<<

стр. 15
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

завышенным результатам. Если есть хоть малей-
низма при некоторых поражениях почечных
шее сомнение в том, что эритроциты удалены
канальцев и при альдостеронизме.
полностью, плазму или сыворотку надо повторно
Унифицированный метод определения в
центрифугировать. В связи с тем, что калий,
моче. П р и н ц и п . Определение натрия и калия
хотя и медленно, но выходит из эритроцитов
в моче аналогично их определению в плазме
через неповрежденную мембрану, предпочти-
тельнее использовать для исследования плазму, крови с той разницей, что размах физиологиче-
ских колебаний здесь больше, а различие между
которую получают центрифугированием в тече-
концентрациями Na и К не так велико, как в
ние 15 мин при 3000 об/мин не позднее чем через
плазме, поэтому требования к точности меньше
45—60 мин после взятия крови.
Обычно для определения калия исследуемую и можно работать с общим калибровочным раст-
вором.
плазму разводят водой в 20 раз, а для определе-
Приготовление калибровоч-
ния натрия в 100 раз, но разведения могут быть
и другими в зависимости от чувствительности н о г о р а с т в о р а . Используют т е ж е исход-
прибора. Определение начинают с того, что ные калибровочные растворы, что и при анализе
плазмы. Для приготовления основного калибро-
сжигают серию калибровочных растворов, за-
вочного раствора в мерную колбу вместимостью
тем исследуемые пробы и снова калибровочные
растворы, определение считают успешным, если 100 мл вносят 8 мл исходного калибровочного
раствора хлорида натрия, содержащего
калибровка, полученная вначале, совпадает с
1000 ммоль/л ', и 20 мл раствора хлорида к а л и я ,
полученной в конце.
содержащего 100 ммоль/л 2, и доводят водой до
Результаты рассчитывают по
калибровочному г р а ф и к у . После метки 100 мл. Получается раствор, содержащий
окончания анализа надо с особой тщатель- 80 ммоль/л Na и 20 ммоль/л К. Из него готовят
ностью промыть и просушить распылитель, разведения согласно приведенной выше таблице.
согласно заводской инструкции. Это очень Х о д о п р е д е л е н и я . Если в исследуемом
ответственная и легко повреждаемая деталь материале имеется осадок, его тщательно пере-
прибора, коррозия которой или засорение делает мешивают, 0,5 мл мочи вносят в мерную колбу
невозможным выполнение анализа. вместимостью 50 мл и доводят до метки водой
либо 1 мл вносят в колбу вместимостью 100 мл и
Содержание натрия в плазме крови опреде-
доводят водой до метки. На пламенном фотомет-
ляют так же, как и содержание калия, с той
ре сжигают сначала калибровочные растворы,
разницей, что исследуемый материал разводят,
затем исследуемые и снова повторяют калиб-
как правило, в 100 раз и используют калибровоч-
ровку.
ный раствор для определения натрия.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Содержа-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Содержа-
ние натрия в моче может колебаться от ничтож-
ние натрия в плазме 130—156 ммоль/л, содер-
ных величин до 320—340 ммоль/л, калия — до
жание калия 3,4—5,3 ммоль/л.
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Значитель- 80—100 ммоль/л.
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Выведение
ное увеличение или уменьшение содержания
натрия возрастает при спадении отеков, умень-
натрия в плазме или сыворотке наступает пото-
шается при их развитии. Высокое выведение ка-
му, что человек в процессе дегидратации непро-
порционально теряет воду и соли. Это состояние
требует неотложных лечебных мероприятий.
Увеличение выведения натрия с мочой — обычно
благоприятный симптом, оно бывает при рас-
' Реактив 1, с. 262.
сасывании отеков или выпотов, а также под
2
Реактив 2, с. 262.
влиянием лечения диуретиками.

263
л и я бывает при неправильно подобранной гипо-
Соответствует
Раствор, Фоновый
тензивной терапии. Концен- содержанию
содержащий раствор
трация, натрия в эритро-
Унифицированный метод определения в эрит- 10 ммоль/л КС1 3,3
ммоль/л цитах при разве-
роцитах. П р и н ц и п . Эритроциты отделяют NaCl и ммоль/л,
центрифугированием, гемолизируют водой и оп- дении 1:26,
3,3 ммоль/л
ммоль/л
KCI, мл Na
ределяют содержание электролитов методом К
фотометрии п л а м е н и . В связи с тем что между
эритроцитами всегда остается некоторое количе- 0,5 13,0
5 До 100 3,3
ство плазмы, большое значение имеет единооб- 15,6
6 » 100 0,6
3,3
разие режимов ц е н т р и ф у г и р о в а н и я ; приведен- 18,2
0,7
7 » 100 3,3
ный ниже режим рекомендован в качестве уни- 20,8
8 » 100 0,8
3,3
фицированного.
Приготовление калибровоч-
н ы х р а с т в о р о в . В качестве исходных
используют те же растворы, что и при определе-
нии натрия и к а л и я в плазме. Из упакованного слоя эритроцитов берут пробу,
1. Рабочий калибровочный раствор для опре- которую разводят для определения калия в 260
деления калия в эритроцитах. В мерную колбу раз, а для определения натрия — в 26 раз водой.
вместимостью 100 мл вносят 3,84 мл исходного Пробы сжигают одновременно с калибровочны-
калибровочного раствора КС1, содержащего ми растворами. Расчет проводят по калибро-
100 ммоль/л ', и доводят объем водой до 100 мл; вочному графику.
получается основной калибровочный раствор с Нормальные величины: натрий
концентрацией 3,84 ммоль/л. Из него готовят 13—22 ммоль/л, к а л и й 77—96 ммоль/л.
разведения согласно приведенной ниже таблице. К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Высокое
содержание натрия в эритроцитах бывает у лиц
с наследственной предрасположенностью к ги-
пертонической болезни.
Соответст-
вует содер-
Раствор жанию к а л и я
Концентра-
КС1 3,84 в эритроци-
Вода, мл ция калия, 5.8.2. Кальций
ммоль/л, тах при р а з -
ммоль/л
мл ведении
1:260, Около 40 % всего кальция плазмы крови
ммоль/л связано с белком, еще примерно 5 % образуют
комплексы с лимонной, фосфорной или угольной
кислотой, остальной к а л ь ц и й находится в физио-
7,5 До 100 0,288 75 логически активном, ионизированном состоянии.
8,0 » 100 0,308 80 Доля кальция, связанного с белками (так назы-
8,5 85
» 100 0,327 ваемый неультрафильтруемый кальций), зави-
9,0 » 100 90
0,346 сит от содержания протеина в плазме крови,
9,5 » 100 95
0,365 поэтому четкой количественной связи между
общим и ионизированным кальцием не сущест-
вует, и тот, и другой параметр имеют клиниче-
ское значение. Во м н о г и х физиологических и
2. Рабочий калибровочный раствор для опре-
патологических ситуациях представляет интерес
деления натрия в эритроцитах. В мерную колбу
именно содержание ионизированного кальция,
вместимостью 1 л вносят 33 мл исходного калиб-
но, к сожалению, он может быть определен л и ш ь
ровочного раствора KCI, содержащего
с помощью специальных кальциевых электро-
100 ммоль/л ', и доводят до 1 л; получается фо-
дов, аналогичных электродам для определения
новый раствор, содержащий 3,3 ммоль/л КС1. В
рН, которые недоступны практическим лабора-
колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл исход-
ториям. Содержание общего кальция точнее все-
ного калибровочного раствора NaCl, содержа-
го может быть определено методом атомной
щего 1000 ммоль/л 2, и доводят до объема 100 мл абсорбционной спектроскопии; в данном случае
фоновым раствором, содержащим 3,3 ммоль/л
этот метод может быть п р и н я т в качестве рефе-
KCI; получается раствор, содержащий 10 ммоль/л
рентного.
