
чу, стоявшую по крайней мере одну ночь в хо- продукты, образующиеся при определении
лодильнике, за это время максимальное коли- норадреналина, быстро окисляются кисло-
чество солей успевает выпасть в осадок. К 15 мл родом воздуха, поэтому свечение падает.
отфильтрованной мочи добавляют 200 мг ЭДТА Гидросульфит натрия, поглощая кисло-
и 1 н. раствором NaOH доводят рН до 8,2 п р и род воздуха, делает флюорофоры более
тщательном перемешивании и под контролем стойкими, слишком энергичное перемеши-
рН-метра. Колонки для хроматографии диа- вание способствует аэрации раствора и
метром около 7 мм заполняют окисью алюми- уничтожает защитное действие гидросуль-
ния, для чего 1,2 г А12О3 взбалтывают в 3 мл фита. 2. Если при рН 6,2 проводить окисле-
воды и вносят в колонку, н и ж н и й конец кото- ние так же, как и при рН 4,2, т. е. после до-
рой рыхло закрыт ватой, прокипяченной в воде бавления фосфатного буфера к элюату доба-

256
вить 0,5 мл 0,25 % раствора феррицианида но перемешивать механической мешалкой в
и точно через 2 мин 0,2 мл 0,3 % раствора течение часа. К этому количеству добавляется
аскорбиновой кислоты в 5 н. NaOH, то бу- 9 мл воды до образования густой массы, кото-
дет определена сумма адреналина и нор- рую после тщательного перемешивания с по-
адреналина. 3. В целом определение адре- мощью специального аппарата наносят на обез-
налина более надежно, чем норадреналина; жиренную стеклянную пластину размером
основная ошибка анализа связана с гаше- 8X18 см слоем толщиной 0,25 мм. Пластину
нием флюоресценции посторонними ве- высушивают на воздухе в защищенном от пы-
ществами, что проявляется в том, что до- ли месте на протяжении 2 ч, а затем прогре-
бавки адреналина или норадреналина к мо- вают при 120 °С еще 2 ч. Хранят в плотно
че определяются не полностью. Этот эффект закрытом эксикаторе над хлоридом кальция
во многом зависит от качества окиси алю- (для предотвращения впитывания паров воды).
миния, поэтому при налаживании методики Свежесобранную суточную мочу подкисляют
>келательно проверить полноту открытия НС1 до рН 1,0, ее можно хранить в холодиль-
добавок исследуемых веществ к моче. нике несколько дней. К 1 мл подкисленной мо-
чи добавляют 300 мг порошка NaCI и дважды
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Выведение
экстрагируют ВМК порциями по 3 мл этила-
адреналина 30—80 нмоль/сут (5—15 мкг/сут),
цетата. Этилацетатные экстракты (верхний
норадреналина 20—240 нмоль/сут (7—
слой) отсасывают, объединяют, осушают без-
44 мкг/сут).
водным сульфатом натрия и выпаривают в
токе воздуха при 35—40 °С.
5.7.6. Ванилил-миндальная кислота Сухой этилацетатный остаток растворяют в
0,1 мл этилового спирта и наносят на хрома-
тографическую пластинку небольшими порция-
Метод тонкослойной хроматографии.
ми; следующую порцию наносят на то же место
П р и н ц и п . Ванилил-миндальную кислоту
(ВМК) экстрагируют из мочи этилацетатом, после того, как предыдущая уже высохла.
экстракт упаривают и подвергают тонкослой- Повторно омывают пробирку 0,1 мл этилового
ной хроматографии на силикагеле. Для обна- спирта и наносят на то же место хроматогра-
ружения на хроматограммах и количественно- фической пластинки. Дважды проводят восхо-
го определения используют цветную реакцию дящее хроматографирование так, чтобы слой
растворителя поднимался на 12 см, после этого
с дйазотированным п-нитроанилином.
пластину высушивают и проявляют. Тонкослой-
Р е а к т и в ы . 1. НС1 концентрированная,
ное хроматографирование проводят в спе-
примерно 10 н. 2. Этилацетат '. 3. Натрия суль-
циальных плотно закрывающихся банках или
фат безводный, порошок. 4. Натрия хлорид,
эксикаторах, воздух внутри которых предвари-
порошок. 5. Силикагель марки АСК или КСК,
тельно насыщен п а р а м и растворителя.