NaCl и 3,3 ммоль/л KCI. Из полученных
Предложено много х и м и ч е с к и х методов опре-
растворов готовят разведение, согласно сле- деления кальция в сыворотке крови и в моче; они
дующей таблице. основаны главным образом на способности
Х о д о п р е д е л е н и я . Кровь для исследо- образовывать окрашенные соединения с комплек-
вания берут с гепарином из расчета 5 мг сонами, т. е. веществами, образующими прочные
(650 ЕД) на 1 мл, центрифугируют 15 м и н при
комплексы с металлами. Здесь можно выделить
3000 об/мин, отсасывают плазму с верхним сло- две подгруппы — либо общее количество комп-
ем эритроцитов и снова ц е н т р и ф у г и р у ю т
лекса непосредственно определяется фотомет-
30 мин при 3000 об/мин и удаляют верхний слой.
рией, либо о к р а ш е н н ы й комплекс используется
лишь как индикатор конца т и т р о в а н и я , методы
1
второй группы сейчас практически не находят
Реактив 2, с. 262.
применения.
2
Реактив 1, с. 262.

264
К сожалению, ни один из описываемых ниже
Основной ка-
методов не обладает бесспорными преимуще-
либровочный Раствор Концентра-
ствами, чтобы полностью вытеснить все осталь-
Вода, мл ция кальция.
магния
раствор
ные. Большинство работников отдает предпочте-
25 ммоль/л 3 м г / м л , мл ммоль/л
ние методу с крезолфталеинкомплексоном, кото- Са, мл
рый принят в качестве унифицированного. При-
нятый ранее в качестве унифицированного метод
с глиоксаль-бис-2-оксианилином, видимо, менее 6,0 1,5
1,0 До 100
точен, но для этого метода чехословацкое пред- 8,0 1,0 2,0
» 100
приятие «Лахема» выпускает готовые наборы 10,0 1,0 2,5
» 100
реактивов, которые продолжают совершенство- 12,0 3,0
1,0 100
»
ваться. Самый старый метод с мурексидом так- 1,0
14,0 3,5
» 100
же продолжает использоваться в некоторых
лабораториях, наконец, самый чувствительный
метод с флурексоном имеет то преимущество,
что позволяет обходиться м и н и м а л ь н ы м коли-
Через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной
чеством исследуемого материала. Описанный
оптического пути 0,5 см при длине волны 500—
ниже метод унифицирован в 1979 г.
560 нм (зеленый светофильтр) против рабочего
Унифицированный метод по цветной реакции
раствора крезолфталеинкомплексона. Одновре-
с крезолфталеинкомплексоном. П р и н ц и п .
менно обязательно ставят хотя бы одну калибро-
Крезолфталеинкомплексон образует с кальцием
вочную пробу. Расчет ведут по калибровочной
в щелочной среде комплекс красно-фиолетового
кривой либо по правилу пропорций.
цвета, интенсивность окраски пропорциональна
концентрации кальция. В реакционную смесь П р и м е ч а н и е . Некоторые сорта стекла
добавляют 8-оксихинолин, который связывает могут выщелачиваться, отдавая в раствор
металлы, мешающие определению, но образует соли кальция, поэтому лабораторную посуду,
с кальцием менее прочный комплекс, чем крезол- особенно пробирки, желательно предвари-
фталеинкомплексон. тельно прокипятить в соляной кислоте. Опре-
Р е а к т и в ы . 1. Боратный буфер: 200 г деление желательно проводить в сыворотке
борной кислоты (Н3ВОз, ортоборная кислота) или в плазме, полученной из гепаринизиро-
растворяют при нагревании в 300 мл воды, ванной крови, так как щавелевая, лимонная
добавляют 580 мл 5 н. КОН, объем доводят кислота и другие антикоагулянты, связываю-
водой в мерной колбе до 1 л, при температуре щие кальций, могут помешать определению.
ниже 56 °С из раствора могут выпадать кристал-
Литература. Boross M., Szilagyil
лы. 2. Глицин 2 моль/л: 7,5 г глицина растворя-
L Kisrl. Orvostud, 1974, vol. 24, p. 96—
ют в 40 мл воды, переносят в мерную колбу и
102.
доводят объем до 50 мл. Для консервации до-
бавляют 2 капли хлороформа, хранят в холо- Метод определения кальция по цветной реак-
дильнике. 3. 8-Оксихинолин (оксин), 1 % раст- ции с глиоксаль-бис-2-оксианилом. П р и н ц и п .
вор: 500 мг препарата растворяют в 50 мл абсо- Глиоксаль-бис-2-оксианил образует с кальцием
лютного спирта. 4. Рабочий буферный раствор: в щелочной среде окрашенный комплекс красно-
к 300 мл воды добавляют 12,5 мл боратного го цвета, интенсивность которого пропорцио-
буфера и 5 мл раствора глицина, перемешивают нальна концентрации кальция.
и устанавливают величину рН в пределах 10,5— Р е а к т и в ы . 1. Метиловый спирт (мета-
10,6 с помощью 5 н. КОН, добавляют 50 мл 1 % нол) х. ч., безводный. 2. Глиоксаль-бис-2-оксиа-
раствора оксихинолина, переносят в мерную кол- нил (ГБОА), 0,05 % раствор в метаноле, 50 Mi-
бу вместимостью 500 мл и доводят до метки препарата растворяют в 100 мл этанола. Раствор
водой, после чего снова проверяют рН. 5. Кре- нестойкий. 3. Боратный буфер рН 12,6. Раство-
зилфталеинкомплексон, 0,1 % раствор: 10 мг ряют в воде 10 г едкого натра (NaOH) и 10 г
крезилфталеинкомплексона растворяют в 100 мл тетрагидробората натрия (Na 2 B 4 O 7 -10Н 2 О),
основного буферного раствора. При хранении объем доводят до 1 л в мерной колбе. 4. Ацетон
в холодильнике реактив стоек не более 2— х. ч. 5. Смесь метанола и ацетона 9:1 (по
3 дней. 6. Калибровочный раствор. Основной объему). 6. Калибровочные растворы. Основ-
калибровочный раствор, содержащий кальций ной калибровочный раствор, содержащий
в концентрации 25 ммоль/л, готовят, растворяя 25 ммоль/л Са, готовят, растворяя 100 мг карбо-
250 мг кальция карбоната (СаСОз) в 5 мл 1 н. ната кальция (СаСОз) в 5 мл 1 н. HCI и доводя
HCI. Раствор переносят в мерную колбу вмести- объем раствора до 100 мл водой в мерной колбе.
мостью 100 мл и доводят водой до метки. Для Из этого раствора готовят рабочие калибровоч-
консервации добавляют 2 капли хлороформа. ные растворы с концентрацией 1,5—3,5 ммоль/л,
Одновременно готовят раствор солей магния отбирая 6—14 мл в мерную колбу вместимостью
3 мг/мл, растворяя 2,5 г хлорида магния 100 мл и доводя объем водой до метки (приготов-
(MgCl 2 -6H 2 O) в 100 мл воды. Из этих растворов ление аналогично методу, описанному в преды-
готовят рабочие калибровочные растворы, со- дущем методе, но без солей м а г н и я ) .