порошок, размер зерен 150—175 меш. 6. Гипс
медицинский. 7. Дихлорметан (метиленхлорид). Для проявления пластин их после высуши-
8. Метиловый спирт. 9. Гидрат окиси аммония вания опрыскивают проявляющим диазореак-
(NH 4 OH), 17 % водный раствор, плотность тивом. При этом у самого финиша видно пят-
0,933. 10. Раствор для хроматографирования. но гомованилиновой кислоты, пятно ВМК нахо-
Смешивают 40 мл дихлорметана, 40 мл мети- дится примерно на 4 см выше л и н и и старта
лового спирта и 2 мл 17 % раствора аммиака. (R/ в среднем 0,16), оно окрашивается в ярко-
11. Раствор п-нитроанилина, 1 г/л. 12. Натрия фиолетовый цвет. Пятна соскабливают в про-
нитрит (NaNCb), раствор 2 г/л. 13. Калия кар- бирки, куда добавляют по 2 мл метанольной
бонат (поташ, К.2СО3), раствор 100 г/л. 14. Про- щелочи и 0,1 мл усиливающего диазореактива.
являющий диазореактив. Непосредственно пе- Тщательно перемешивают и через 20 мин
ред употреблением на холоду смешивают 1 центрифугируют, надосадочную жидкость фото-
часть раствора п-нитроанилина, 1 часть раство- метрируют при трех длинах волн: 450; 520 и
ра натрия нитрита и 10 частей раствора пота- 590 нм против экстрактов из соскобов пластин
ша. Смесь годна к употреблению лишь несколь- в участках, где нет ВМК.
ко минут. 15. Усиливающий окраску диазореак- Одновременно с опытными пробами через
тив. Непосредственно перед употреблением на всю процедуру анализа пропускают калибро-
холоду смешивают равные объемы раствора вочные пробы, содержащие 4; 6 и 8 мкг ВМК.
п-нитроанилина и натрия нитрита. Реактив го- Для этого 0,04—0,08 мл калибровочного раст-
ден к употреблению лишь несколько минут. вора, содержащего ВМК в концентрации 100
16. Натрия карбонат (сода, Na 2 CO 3 ), раствор мкг/мл, выливают в порции по 1 мл ацетатно-
20 г/л. 17. Метанольная щелочь. В день опре- го буфера рН 1,96, затем экстрагируют этил-
деления смешивают 1 объем раствора натрия ацетатом так же, как и опытные пробы и т. д.
карбоната и 2 объема метилового спирта. Для расчета сначала вычисляют исправлен-
18. Этиловый спирт. 19. Ацетатный буферный ную величину экстинкции с поправкой на не-
раствор рН 1,96 (концентрация 0,1 М). 20. Ка- специфическое поглощение по формуле:
либровочный раствор, содержащий ВМК в кон-
центрации 100 мг/л в 0,1 н. НС1. E = E520—1/2 • (Е350 +Е590)
Х о д о п р е д е л е н и я . 2,5 г силикагеля
тщательно смешивают с 0,4 г гипса, желатель- как для опытных, так и для калибровочных
проб. По этим данным строят калибровочный
график, который служит для непосредствен-
Очистку см. с. 251.

257
9 п/р В. В. Меньшикова
Т а б л и ц а 41. Содержание гистамина, серотонина и 5-ОИУК




ного расчета содержания ВМК. в моче в микро- способны реагировать с о-фталевым альдегидом
граммах в 1 мл. с образованием флюорофоров, но для серото-
Нормальные величины: 2,5—38 нина эта реакция идет в кислой среде, а для
мкмоль/сут (0,5—7 мг/сут). гистамина — в щелочной. Кроме того, серото-
нин сам обладает флюоресценцией и может,
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Небольшое
реагируя с нингидрином, также давать флюорес-
проходящее повышение свидетельствует о повы-
цирующие соединения.
шении функциональной активности симпатико-
Метод совместного определения гистамина и
адреналовой системы, стойкое повышение
серотонина. П р и н ц и п . Гистамин содержится
бывает при феохромоцитоме.
главным образом в лейкоцитах, серотонин —
в тромбоцитах, поэтому оба вещества опреде-
5.7.7. Гистамин, серотонин ляют в цельной крови после осаждения белков
хлорной кислотой. Для очистки и выделения
используют способность этих соединений при
Биогенные амины — гистамин и серотонин
щелочных рН переходить в органическую фазу, а
(окситриптамин, 5-ОТ) — содержатся главным
при кислых в водную. Анализ завершается изме-
образом в клетках крови (табл. 41), гистамин
рением флюоресценции продуктов конденсации
в базофильных лейкоцитах, а серотонин в тром-
гистамина с ортофталевым альдегидом, а серо-
боцитах, поэтому результаты их определения в
тонина с нингидрином.
цельной крови в большей степени зависят от
Р е а к т и в ы . 1. Калия оксалат, раствор
количества соответствующих клеток. Имеются
13,4 г/л. 2. Хлорная кислота (НСlO 4 ), 1 н. рас-
данные, что и то, и другое вещество, будучи
твор. 3. Натр едкий, растворы 1 н. и 5 н. 4. Натр
добавлено к плазме, связывается с белками —
едкий, 0,1 н. раствор, насыщенный поваренной
гистамино- и серотонинопексия.
солью. К 0,1 н. NaOH добавляют кристаллы
Гистамин освобождается при анафилактиче-
поваренной соли в таком количестве, чтобы на
ских и аллергических реакциях, но в целом
дне все время был осадок. 5. Натрия хлорид,
клиническое значение результатов его определе-
сухой порошок. 6. HCI, 0,1 н. раствор. 7. Фосфат-
ния невелико. Серотонин образуется в клетках
ный буферный раствор рН 8,0, концентрации
желудочно-кишечного тракта и продуцируется
особым видом опухолей — карциноидом. Основ- 1/15 моль/л. 8. Хлороформ. 9. Бутиловый спирт
ной метаболит серотонина — 5-оксииндолилук- нормальный (н-бутанол). 10. Бутанол-хлоро-
сусная кислота — выводится с мочой в виде форменная смесь. Смешивают 150 мл н-бута-
парных соединений с серной и глюкуроновой нола и 100 мл хлороформа. 1 1 . Кислота фос-
кислотами. Особенно информативно повышение форная, 1,5 моль/л: 17,3 мл имеющейся в про-
содержания серотонина в плазме и оксииндоли- даже 85 % фосфорной кислоты доводят водой до
луксусной кислоты в моче при карциноидах объема 100 мл. 12. Ортофталевый альдегид,
кишечника или легких, некоторое увеличение раствор 1 г/л в абсолютном метаноле '.13. Нин-
может быть и при заболеваниях желудочно- гидрин, раствор 100 ммоль/л. Растворяют 180 мг
кишечного тракта. нингидрина в 10 мл воды. 14. Калибровочные
Как гистамин, так и серотонин обычно опре- растворы гистамина и нингидрина, содержащие
деляют после разрушения клеток и осаждения по 100 мг/л в 0,01 н. НС1. Для приготовления
белков, но и при этом теряется до 40 % исход-
ного содержания биогенного амина; лучшие
результаты получаются при разрушении клеток
замораживанием — оттаиванием. Оба вещества См. с. 259.
258
можно использовать серотонинкреатинсульфат, деляют в кислой фазе флюорометрическим мето-
2,312 мг которого эквивалентны 1 мг серотонина дом после конденсации с ортофталевым альдеги-
основания. дом.
Х о д о п р е д е л е н и я . Кровь берут в про- Р е а к т и в ы . 1. Натрия оксалат, раствор
бирку, содержащую 1,34 % раствор оксалата 13,5 г/л. Растворяют 1,35 г натрия оксалата
натрия в количестве, составляющем 1/10 от в 100 мл воды. 2. Кислота хлорная, 1 моль/л,
предполагаемого количества крови. К 1 мл крови имеет концентрацию 1 н. или 10 %. 3. Натр
приливают 1 мл воды и 1 мл н. хлорной кислоты, едкий, растворы 1 н. и 5 н. Готовят, растворяя
перемешивают и через 30 мин центрифугируют. соответственно 4 или 20 г NaOH в воде, объем
К 2 мл надосадочной жидкости добавляют 0,2 мл доводят до 100 мл. 4. Натрия хлорид в виде
5 н. NaOH, 1 г порошка хлорида натрия и 4 мл сухого порошка. 5. НС1 0,1 н. 6. Натр едкий, 0,1 н
бутанол-хлороформенной смеси, встряхивают раствор, насыщенный поваренной солью. Добав-
3 мин, а затем центрифугируют для разделения ляют кристаллический NaCl в 0,1 н. NaOH в
слоев. Водную фазу удаляют, а к органической таком количестве, чтобы на дне флакона все
добавляют 2 мл 0,1 н. NaOH, насыщенного хло- время был осадок нерастворившейся соли.
ридом натрия, встряхивают и центрифугируют, 7. Бутиловый спирт нормальный (н-бутанол).