гласно приведенной ниже таблице. Х о д о п р е д е л е н и я . К 1,5 мл боратного
Х о д о п р е д е л е н и я . К 3 мл рабочего буферного раствора прибавляют 0,02 мл иссле-
раствора крезолфталеинкомплексона добавляют дуемой сыворотки и через l ' / 2 мин 0,5 мл
0,05 мл исследуемой сыворотки, перемешивают. 0,05 % раствора ГБОА в метаноле и еще через

265
1 ' / 2 м и н 1 мл смеси метанола и ацетона. Фото- ных распадах костей, гиперпаратиреоидизме,
метрируют точно через 5—10 мин после добав- гипервитаминозе D. Оно уменьшается при нару-
ления 0,05 % раствора ГБОА при длине волны шении всасывания в кишечнике в результате
540—550 нм в кювете с длиной оптического пути стеатореи или гиповитаминоза D, а также при
1 см против холостой пробы, в которую вместо некоторых почечных тубулопатиях и главным
исследуемой сыворотки берут воду. Одновре- образом недостаточности паращитовидных же-
менно ставят также калибровочную пробу. лез.
Р а с ч е т выполняют п о калибровочному
графику либо по правилам пропорции.
5.8.3. Магний
П р и м е ч а н и е . ГБОА в щелочной среде
распадается с образованием анилина и гли-
Методы определения магния во многом близ-
оксаля, который затем окисляется в глиокса-
ки методам определения кальция, так как и в
левую кислоту, способную образовывать ком-
том, и в другом случае на первом месте по
плексы с кальцием. Даже в растворе абсо-
точности стоит атомная абсорбция, на втором —
лютного метанола на протяжении несколь-
химические методы, основанные на образова-
ких недель реактив разрушается. Накапли-
нии окрашенных комплексных соединений. Хотя
вающаяся глиоксалевая кислота в значи-
магний, подобно кальцию, только частично на-
тельно большей степени сказывается на экс- ходится в плазме крови в ионизированном со-
т и н к ц и и опытных, нежели калибровочных,
стоянии, а частично связан с белками и низко-
проб. Поэтому измерение оптической плот-
молекулярными комплексообразователями —
ности должно проводиться в совершенно
лимонной и фосфорной кислотами, однако кли-
определенное время, причем при длине волны
ническое значение имеет только определение
540—550 нм показания стабильнее, чем при
общего магния.
длине 530 нм, при которой наблюдается
Известно много веществ, образующих окра-
максимум пика.
шенные или флюоресцирующие комплексы с
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы и кли- магнием, аналитическая пригодность их опреде-
н и ч е с к о е з н а ч е н и е те же, что и в пре- ляется чувствительностью и главное способ-
дыдущем методе. ностью избирательно реагировать с магнием в
присутствии кальция. К сожалению, абсолютной
Л и т е р а т у р а . Mayer M., Farese G. C l i n .
избирательности достичь очень трудно, поэтому
Chem., 1966, vol. 12, p. 234. Kao N., Rose Ch. F.
приходится использовать составные калибровоч-
Lab. Pract., 1971, vol. 20, N 3, p. 217—219. ные растворы, в которых присутствует несколько
Метод определения кальция по цветной реак- веществ.
ции с мурексидом в присутствии глицерина. Давно известен не очень чувствительный
П р и н ц и п . Мурексид образует с кальцием в метод определения с титановым желтым, кото-
щелочной среде окрашенный комплекс, устойчи- рый достаточно специфичен, но требует предва-
вость которого повышается путем добавления в рительной депротеинизации, благодаря чему
раствор глицерина. может быть использован для определения маг-
Р е а к т и в ы . 1 . Мурексидглицериновый ния в эритроцитах. Значительно чувствительнее
метод с магоном (ксилидиновым синим II) или
реактив: 20 мг мурексида растворяют в 10 мл 4 н.
КОН, 1 мл этого раствора смешивают с 20 мл его сульфопроизводным (ксилидиновый си-
смеси из 10 мл воды и 10 мл глицерина. 2. Калиб- ний I ) . В кислой среде это вещество существует
ровочные растворы готовят так же, как и в пре- в виде окрашенного в красный цвет недиссоции-
дыдущем методе '. рованного соединения, в слабощелочной — в
Х о д о п р е д е л е н и я . В 0,3 мл воды вно- виде однозарядного иона синего цвета, а в силь-
сят 0,1 мл исследуемой сыворотки, затем туда нощелочной — в виде двухзарядного иона крас-
ного цвета. С ионом магния образуют устойчи-
же добавляют 3 мл мурексилглицеринового
реактива, перемешивают и через 5 мин фото- вый окрашенный в красный цвет комплекс два
метрируют в кювете с длиной оптического пути однозарядных иона. Методы с титановым жел-
I см при длине волны 490 нм против холостой тым и магоном унифицированы в 1974 г.
пробы, в которую вместо исследуемой сыворотки Определение магния по цветной реакции с
титановым желтым. П р и н ц и п . Магний в
берут воду. Одновременно ставят калибровоч-
ную пробу, в которую вместо сыворотки берут щелочной среде образует комплекс красного
0,1 мл калибровочного раствора. цвета с титановым желтым, присутствие гидро-
Р а с ч е т производят п о калибровочному ксиламина стабилизирует окраску. При анализе
графику. сыворотки или эритроцитов белки осаждают
вольфраматом натрия, моча предварительно
Л и т е р а т у р а . Вишневская Т. М., Ля-
разводится до нужной концентрации.
шевская Т. Н. Лаб. дело, 1976, № 7, с. 444.
Р е а к т и в ы . 1. 0,075 % раствор титанового
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы для всех
желтого: 18,7 мг вещества растворяют в 25 мл
приведенных методов 2,3—2,75 ммоль/л (9—
воды, хранят в холодильнике в темной склянке;
11 мг в 100 мл).
реактив очень светочувствителен, годен не более
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Содержа-
10 дней. 2. 2 % раствор гидрохлорида гидрокси-
ние кальция в сыворотке повышается при массив-
л а м и н а : 2 г гидроксиламинагидрохлорида
( H 2 N O H - H C 1 ) растворяют в 100 мл воды.
3. 0,1 % раствор метилового красного в 95 %
См, с. 265.
266
этиловом спирте, индикатор с зоной перехода П р и м е ч а н и е . Чехословацкая фирма
рН 4,4—6,2. 4. 0,2 н. NaOH. 5. 1,5 н. NaOH. «Лахема» выпускает набор реактивов для
6. 10 % раствор вольфрамово-кислого натрия: работы этим методом.
10 г вольфрамата н а т р и я ( N a 2 W O 4 ) растворяют
Р е а к т и в ы . 1. Раствор магона, содер-
в воде, объем доводят до 100 мл. 7. 0,67 н. серная
жащий 0,28 ммоль/л: 115,4 мг магона при
кислота. 8. Калибровочный раствор магния
нагревании растворяют в 50 мл диметилфор-
сульфата 1 ммоль/л: 246,5 мг сульфата магния
мамида, объем доводят до 1л 96 % этило-
(MgSO 4 -7H 2 O) растворяют в воде, объем дово-
вым спиртом. 2. 0,02 М боратный буфер рН
дят в мерной колбе до 1 л.
9,5: примерно в 800 мл воды растворяют
Х о д о п р е д е л е н и я . К 2 м л воды добав-
7,63 г буры (Na 2 B 4 O 7 - 10H 2 O), прибавляют
ляют 1 мл исследуемой сыворотки и 1 мл 10 %
79 мл 0,1 н. NaOH и проверяют рН, добав-
вольфрамата натрия, затем 1 мл 0,67 н. серной
ляют столько щелочи, сколько необходимо,
кислоты. Перемешивают стеклянной палочкой,
чтобы рН был 9,5, после чего водой доводят
а затем через 10—15 мин центрифугируют или
объем до 1 л. 3. Рабочий раствор магона. В день
фильтруют. В градуированную пробирку или
определения смешивают равные части раствора
мерный цилиндр с отметкой 10 мл отмеривают
магона и боратного буфера. Реактив нестоек,
2,5 мл безбелкового фильтрата, добавляют кап-
годен в течение одного рабочего дня. 4. Комп-
лю индикатора метилового красного и 0,2 н.