3,5 мл органической фазы переносят в другие 8. Хлороформ, лучше использовать марки «для
пробирки, где экстрагируют 2,5 мл 0,1 н. НС1. наркоза». 9. Бутанол-хлороформенная смесь:
После разделения фаз из кислотной (верхней) смешивают 150 мл н-бутанола и 100 мл хлоро-
фазы отбирают порции по 1 мл, которые исполь- форма. 10. Метиловый спирт (метанол), не
зуют для определения гистамина и серотонина. содержащий воды. 11. Ортофталевый альдегид,
Для определения гистамина раствор 1 г/л в абсолютном метаноле. Жела-
к 1 мл кислотной фазы добавляют 0,2 мл 1 н. тельно использовать ампулированный препарат,
NaOH и 0,1 мл раствора ортофталевого альде- в случае необходимости ортофталевый альдегид
гида в метаноле. Через 4 мин приливают 0,1 мл можно очистить перекристаллизацией из лиг-
1,5 М фосфорной кислоты, доводят объем до роина. Для приготовления реактива используют
5 мл и измеряют флюоресценцию при длине абсолютный (не содержащий воды) метиловый
волны 470 нм при возбуждении светом с длиной спирт. 12. Ортофосфорная кислота, раствор
волны 360—365 нм. 1,5 моль/л. 17,3 мл изготовляемой пром.ышлен-
Для определения серотонина ностью 85 % фосфорной кислоты (Н 3 РО 4 ) плот-
к 1 мл кислотной фазы добавляют 1 мл фосфат- ности 1,65 доводят водой до объема 100 мл.
ного буфера рН 8,0 (при этом в растворе должен 13. Калибровочные растворы готовят на 0,4 н.
установиться рН 7,0) и 0,2 мл 0,1 М раствора хлорной кислоте, растворяя 1,63 мг крис-
нингидрина. Смесь инкубируют 30 мин при таллического гистаминхлорида или 1 мг гиста-
мина основания в 100 мл 0,4 н. НС1О4. И в том, и
75 "С, затем еще 1 ч выдерживают при комнат-
в другом случае получается раствор, содержа-
ной температуре, доводят объем до 5 мл и изме-
ряют флюоресценцию в области 490 нм при щий 10 мг/л. Хранят в замороженном состоянии
возбуждении светом с длиной волны 365 нм. в полиэтиленовом (стеклянный может лопнуть!)
Для калибровки берут пробы, содержащие флаконе. Из него готовят рабочий калибровоч-
по 0,05 и 0,1 мкг серотонина и гистамина соответ- ный раствор с концентрацией 1 мкг/мл в 0,4 н.
ственно, доводят водой до объема 1,5 мл и при- хлорной кислоте.
ливают 0,5 мл 1 н. хлорной кислоты. В холостой Х о д о п р е д е л е н и я . Кровь берут в про-
опыт берут 1,5 мл воды и 0,5 мл 1 н. хлорной кис- бирку, содержащую раствор натрия оксалата
лоты. Калибровочные и холостую пробы экстра- в количестве 1/10 от предполагаемого количе-
гируют бутанол-хлороформенной смесью после ства крови. К 4 мл оксалатной крови добавляют
добавления 0,2 мл 5 н. NaOH и обрабатывают равный объем 1 н. хлорной кислоты, перемеши-
так же, как и опытные пробы. Свечение холостой вают и через 10 мин центрифугируют. К 4 мл
пробы вычитают из результатов, полученных надосадочной жидкости добавляют 0,5 мл 5 н.
для опытных и калибровочных проб. NaOH, 1,5 г сухого порошка поваренной соли и
Р а с ч е т проводят по калибровочному гра- хорошо перемешивают, затем приливают 10 мл
фику, по данным которого рассчитывают содер- смеси бутанол — хлороформ, встряхивают 5 мин,
жание гистамина или серотонина в пробе. Чтобы центрифугируют и водную фазу удаляют. К
узнать содержание в 1 мл цельной крови, полу- органической фазе добавляют 5 мл 0,1 н. NaOH,
ченные результаты умножают на 3/2, так как насыщенного хлоридом натрия, встряхивают,
в опыт взято 2 мл хлорного экстракта крови из центрифугируют и водную фазу удаляют. Точно
общего объема 3 мл. 8 мл органической фазы переносят в пробирку,
Определение гистамина в цельной крови, содержащую 3 мл 0,1 н. НС1, и встряхивают
унифицированный метод по реакции с ортофта- 3 мин, при этом гистамин переходит в кислотную
левым альдегидом. П р и н ц и п . Гистамин фазу, которую и используют для дальнейшего
содержится главным образом в лейкоцитах, анализа.
поэтому определение выполняется в цельной К 2 мл кислотной фазы добавляют 0,4 мл
крови, а не в сыворотке или плазме. Белки осаж- 1 н. NaOH и 0,12 мл 0,1 % раствора ортофтале-
дают хлорной кислотой, добавлением едкого вого альдегида в метаноле, а через 4 мин еще
натра устанавливают щелочную реакцию, кото- 0,2 мл 1,5 М ортофосфорной кислоты. После
рая необходима для экстракции смесью бута- этого измеряют флюоресценцию при длине вол-
нола и хлороформа. После промывания экст- ны 460 нм при возбуждении светом с длиной
ракта гистамин реэкстрагируют кислотой и опре- волны 360 нм. Из показателя опытной пробы

259
вычитают результаты измерения холостого опы- 5-ОИУК; их подкисляют и обрабатывают так же,
та, в который вместо крови берут соответствую- как и опытные пробы. По результатам измерений
щее количество воды. строят калибровочный график, который позво-
Р а с ч е т проводят п о калибровочному гра- ляет непосредственно определить количество
фику, для построения которого пробы, содержа- микрограммов 5-ОИУК в 1 мл мочи.