лексный калибровочный раствор: 200 мг метал-
NaOH до установления желтой окраски. После
лического м а г н и я в виде стружки промывают
этого прибавляют 1 мл 2 % гидрохлорида гидро-
разбавленной НС1, водой, спиртом и эфиром,
ксиламина, 1 мл 0,075 % титанового желтого
высушивают сначала в токе азота, затем под
и 2 мл 1,5 н. NaOH и доводят объем водой до
вакуумом и растворяют в 15 мл концентриро-
10 мл. Фотометрируют в кювете с длиной опти-
ванной НС1, добавляют около 200 мл воды и
ческого пути 1 см при длине волны 500—560 нм
2,5 г кальция карбоната (СаСОз), 2,86 г ка-
против холостого опыта, в который вместо сыво-
лия хлорида (КС1) и 65,4 г натрия хлорида
ротки крови берут 1 мл воды.
(NaCl); после растворения всех ингредиен-
Для построения калибровочного графика в
тов объем доводят водой до 1 л. Получается
серию пробирок вносят от 0,2 до 1 мл калибро-
раствор, содержащий 200 мг магния в 1 л,
вочного раствора 1 ммоль/л, доводят водой до
перед употреблением его разводят водой в
объема 6 мл, прибавляют по 1 мл 2 % гидрохло-
10 раз, получается рабочий калибровочный
рида гидроксиламина, 0,075 % титанового жел-
раствор, содержащий 0,823 ммоль/л магния
того и 2 мл 1,5 н. NaOH. Окраска раствора, в
(2 м г % ) .
который добавлено 0,2 мл калибровочного раст-
Х о д о п р е д е л е н и я . К 4 м л рабо-
вора, соответствует содержанию магния в плаз-
чего раствора магона прибавляют 30 мкл
ме 0,4 ммоль/л, раствора, в который добавлено
исследуемой сыворотки или спинномозговой
0,5 мл, — концентрации 1 ммоль/л и т. д.
жидкости, перемешивают и фотометрируют в
кювете с длиной оптического пути 1 см при
П р и м е ч а н и я . 1. При определении содер-
длине волны 505 нм против холостого опыта,
ж а н и я м а г н и я в эритроцитах 0,5 мл эритро-
в который вместо сыворотки берут воду.
цитарной взвеси, полученной так же, как и
Одновременно ставят калибровочный опыт, в
при определении в клетках калия и натрия ',
который вместо сыворотки берут 30 мкл рабо-
вносят в 2,5 мл воды, через несколько минут,
чего калибровочного раствора, содержащего
когда взвесь просветлеет (станет лаковой),
что свидетельствует о завершении гемолиза, 0,823 ммоль/л магния. Расчет ведут по пра-
добавляют вольфрамат натрия, серную кис- вилу пропорций.
лоту и т. д. аналогично определению в плаз-
ме. 2. Метод пригоден также для определения Л и т е р а т у р а . Chromy V., Svoboda V.,
м а г н и я в моче. В этом случае ее разводят Stepanova I. Biochem. Med., 1973, vol. 7, N 2,
водой в 10 или 20 раз (так как концентрация p. 208—217.
может сильно колебаться), к 0,5 мл прилива- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : содержа-
ют 5,5 мл воды, по 1 мл растворов гидрохло- ние м а г н и я в сыворотке 0,7—1,2 ммоль/л.
рида гидроксиламина и 0,075 % титанового Клиническое з н а ч е н и е определе-
желтого, а также 2 мл 1,5 н. NaOH и фото- н и я м а г н и я в сыворотке ограничено. Повышение
метрируют. его концентрации бывает при уремии, гипотирео-
зе и диабетическом ацидозе, понижение — при
Л и т е р а т у р а . Лаб. дело, 1977, № 5,
нарушении всасывания, тиреотоксикозе, хрони-
с. 303—304.
ческом алкоголизме и альдостеронизме.
Определение магния по цветной реакции с
магоном. П р и н ц и п . Магний дает с магоном
(ксилидиловый синий II) яркое окрашивание,
5.8.4. Железо
белки сыворотки не препятствуют его развитию.
В связи с тем что на интенсивности окраски ска-
зывается присутствие других катионов, исполь-
Подавляющая часть всего железа человече-
зуют комплексный калибровочный раствор.
ского организма находится внутри эритроцитов
и входит в состав гемоглобина. Каждая его
молекула содержит 4 атома двухвалентного
железа, на долю которых приходится 0,334 %
1
См. с. 261.

267
ее массы, что при концентрации гемоглобина нового железа сыворотки, а также ее железо-
в крови 140 г/л соответствует содержанию желе- связывающей способности, т. е. того максималь-
за 500 мг/л крови. Определение содержания ного количества трехвалентного железа, которое
железа в цельной крови не имеет практического может связаться с белками сыворотки.
значения, так как определять гемоглобин зна- Прочность комплекса трансферрин — желе-
чительно проще. Иное дело плазма крови, содер- зо максимальна при рН 7,0 и зависит от природы
жание железа в которой примерно в 300 раз буферного раствора. При увеличении кислотно-
ниже и составляет около 1,5 мг/л. Его большая сти, а также восстановлении железа комплекс
часть находится в окисленном состоянии, т. е. распадается. Другие соединения, например
трехвалентна и связана с белком трансферрином гемоглобин, в этих условиях не разрушаются
(сидерофилином); кроме того, в плазме имеются или разрушаются лишь незначительно, поэтому
геминовое железо, ферритин и внутрисосуди- кислотноотщепляемое или негеминовое железо
стый гемоглобин. Так называемое гемино- лучше других компонентов плазмы характери-
вое железо входит в состав молекул, зует резервы железа в организме. Существует
содержащих только по одной порфирино- несколько вариантов методов определения
вой группе. Это продукты неполного син- негеминового железа, в частности некоторые
теза или распада гемоглобина и дыхательных рекомендуют проводить нагревание на водяной
ферментов, они связаны с транспортным сыворо- бане для лучшего разрушения комплекса,
точным белком гемопексином. Ферритин — са- но при этом всегда существует угроза, что раз-
мый богатый железом сывороточный белок, в его рушатся и другие железосодержащие соеди-
составе находится мицелла, содержащая до нения, поэтому результаты анализа будут завы-
4300 атомов окисленного железа. Молекулы шенными.
гемоглобина, образовавшиеся в результате Известно много цветных реактивов как на
внутрисосудистого гемолиза, содержат 4 порфи- восстановленное (Fe+ + ), так и на окисленное
риновых кольца, они связываются не с гемо- (Fe+ + + ) железо; лучшие результаты получа-
пексином, а с гаптоглобином. Разрушение эри- ются с батофенантролином, который образует
троцитов и увеличение содержания в плазме наиболее прочный и яркоокрашенный комплекс.