щие 0,1; 0,5 и 1 мкг гистамина в 4 мл 0,4 н. хлор-
П р и м е ч а н и е . При заболеваниях, сопро-
ной кислоты, обрабатывают так же, как и кровь.
вождающихся нарушениями аминокислот-
При окончательном расчете учитывают, что в
ного обмена, необходима дополнительная
опыт взято 4 мл крови, поэтому в 1 мл содержа-
очистка, которая заключается в том, что
ние гистамина в 4 раза меньше.
после упаривания этилацетатного экстракта
и растворения сухого остатка в этаноле отби-
рают 0,1 мл, к которым добавляют 3 мл воды
5.7.8. 5-Оксииндолилуксусная кислота и 2 мл хлороформа, встряхивают и переносят
водную фазу в чистую пробирку, где прово-
Определение 5-оксииндолилуксусной кис- дят цветную реакцию, как описано выше.
лоты в моче. Унифицированный метод по реак-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Суточное
ции с а-нитрозо-b-нафтолом. П р и н ц и п . Диа-
выведение 5-ОИУК у взрослых 10—
зотированный а-нитрозо-b-нафтол реагирует с
20 мкмоль/сут.
5-оксииндолилуксусной кислотой (5-ОИУК) с
образованием окрашенных в сиреневый цвет
Л и т е р а т у р а . Лаб. дело, 1973, № 10,
продуктов. Для повышения специфичности опре-
с. 637—638.
деления 5-ОИУК экстрагируют из подкисленной
мочи этилацетатом, определение ведут в высу- Определение свободной и связанной 5-окси-
шенном экстракте, повторную очистку экстрак- индолилуксусной кислоты в моче по реакции с
цией этилацетатом проводят уже после проведе- а-нитрозо-р-нафтолом. Принцип. Парные
ния цветной реакции. В случае необходимости соединения 5-ОИУК с серной и глюкуроновой
может быть проведен еще третий этап очистки: кислотами гидролизуют нагреванием с хлорной
удаление мешающих веществ хлороформом. кислотой в присутствии унитиола, который пре-
Р е а к т и в ы . 1. HCI, 5 н. раствор. Для его дохраняет определяемые вещества от полного
получения концентрированную НС1 осторожно разрушения. После нейтрализации свободную
смешивают с равным объемом воды. 2. Кислота оксииндолилуксусную кислоту экстрагируют
серная 1 н. 3. Натрия хлорид, насыщенный эфиром, экстракт выпаривают и проводят опре-
раствор. 4. а-Нитрозо-р-нафтол, раствор 1г/л в деление по цветной реакции диазотированным
абсолютном этаноле. 5. Натрия нитрит, водный а-нитрозо-р-нафтолом аналогично тому, как это
раствор 25 г/л. Растворяют 1 г NaNO2 в 40 мл делается в унифицированном методе.
воды. 6. Нитрозокислотный реактив. Непосред- Р е а к т и в ы . 1 . Хлорная кислота концент-
ственно перед употреблением смешивают 0,2 мл рированная, содержащая не менее 42 % НС1О4,
раствора натрия нитрита и 5 мл 1 н. серной т. е. концентрация не менее 4,2 н. 2. Унитиол.
кислоты. 7. Этилацетат (уксусноэтиловый 3. Кали едкое, 4 н. раствор: растворяют 22,4 г
эфир). 8. Абсолютный этиловый спирт. 9. Ка- КОН в 70—80 мл воды, добавляя гранулы щело-
либровочный раствор ОИУК, содержащий чи мелкими порциями, объем доводят водой до
100 мкг вещества в 1 мл воды. 100 мл. 4. Натрия хлорид, сухой порошок. 5. Сер-
Х о д о п р е д е л е н и я . И з общего количе- ная кислота 2 н. 6. Натрия нитрит (NaNO 2 ),
ства суточной мочи отбирают небольшую пор- раствор 25 г/л. 7. Нитрозокислотный реактив:
цию и подкисляют ее 5 н. НС1 до рН 1,0. 1,5 мл непосредственно перед употреблением смеши-
подкисленной мочи смешивают с 1,5 мл насы- вают 0,2 мл раствора нитрита натрия и 5 мл 2 н.
щенного водного раствора хлорида натрия и серной кислоты. 8. а-Нитрозо-р-нафтол, раствор
дважды экстрагируют этилацетатом порциями 1 г/л в абсолютном спирте. 9. Эфир (диэтиловый
по 4 мл. Оба экстракта смешивают и упаривают эфир), лучше использовать марки «для нар-
на водяной бане при температуре не выше 47 °С коза». 10. Этилацетат (этилово-уксусный эфир).
досуха. Сухой остаток растворяют в 0,15 мл 11. Калибровочный раствор, содержащий 100 мг
абсолютного этанола и из этого количества 5-оксииндолилуксусной кислоты в 1 л воды.
0,1 мл переносят в чистую сухую пробирку, куда Х о д о п р е д е л е н и я . Определение сум-
добавляют также 2,9 мл воды, а затем 0,3 мл марной (свободной и связанной) оксииндоли-
спиртового раствора а-нитрозо-b-нафтола, а луксусной кислоты. Из суточной мочи отбирают
затем 0,3 мл свежеприготовленного нитрозокис- порцию 5 мл, к которой добавляют 0,1 г уни-
лотного реактива. Перемешивают и нагревают тиола, 1 мл концентрированной хлорной кислоты
на водяной бане при 47 °С в течение 7 мин. К и нагревают 15 мин на кипящей водяной бане.
неостывшему раствору добавляют 3 мл этилаце- После охлаждения добавляют 4 н. КОН до тех
тата и встряхивают. После разделения фаз ниж- пор, пока рН не станет равным 2,0; выпавший
ний слой приобретает сиреневую окраску, его осадок отделяют фильтрованием. К фильтрату
отсасывают и фотометрируют при длине волны добавляют 1 г хлорида натрия (примерно) и
526 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см экстрагируют 13 мл эфира в течение 30 мин на
против холостого опыта, в который берут вместо аппарате для встряхивания. После разделения
мочи 1,5 мл воды. фаз, для чего может потребоваться центрифуги-
Одновременно ставят калибровочный опыт, в рование, отбирают 8 мл эфирного экстракта
который берут пробы, содержащие 10—100 мкг и переносят в чистую сухую пробирку, где выпа-

260
ривают досуха на водяной бане при 40 °С. Сухой досуха, так же как при определении общей
остаток растворяют в 2 мл воды, приливают 1 мл 5-ОИУК. Дальнейшее определение проводят,
раствора нитрозонафтола и 1 мл нитрозокислот- как описано выше в предыдущем разделе.
ного реактива, перемешивают и ставят на 10 мин Построение калибровочного
на водяную баню при 37 °С. Для удаления графика и р а с ч е т . Для построения
избытка нитрозонафтола приливают 10 мл эти- калибровочного графика 5 мл пробы, содержа-
лацетата и встряхивают. После разделения сло- щей 10—100 мкг 5-ОИУК в виде водного раст-
ев внизу оказываются хромогены синего цвета, вора, обрабатывают так же, как опытные пробы,
этот слой переносят в кювету с толщиной опти- включая гидролиз хлорной кислотой, ее удале-
ческого слоя 1 см и фотометрируют при длине ние в виде калиевой соли и экстракцию эфиром
волны 540 нм против холостой пробы. Холостую и т. д. Линейность графика сохраняется до
пробу готовят так же, как и опытную, но вместо 70 мкг в пробе. Чтобы узнать содержание
эфирного экстракта мочи берут 8 мл эфира, 5-ОИУК в 1 мл мочи, полученную по калибро-
который выпаривают и сухой остаток обрабаты- вочному графику величину делят на 5 (так
вают, как описано выше. как в пробу берется 5 мл мочи), чтобы узнать
Определение свободной оксииндолилуксус- суточное выведение, умножают на суточный
ной кислоты. К 5 мл мочи из суточного количе- диурез.
ства добавляют 2 н. серную кислоту в таком Для определения свободной 5-ОИУК строят
количестве, чтобы рН был 2,0, затем 1 г порошка отдельный калибровочный график, который
хлорида натрия и экстрагируют 13 мл эфира, может несколько отличаться, так как не будет
встряхивая пробу 30 мин на аппарате для встря- потерь, связанных с кипячением с хлорной кис-
хивания; 8 мл эфирного экстракта упаривают лотой. В остальном расчет аналогичен.