свободного гемоглобина почти неизбежны при Но батофенантролин нерастворим в воде, поэто-
взятии крови. Считается, что при соблюдении му его надо предварительно обработать хлор-
всех предосторожностей (игла с широким про- сульфоновой кислотой либо использовать спир-
светом, свободное вытекание крови, осторожное товой раствор. При определении железа после
отслоение сгустка, центрифугирование в течение минерализации с серной кислотой надо всегда
45 мин при 2500 об/мин, отсасывание сыворотки иметь в виду, что почти неизбежно образующая-
и повторное центрифугирование) удается умень- ся в этих условиях пирофосфорная кислота,
шить количество свободного гемоглобина в связывая железо, мешает проведению цветной
сыворотке лишь до уровня около 30 мг/л, что реакции, поэтому ее надо разрушать, нагревая
соответствует содержанию железа 100 мкг/л или на водяной бане слегка разбавленный минера-
лизат.
примерно 1/15 всего железа сыворотки. Исполь-
У с л о в и я в з я т и я м а т е р и а л а . Оп-
зуемые при получении плазмы антикоагулянты
ределение сывороточного железа обычно прово-
сами связывают железо, поэтому рекомендуется
исследовать содержание железа именно в сыво- дят для выявления железодефицитного состоя-
ротке. ния, поэтому, как правило, информативно умень-
шение его содержания. Обследуемые по крайней
Железо поступает в организм через желу-
дочно-кишечный тракт, а выводится почти мере 2 нед перед взятием крови не должны полу-
чать железосодержащих препаратов. Кровь
исключительное калом (конечно, если нет крово-
течения или гематурии), поэтому содержание надо брать широкими иглами, по возможности
его в моче у здоровых очень мало — 0,7— новыми. Сыворотка должна быть свободна от
5,7 нмоль/сут (0,04—0,3 мкг), это количество не видимых следов гемолиза.
может быть уловлено обычными методами. Батофенантролиновый метод определения
После приема некоторых железосодержащих железа унифицирован в 1974 г.
препаратов или комплексообразователя десфе- Определение железа по цветной реакции с
рала, который способствует опустошению депо, сульфонированным батофенантролином.
выведение железа с мочой значительно увеличи- П р и н ц и п . Белки осаждают трихлоруксусной
вается и может быть измерено. кислотой, которая при прогревании разрушает
Состояние обмена железа лучше всего харак- также комплекс железа с трансферрином. Для
установления оптимальной величины рН 4,8—
теризует количество негеминового сывороточ-
5,0 добавляют аммония ацетат, а для восстанов-
ного железа, т. е. железо трансферрина и фер-
ления всего железа гидразин. Двухвалентное
ритина, так как это основной резерв, который
железо образует окрашенный комплекс с бато-
используется организмом в случае необходимо-
фенантролином, который переведен в сульфати-
сти. Общее количество трансферрина, связан-
рованную форму добавлением хлорсульфоновой
ного с железом и свободного, может быть опре-
кислоты.
делено также иммунологическими методами,
определяют и количество свободного трансфер- Р е а к т и в ы . 1 . Трихлоруксусная кислота,
рина по его способности связывать радиоактив- 20 %. 2. Аммония ацетат: 70 г ацетата а м м о н и я
ное железо. Для практических лабораторий, (СНзСООNН 4 ) растворяют в воде, объем дово-
использующих обычные биохимические методы, дят до 100 мл. Препарат гигроскопичен. 3. Гид-
наибольшее значение имеет определение негеми- разина сульфат, насыщенный раствор, готовят,

268
Определение железа по цветной реакции со
заливая 2,5 г препарата 100 мл воды. 4. Раствор
спиртовым раствором батофенантролина.
сульфонированного батофенантролина: в про-
бирке к 100 мг батофенантролина (4,7-дифенил- П р и н ц и п . Сывороточное железо восстанав-
1,10-фенантролина) приливают 0,5 мл хлорсуль- ливают тиогликолевой кислотой, белки осаж-
фоновой кислоты, нагревают на кипящей водя- дают трихлоруксусной кислотой, в фильтрате
ной бане 30 с, охлаждают и медленно приливают устанавливают нужную величину рН, добавляя
10 мл воды, после чего снова нагревают на ацетат натрия, и проводят цветную реакцию
водяной бане 5 мин и разбавляют 100 мл воды. с батофенантролином. В связи с тем что он в
Добавляя 5 н. NaOH, устанавливают рН 4,0 и воде нерастворим, используют спиртовой раст-
вор.
доводят объем водой до 200 мл. 5. Калибровоч-
ный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л. Р е а к т и в ы . 1. Кислота тиогликолевая.
Сначала готовят раствор соли Мора (железо- 2. Кислота трихлоруксусная, раствор 400 г/л.
а м м и а ч н ы е квасцы, аммонийжелезо II сернокис- 3. Натрия ацетат, насыщенный раствор: в случае
необходимости его очищают от следов железа,
лое), FeSO4- (NH 4 )SO 4 -6H 2 О, содержащий
3 ммоль/л, растворяя 1,178 г в 5 мл 0,3 н. НС1 и растворяя 500 г в 1 л воды при 37 °С. К прозрач-
доводя объем до 1 л водой, содержащей в 1 л ной надосадочной жидкости добавляют раствор
1 мл концентрированной серной кислоты. Этот батофенантролина из расчета 10 мл на 1 л и
раствор разводят подкисленной водой в 100 раз; этиловый спирт в количестве, равном количеству
получается раствор, содержащий 30 мкмоль/л, надосадочной жидкости; на холоду выпадают
кристаллы СНзСООNа-ЗН2О. 4. Батофенантро-
или 1,67 мкг/мл.
Х о д о п р е д е л е н и я . К 2 м л исследуемой лин, 40 мг в 100 мл этанола. 5. НС1 1 н. раствор.
6. Калибровочный раствор железа: 100 мг мяг-
сыворотки прибавляют 2,5 мл воды и 1,5 мл
20 % раствора трихлоруксусной кислоты, пере- кой железной проволоки растворяют в 4 мл кон-
мешивают и ставят на 15 мин на водяную баню центрированной НС1 и разводят до 1 л водой,
температуры 90—95 °С. Затем центрифугируют получается раствор, содержащий 100 мкг/мл.
20 мин при 2000 об/мин и отбирают 4 мл про- Из него разведением в 60 раз получают раствор,
зрачного слоя, к которым приливают 0,35 мл содержащий 30 мкмоль/л (1,67 мкг/л).
70 % раствора аммония ацетата и 0,3 мл раство-
П р и м е ч а н и е . Учитывая, что метод опре-
ра сульфата гидразина. Смесь фотометрируют
деления очень чувствительный, необходимо
при длине волны 535 нм в кюветах с длиной опти-
принять все меры, чтобы реактивы и посуда
ческого пути 1 см, затем прибавляют 0,4 мл ра-
не содержали железа, присутствие которого
створа сульфонированного батофенантролина, выявляется при постановке холостых проб.
оставляют на 1 ч и снова фотометрируют при
Посуду, в том числе пробирки для взятия
той же длине волны. Обе фотометрии выполняют
крови, необходимо обрабатывать разбавлен-
против холостого опыта, в который берут вместо
ной HCI; должна использоваться только
исследуемой сыворотки 2 мл воды.
деионизированная или перегнанная в стек-
Калибровку проводят так же, как и основной
лянной посуде вода; реактивы очищаются
опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл калибро-
перекристаллизацией.
вочного раствора.
Р а с ч е т сывороточного железа (мкмоль/л) Х о д о п р е д е л е н и я . К 0,7 мл сыворотки
выполняют по формуле: прибавляют 2 капли тиогликолевой кислоты,
взбалтывают, а затем еще 0,35 мл 1 н. НС1,
опять перемешивают и прибавляют 0,2 мл раст-
вора трихлоруксусной кислоты. Энергично раз-
мешивают стеклянной палочкой в течение 45 с,
а затем центрифугируют при 2500 об/мин. В про-
бирку с притертой пробкой отбирают из надоса-
дочной жидкости 0,7 мл, к которым прибавляют
0,6 мл насыщенного раствора аммония ацетата
и 0,7 мл раствора батофенантролина. Окраска
результаты фотометрии калибровочной пробы; развивается за 20—30 с. Фотометрируют в кюве-
30 — содержание железа в калибровочном раст- те с длиной оптического пути 1 см при длине
воре, мкмоль/л. волны 536 нм против холостой пробы, в которую
вместо сыворотки берут 0,7 мл воды. Одновре-
П р и м е ч а н и я . 1. Надо тщательно следить
менно обрабатывают и калибровочную пробу, в
за содержанием железа в дистиллированной
которой вместо сыворотки используют 0,7 мл
воде и реактивах, используя в случае необхо-
калибровочного раствора, содержащего
димости бидистиллированную воду, приго-
30 мкмоль железа в 1 л.
товленную в стеклянном перегонном аппа-
Р а с ч е т проводят п о п р а в и л у пропорций.
рате. 2. Если после удаления белков не уда-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Негемино-
ется набрать точно 4 мл надосадочной жид-
вое железо плазмы 12—32 мкмоль/л (65—
кости, можно взять меньшее ее количество
175 мкг/100 мл), у женщин на 10—15 % ниже,
и сделать поправку при расчете или же взять
чем у мужчин.
точно такое же количество калибровочного
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Уменьше-
раствора.
ние негеминового железа сыворотки свидетель-
Л и т е р а т у р а . Лаб. дело, 1977, № 5, ствует об истощении резервов и бывает при
с. 302—303. железодефицитных состояниях. Железосвязы-

269
вающая способность сыворотки, т. е. общее вают 10 мл воды и ставят на кипящую водяную
количество трансферрина, при этом возрастает. баню на 5—10 мин, после чего объем пробы до-
Определение железосвязывающей способ- водят до 20 мл водой. Отбирают 4 мл, к которым
ности сыворотки крови. П р и н ц и п . Исследуе- прибавляют 0,3 мл насыщенного раствора суль-
мую сыворотку выдерживают с раствором трех- фата гидразина и 1,2 мл насыщенного раствора
валентного железа, при этом весь трансферрин ацетата аммония, после чего фотометрируют при
насыщается. Избыток солей железа удаляют длине волны 535 нм в кювете с длиной оптиче-
адсорбцией на карбонате магния и определяют ского пути 1 см и прибавляют 0,5 мл раствора
содержание железа в надосадочной жидкости сульфонированного батофенантролина и остав-
одним из приведенных выше методов. ляют на 1 ч, затем повторно фотометрируют в тех
Р е а к т и в ы . 1. Железо хлорное, 5 мг/мл: же условиях.
2,42 г FеС1 3 -6Н 2 О растворяют в 100 мл 0,005 н. Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В норме
НС1. 2. Магния карбонат в порошке. 3. Все реак- этим методом железо в моче не определяется.
тивы, необходимые для определения сывороточ- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Железо в
ного железа одним из описанных выше методов. моче определяется после приема железосодер-
Х о д о п р е д е л е н и я . К 2 м л исследуемой жащих препаратов, а также при проведении
сыворотки добавляют 4 мл раствора хлорного десфералевой терапии (удаление избытка желе-
железа и тщательно перемешивают. Через 5 мин за из организма с помощью комплексообразова-
прибавляют порошок магния карбоната в телей).
объеме примерно 0,5 мл, встряхивают 10—15 с и
центрифугируют. В надосадочной жидкости
определяют железо одним из описанных выше 5.8.5. Фосфор
методов. Полученный результат умножают на 3
и фосфорсодержащие вещества
(разведение сыворотки).
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Железо-
связывающая способность сыворотки 45— Помимо неорганического фосфора, концент-
75 мкмоль/л (250—400 мкг/100 мл), у женщин рация которого в плазме и эритроцитах практи-
на 10—15 % ниже, чем у мужчин. чески одинакова, в крови различают еще фрак-
цию кислоторастворимого фосфора и липидного
Л и т е р а т у р а . Caraway W. Т. Clin. фосфора. Кислоторастворимый фосфор весь
Chem., 1963, vol. 9, N 2, p. 188—189. находится в клетках, липидный — ив эритроци-
тах, и в плазме.
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Железо-
связывающая способность возрастает при желе- Результаты определения неорганического
зодефицитных состояниях. фосфора во многом зависят от используемого
метода (см. ниже). Концентрация его может
Определение железа в моче по цветной реак-
ции с сульфонированным батофенантролином. значительно уменьшаться, например при алко-
П р и н ц и п . Моча минерализуется с серной голизме, причем это реально не сказывается на
кислотой, образовавшийся пирофосфат железа каких-то физиологических процессах. Клиниче-
разрушается гидролизом на кипящей водяной ски падение неорганического фосфора наиболее
бане, раствор нейтрализуется ацетатом аммо- информативно у детей при рахите, когда оно
ния, железо восстанавливается сульфатом гид- наступает из-за нарушения всасывания. Повы-
разина и проводится цветная реакция с сульфо- шение также нельзя трактовать всегда одина-
нированным батофенантролином. ково, поскольку оно может быть и признаком
Р е а к т и в ы . 1. Кислота серная концентри- высокой тренированности спортсмена, и насту-
рованная. 2. Перекись водорода, 30 % раствор в пать при тяжелой уремии, когда почки не могут
воде (пероксид). 3. Сульфат гидразина, насы- выводить соли фосфорной кислоты, образую-
щиеся при окислении пищевых белков и фосфо-
щенный раствор: 2,5 г вещества заливают 100 мл
липидов.
воды. 4. Аммония ацетат, насыщенный раствор:
к 148 г соли добавляют 100 мл воды. 5. Раствор Кислоторастворимый фосфор — это низко-
сульфонированного батофенантролина — см. молекулярные, органические соединения, кото-
определение в сыворотке крови. 6. Калибровоч- рые остаются в надосадочной жидкости после
ный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л, осаждения белков кислотами — трихлоруксус-
см. определение в сыворотке крови. ной, хлорной и т. д. Это в основном промежуточ-
Х о д о п р е д е л е н и я . В колбу Кьельдаля ные продукты гликолиза, моно- и динуклеотиды,
помещают 5 мл исследуемой мочи и 1 мл кон- которые находятся в эритроцитах. Ядросодер-
центрированной серной кислоты и нагревают на жащие клетки, кроме того, богаты и поли-
электрической плитке с закрытой спиралью или нуклеотидами — ДНК и РНК, но этих клеток
на песчаной бане, не должно быть бурного кипе- в крови мало, поэтому суммарный их вклад
ния и образования пены, которая поднималась невелик. Примерно 2 /з всего кислотораствори-
бы в горлышко колбы, в конце сжигания должны мого фосфора крови входят в состав молекул
образовываться тяжелые белые пары, занимаю- дифосфоглицериновой кислоты эритроцитов —
щие нижнюю часть колбы. Когда материал по- 2,3-ДФГ, количество которой увеличивается при
темнеет и объем его уменьшится примерно напо- всех заболеваниях, сопровождающихся хрони-
ловину, добавляют несколько капель пергидро- ческой гипоксией; остальное — это главным
ля, что способствует просветлению пробы. образом фосфор АТФ и АДФ. Фосфорилирован-
Сжигание проводят до тех пор, пока раствор не ных Сахаров — гексозо- и пентозофосфатов —
станет совсем светлым. После охлаждения доли- относительно немного. Поэтому клиническое
270
значение определения кислоторастворимого нерализуют (сжигают). Некоторые авторы
фосфора крови примерно такое же, как 2,3-ФДГ рекомендуют для этого нагреватель с серной
эритроцитов. кислотой, так же как и при анализе азотистых
Во ф р а к ц и ю липидного фосфора входят те соединений. В этом случае температура должна
соединения, которые можно экстрагировать не быть около 300 °С, при этом образуются пиро-
смешивающимися с водой растворителями — фосфаты, которые надо разрушить, прокипятив
эфиром, хлороформом и т. д. В эритроцитах разбавленный минерализат. Поэтому лучше ми-
они участвуют в образовании оболочки, в плаз- нерализовать нагреванием с хлорной кисло-
ме частиц липопротеидов. Большая часть ли- той, когда температура около 200 °С (дигидрат
пидного фосфора приходится на долю производ- хлорной кислоты к и п и т при 203 °С), и пиро-
ных фосфатидиловой кислоты — фосфатидил- фосфаты не образуются.