5.8. Н Е О Р Г А Н И Ч Е С К И Е ВЕЩЕСТВА
В отличие от других разделов лабораторной процессе формирования сгустка угольная кис-
диагностики, где почти монопольно господствует лота теряется, при этом изменяются соотноше-
фотометрия, при определении неорганических ния эритроцитарного и плазматического объе-
элементов и показателей КЩС широко исполь- мов, что сказывается на концентрации натрия,
зуются и другие физико-химические методы. колебания которой в сыворотке больше, чем в
В связи с тем что анализы выполняются на плазме. По этой причине для точного определе-
приборах — пламенных фотометрах, потенцио- ния надо анализировать плазму, полученную
метрах и т. д., заводские инструкции к которым с гепарином, так как солевые антикоагулянты,
содержат подробные указания о том, как следует изменяя осмотическую концентрацию среды,
работать, в настоящем разделе описывается вызывают сморщивание эритроцитов и разведе-
только химическая сторона методик, а п р и н ц и п ы ние плазмы. Некоторые препараты гепарина
устройства аппаратуры и советы о том, как ее содержат много натрия, тогда надо вводить на
лучше использовать, вынесены в главу 1.6. него поправку. Результаты определения натрия
в плазме в целом имеют то же клиническое зна-
чение, что и результаты определения осмотиче-
5.8.1. Натрий и калий ской концентрации.
Клинико-диагностическое значение опреде-
ления натрия и калия в эритроцитах невелико,
Несмотря на то что физиологические функ-
это скорее область научных исследований, а не
ции натрия и калия в организме различны, для
практической медицины.
их определения используют одинаковые физиче-
ские принципы. Подавляющая часть калия в Выведение натрия с мочой относительно
организме находится внутри клеток, и его кон- равномерно на протяжении суток, в то же время
центрация в плазме, которая лишь очень при- экскреция калия имеет четкий пик в утренние
близительно отражает общее содержание эле- часы, соответственно возрастает и отношение
мента в организме, может колебаться в значи- K/Na, которое коррелирует с активностью глю-
тельных пределах, особенно у тяжелобольных. кокортикоидов. Минералокортикоид альдосте-
Она тесно связана с состоянием кровообраще- рон вызывает задержку натрия в организме,
ния и кислотно-щелочного равновесия, поэтому увеличивая отношение K/Na мочи.
определение калия в плазме или сыворотке — Унифицированный метод фотометрии пла-
один из важнейших показателей в реанимацион- мени. Определение в сыворотке и плазме крови.
ной клинике. П р и н ц и п . Разведенная водой плазма или
Натрий почти исключительно внеклеточный сыворотка крови распыляется и в виде мельчай-
элемент, его общее количество хорошо коррели- ших капелек с током воздуха поступает в пламя
рует с объемом межклеточной жидкости. У каж- газовой горелки, которому калий придает слабое
дого индивидуального человека концентрация красно-фиолетовое, а натрий ярко-желтое окра-
натрия в плазме поддерживается с большим шивание. Интенсивность окраски измеряется
постоянством, физиологические колебания, как фотоэлементом. В связи с тем, что концентрация
правило, меньше, чем точность обычных лабора- калия в плазме невелика, при его определении
торных методов, но межиндивидуальные колеба- калибровочный раствор должен содержать
ния гораздо выше. При получении сыворотки в также соли натрия, а при некоторых конструк-

261
рабочие калибровочные растворы путем разве-
циях прибора и соли кальция. Натрия в плазме
дения водой во столько же раз, во сколько разво-
много и он ярко окрашивает пламя, поэтому
дят и исследуемую плазму или сыворотку, жела-
калибровочный раствор может содержать толь-
тельно с использованием тех же пипеток, дозато-
ко соли натрия.
ров и мерных колб.
Приготовление калибровоч-
5. Если чувствительность пламенного фото-
н ы х р а с т в о р о в . Есть два способа приго-
товления калибровочных растворов. В первом метра такова, что исследуемую плазму крови для
случае сначала готовят серию основных калиб- определения надо разводить в 20 раз, рабочие
ровочных растворов, концентрации электроли- калибровочные растворы для определения калия
тов в которых перекрывают возможный диапа- могут быть приготовлены также более простым
зон колебаний состава плазмы, а затем эти способом. Для этого в мерную колбу вмести-
мостью 1 л вносят 7 мл исходного калибровоч-
растворы разводят так же, как и исследуемая
плазма. Этот способ позволяет в максимальной ного раствора NaCl с концентрацией
1000 ммоль/л и 2,5 мл исходного раствора
степени избежать погрешностей, связанных с
СаСОз с концентрацией 100 ммоль/л и доводят
неточностями пипеток, используемых при разве-
дении, но необходим двойной набор посуды — объем до 1 л водой. Получают фоновый раствор
для основных и рабочих растворов. В другом с концентрацией натрия и кальция 7 и
случае сразу готовят рабочие калибровочные 0,25 ммоль/л. Готовят также калибровочный
раствор калия с содержанием 5 ммоль/л, для
растворы, которые имитируют состав разведен-
чего исходный раствор с концентрацией
ной для сжигания плазмы; такой раствор может
100 ммоль/л разводят водой в 20 раз в мерной
быть использован л и ш ь в том случае, если плаз-
ма всегда разводится совершенно одинаково. колбе вместимостью 100 мл. Смешивают оба
раствора, согласно приведенной ниже таблице.