холинов (лецитинов) и фосфатидилэтанолами- Нормальные в е л и ч и н ы : неоргани-
нов (кефалинов). ческий фосфор в плазме или сыворотке
При определении неорганического фосфора 1—2 ммоль/л (3—6 мг/100 м л ) , в эритроцитах
в плазме белки осаждают трихлоруксусной 1 —1,5 ммоль/л (3—4 мг/100 мл).
или хлорной кислотой и в безбелковом экстракте К и с л о т о р а с т в о р и м ы й фосфор
определяют фосфор. Результат в значительной в эритроцитах 7—14 ммоль/л (22—44 мг в
мере зависит от используемого метода. При этом 100 м л ) .
Липидный фосфор в плазме
играют роль два обстоятельства. Во-первых,
отщепление остатка фосфорной кислоты от орга- и л и с ы в о р о т к е 2—3,5 ммоль/л (7—11 мг/
нических соединений; по этой п р и ч и н е при 100 мл), в эритроцитах 3—5 ммоль/л (10—
осаждении белков трихлоруксусной кислотой 16 мг/100 мл).
результаты выше, чем при осаждении хлорной
кислотой. Во-вторых, во всех методах определе-
5.8.6. Неорганический фосфор
н и я фосфора на первом этапе образуется
фосфорно-молибденовая гетерополикислота, ко-
личество которой чаще всего определяют путем Унифицированный метод определения фос-
восстановления до молибденового синего. Ге- фора по восстановлению фосфорно-молибдено-
терополикислоту образуют не только неоргани- вой гетерополикислоты (метод унифицирован
ческий фосфор, но и некоторые его органи- в 1972 г.). П р и н ц и п . Белки осаждают три-
ческие производные. Варьируя восстановитель, хлоруксусной кислотой, в кислой среде фосфор-
условия протекания реакции и длину волны ная кислота образует с молибденовой кислотой
при фотометрии, можно в значительной мере фосфорно-молибденовую гетерополикислоту, ко-
изменить чувствительность и специфичность торая восстанавливается эйконогеном с образо-
реакции. При определении неорганического фос- ванием ярко окрашенного молибденового си-
фора в крови или т к а н я х самые точные резуль- него.
таты получаются, если восстанавливать фосфор- Р е а к т и в ы . 1 . Кислота трихлоруксусная,
но-молибденовую гетерополикислоту эйконоге- раствор 100 г/л ( 1 0 % ) . 2. Кислота серная
ном, другие вещества — аскорбиновая кислота, 5 н. 3. А м м о н и й молибденовокислый, 5 % раст-
гидрохинон и т. д.— в той или иной степени вор. Готовят, растворяя 5 г (NН4)6Мо7O2-4Н2О
завышают результаты, так как на них сказы- в 100 мл 5 н. серной кислоты. 4. Натрий кислый
вается присутствие фосфорных эфиров Саха- сернистокислый NaHSO 3 . В такой форме соль
ров и глицерина. Иное дело после минерализа- существует только в растворе, это скорее ком-
ции, тут годится любой восстановитель. мерческое, нежели химическое, название. При
Некоторые методы определения фермен- кристаллизации выпадает пиросернистокислый
тов — фосфатаз и фосфокиназ ( н а п р и м е р , натрий (Na 2 S 2 O 5 ), который называют также
креатинкиназы), а также фосфорсодержащих метабисульфитом. Все три названия — бисуль-
соединений (например, АТФ) — в конечном фит, пиросульфит и метабисульфит — синони-
итоге сводятся к анализу содержания отщепив- мы; препараты с этими н а з в а н и я м и могут быть
шегося в определенных условиях фосфора. с равным успехом использованы для определе-
Очень важно, чтобы неорганический фосфор ния фосфора. 5. Натрий сернистокислый без-
в этих случаях определялся таким методом, водный, сульфид натрия Na2SO3. 6. Эйконоген,
на результаты которого не влияют другие фос- раствор. Растворяют полностью 6 г бисульфита
форсодержащие вещества. натрия в 20—25 мл воды, вносят в этот раствор
Наилучшие результаты с точки зрения 0,1 г эйконогена (аминонафтолсульфоновой
точности и чувствительности дают методы, кислоты), который также должен полностью
в которых фосфорно-молибденовая гетерополи- раствориться, на что уходит некоторое время.
кислота не восстанавливается до молибдено- Отдельно в небольшом объеме растворяют 1,2 г
вого синего, а образует о к р а ш е н н ы й комплекс безводного сернокислого натрия, оба раствора
с каким-либо основным красителем, лучше смешивают, доводят объем до 50 мл, дают от-
всего с малахитовым зеленым. В образовании стояться несколько часов и фильтруют. 7. Ка-
комплекса на один атом фосфора может п р и - либровочный раствор. Основной калибровочный
ходиться до 3 молекул красителя, поэтому раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 л,
чувствительность и точность получаются очень готовят, растворяя 702,2 мг высушенного до по-
хорошими. стоянной массы п р и 120 °С однозамещенного
При определении кислоторастворимого и фосфата калия КН 2 РО 4 в 100 мл воды. Из него
липидного фосфора исследуемый материал ми- готовят рабочие калибровочные растворы, со-
271
держащие 1; 2 и 3 ммоль/л. Для этого 1; 2 или Х о д о п р е д е л е н и я . 0,02 м л сыворотки
3 мл основного раствора доводят водой до вносят в 1,5 мл воды, к раствору добавляют
объема 50 мл. 2 мл цветного реактива и 1 каплю 1,5 % ра-
Х о д о п р е д е л е н и я . К 1 м л прибавляют створа твина. Через 10—15 мин фотометриру-
4 мл воды и 5 мл раствора трихлоруксусной ют при длине волны 600—650 нм против хо-
кислоты, через 10 м и н центрифугируют или лостого опыта, который ставят так же, как
фильтруют. К 5 мл безбелкового фильтрата и основной опыт, но без сыворотки.
добавляют 1 мл раствора молибденовокислого Для построения калибровочного графика
аммония, 0,2 мл раствора эйконогена и 1,8 мл берут 0,5; 1 и 1,5 мл рабочего калибровочного
воды. Через 20 мин фотометрируют при длине раствора, т. е. 10; 20 и 30 нмоль фосфора,
волны 630—690 нм в кюветах с длиной опти- доводят объем до 1,5 мл, добавляют цветной
ческого пути 1 см против холостого опыта. реактив и раствор твина так же, как в основ-
Одновременно ставят холостой опыт, в который ном опыте. Калибровочная проба, в которую
взято 20 нмоль фосфора, по окраске соответ-
вместо исследуемой сыворотки берут воду, и ка-
либровочные опыты, в которые вместо сыворотки ствует опытной пробе, у которой взята сыворот-
ка, содержащая фосфор в концентрации
берут рабочие калибровочные растворы.