Ниже даются прописи и того, и другого способа,
считая, что первый более подходит для лабора-
торий, где электролиты определяются не очень
часто, второй — для лабораторий, где проводит- Фоновый
Раст-
ся много определений и методику можно счи- Если исследуемый материал,
раствор,
вор
содержащий разведенный 1:20, соответ-
тать хорошо налаженной.
КС1 ствует содержанию
При приготовлении калибровочных раство- 7 ммоль/л
5 в плазме, ммоль/л
ров используют соли натрия, калия и кальция, Na и
ммоль/
0,25 ммоль/л
высушенные в сушильном шкафу при 100—
Са, мл
120 °С. Са
Na
К
1. Натрия хлорид. Исходный калибровочный
раствор, содержащий 1000 ммоль/л. Готовят, 6,0 До 100 140,0 2,5
6,0
растворяя 11,69г NaCI (поваренной соли) вводе 5,0 > 100 140,0 2,5
5,0
и доводя объем до 200 мл. 4,0 » 100 140,0 2,5
4,0
2. Калия хлорид. Исходный калибровочный 3,0 » 100 140,0 2,5
3,0
раствор с концентрацией 100 ммоль/л. Готовят,
растворяя 0,746 г K.CI в воде и доводя объем до
100 мл.
3. Кальция карбонат. Исходный калибровоч- 6. Основной калибровочный раствор для
ный раствор, содержащий 100 ммоль/л. Готовят, определения натрия готовят, помещая в мерную
растворяя 1,001 г СаСОз (кальция карбоната) колбу вместимостью 100 мл 12—18 мл исходного
в 1 н. HCI и доводя объем до 100 мл той же кис- раствора с концентрацией Na 1000 ммоль/л,
лотой. затем доводят водой до метки. Получается серия
4. Основной калибровочный раствор для основных калибровочных растворов, которые
определения калия готовят из исходных калиб- содержат натрий в концентрациях от 120 до
ровочных растворов. 180 ммоль/л. Для построения калибровочного
При построении калибровочного графика из графика каждый из этих растворов разводят
основного калибровочного раствора готовят в 100 раз, желательно с помощью тех же пипеток
или дозаторов и мерных колб, которые использу-
ются при разведении исследуемого материала.
7. Рабочий калибровочный раствор для опре-
Исходный калибровочный Концентрация, деления натрия в плазме крови можно пригото-
ммоль/л
раствор, мл вить также по следующей прописи: 2 мл исход-
Вода,
ного калибровочного раствора с содержанием
мл
KCI, NaCl, СаСОз,
к натрия 1000 ммоль/л вносят в мерную колбу
Na Са
100 1000 100
вместимостью 200 мл и доводят до метки водой.
ммоль/л ммоль/л ммоль/л
Из этого раствора, содержащего 10 ммоль/л,
берут по 12—18 мл и вносят в мерные колбы
До 100 6,0 140
6,0 2,5
2,5
14,0
вместимостью 100 мл и доводят водой, до метки.
> 100 5,5 140
5,5 2,5
14,0 2,5
Получается серия растворов, содержащих нат-
> 100 5,0 140
5,0 2,5
14,0 2,5
рий в концентрациях от 1,2 до 1,8 ммоль/л, т. е. в
4,5 140 2,5
» 100
4,5 14,0 2,5
таких, которые соответствуют содержанию нат-
» 100 4,0 140 2,5
4,0 2,5
14,0
рия в плазме крови от 120 до 180 ммоль/л, при
» 100 3,5 140 2,5
2,5
3,5 14,0
условии, что исследуемый материал разводился
140 2,5
» 100 3,0
3,0 2,5
14,0
перед определением в 100 раз.

262
Соответствует содержанию
Содержание в в моче при условии, что она
Основной калибровочный раствор,
100 мл, мкмоль была разведена 1:100,
содержащий 80 ммоль/л Na и Вода, мл
ммоль/л
20 ммоль/л К, мл
К К
Na Na

4,0 320
До 100 320 80 80
280
3,5 » 100 280 70 70
240
3,0 » 100 240 60 60
200
2,5 » 100 200 50 50
160
2,0 » 100 160 40 40



Х о д о п р е д е л е н и я . При определении Содержание калия в плазме или сыворотке
возрастает при ацидозе, печеночной недостаточ-
калия в плазме крови очень важно, чтобы не
ности, передозировке некоторых лекарств. Со-
было гемолиза, так как эритроциты значительно
держание его уменьшается чаще всего в резуль-
богаче этим элементом, чем плазма, и разруше-
тате неправильного применения диуретиков, а
ние даже небольшого их количества приводит к
также при истощении калиевых запасов орга-

<<

стр. 14
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>