1 ммоль/л. Калибровочные пробы, в которые
Р а с ч е т проводят по калибровочному гра-
фику или правилу пропорций. взято 10 и 30 нмоль, соответствуют сыворот-
кам, содержащим 0,5 и 1,5 ммоль фосфора
П р и м е ч а н и я . 1. Чувствительность ме-
в 1 л. По этим данным строится калибровочная
тода можно значительно повысить, если
кривая, которая и используется для расчета.
после добавления эйконогена пробы нагре-
Л и т е р а т у р а . Грибанов Г. А., База-
вать 7 мин на кипящей водяной бане и
фотометрировать при длине волны 830 нм. В нов Г. А. Лаб. дело, 1976, № 9, с. 527—530.
этом случае вместо 5 % раствора молибде-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В сыворот-
нового аммония берут 0,5 % раствор в 0,5 ке или плазме содержится 1—2 ммоль/л (3—
н. серной кислоте, остальные реактивы те же.
6 мг в 100 мл) неорганического фосфора.
2. Согласно унифицированному методу окон-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Неоргани-
чательный объем фотометрируемых проб со-
ческий фосфор увеличивается при почечной
ставляет 8 мл, если объем кюветы меньше,
недостаточности, гипопаратиреоидизме, передо-
все дозировки можно пропорционально зировке витамина D, уменьшается при наруше-
уменьшить. нии кишечного всасывания, рахите, почечных
Л и т е р а т у р а . Fiske С., Subbarow 1. тубулопатиях, гиперпаратиреоидизме.'
J. Biol. Chem., 1925, vol. 66, p. 375;
Bartlett G. R. J. Biol. Chem., 1959, vol. 234,
N 3, p. 466.
5.8.7. Липидный фосфор
Метод определения фосфора по образованию
Унифицированный метод определения фос-
окрашенного комплекса малахитового зеленого
фора после осаждения белков трихлоруксусной
с фосфорномолибденовой кислотой. Прин-
кислотой (метод унифицирован в 1972 г.).
ц и п . Неорганический фосфор образует с мо-
П р и н ц и п . При осаждении белков крови
либденовой кислотой фосфорномолибденовую
трихлоруксусной кислотой все фосфолипиды
гетерополикислоту, которая, реагируя с основ-
осаждаются вместе с белковым сгустком, а не-
ным красителем — малахитовым зеленым, дает
органический и кислоторастворимый фосфор
зеленовато-синее окрашивание. Если фосфора
остаются в растворе. Белковый сгусток мине-
нет, то малахитовый зеленый в кислой среде
рализуется нагреванием с хлорной кислотой
окрашен в желто-коричневый цвет. Белок не
и фосфор определяется эйконогеновым методом.
мешает проведению реакции, поэтому депротеи-
В связи с тем что белки плазмы не содержат
низацию не проводят, для обеспечения коллоид-
фосфора, весь осаждаемый трихлоруксусной
ной устойчивости образовавшегося комплекса
кислотой фосфор входит в состав фосфоли-
в раствор добавляется твин 20.
пидов.
Р е а к т и в ы . 1 . Малахитовый зеленый.
Р е а к т и в ы . 1. Кислота хлорная 57 %. Ее
2. Аммоний молибденовокислый. 3. Цветной
концентрация должна быть 5,7 н., что прове-
реактив. 1,5 г малахитового зеленого растворя-
ряется титрованием. Если концентрация зна-
ют в 250 мл воды, одновременно растворяют
чительно ниже, что часто случается, так как
10,3 г молибденовокислого аммония в 250 мл
продажный препарат может содержать 40 или
5 н. НС1. Оба раствора смешивают, дают
50 % НСЮ4, соответственно увеличивается
отстояться и фильтруют, за это время цвет
количество реактива, используемого при мине-
реактива меняется. 4. Твин 20, 1,5 % раствор.
рализации (см. ниже). 2. Кислота трихлор-
0,15 мл твина 20 разводят 10 мл воды. 5. Ка-
уксусная, 100 г/л (10 %). 3. Аммоний молибде-
либровочный раствор. Основной калибровочный
новокислый, раствор 40 г/л. Готовят, растворяя
раствор, содержащий 50 ммоль/л., готовят,
4 г (NН 4 ) Мо 7 О 24 -4Н 2 О в 100 мл воды. 4. Натрий
растворяя 702,2 мг однозамещенного кислого
кислый сернистокислый '. 5. Натрий сернисто-
фосфата калия КН 2 РО 4 , высушенного при
120 °С до постоянной массы, в 1 л воды. Из него
готовят калибровочный раствор, содержащий
20 мкмоль/л. См. с. 271.
272
2
кислый безводный '. 6. Эйконоген, раствор . на, объем доводят водой до 10 мл. Через 20 мин
7. Калибровочный раствор. Основной калибро- фотометрируют в кюветах с длиной оптического
вочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора пути 1 см при длине волны 630—690 нм, против
3
в 1 л , разводят водой в 50 раз; получается холостого опыта, в который берут 0,8 мл хлорной
раствор, содержащий 1 мкмоль/мл. кислоты, 7 мл воды и далее проводят цветную
реакцию так же, как и в опыте.
Х о д о п р е д е л е н и я . К 0,2 мл исследуе-
Для построения калибровочной кривой
мой сыворотки добавляют 3 мл воды и медленно
минерализуют калибровочные пробы, содержа-
3 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты,
щие 0,2—1 мкмоль фосфора. Для этого к ним
через 1—2 мин центрифугируют, надосадочную
прибавляют по 1 мл хлорной кислоты и ставят
жидкость сливают — пробирку переворачивают
нагревать вместе с опытными пробами, после
и дают стечь жидкости. К осадку добавляют
чего проводят цветную реакцию. По калибровоч-
1 мл 57 % хлорной кислоты; если ее концентра-
ному графику вычисляют содержание фосфора
ция ниже, соответственно увеличивают коли-
в пробе, эту величину умножают на 5 и полу-
чество кислоты, переносят в колбу или в боль-
чают концентрацию мкмоль/мл или, что то же
шую пробирку для сжигания и минерализуют.
самое, ммоль/л.
Минерализация — наиболее ответственный
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : в плазме
этап определения. Дигидрат хлорной кислоты
или сыворотке содержится 2,0—3,5 ммоль/л
НСlO 4 -2Н 2 О кипит при 203 °С, при более низкой
(7—11 мг в 100 мл) липидного фосфора.
температуре из пробы удаляют воду, а при
повышении температуры начинает улетучивать- Л и т е р а т у р а . Zilversmit A., Davis A.
ся сама хлорная кислота. Температурный режим J. Lab. Med., 1950, vol. 36, p. 155.
должен быть подобран так, чтобы пары дигидра-
та хлорной кислоты конденсировались на стен-
П р и м е ч а н и е . После минерализации
ках и в виде капелек опускались на дно, где
образовавшийся неорганический фосфор
опять испарялись, и т. д. При оптимальных
может быть определен любым методом, в том
условиях минерализация заканчивается за не-
числе и наиболее чувствительным с мала-
сколько часов; если температура слишком низ-
хитовым зеленым. Иногда в процессе ми-
кая, она затягивается, если слишком высо-
нерализации образуется некоторое коли-
кая, хлорная кислота улетучивается и проба
чество пирофосфата, что приводит к зани-
будет испорчена. Лучше всего сжигать пробы
женным результатам анализа. В этом слу-
в больших пробирках 20X200 мм, которые чае пробу после разведения водой ставят
устанавливают в подогреваемом электричеством
на несколько минут на кипящую водяную
металлическом блоке (каждую пробирку в от-
баню, при этом пирофосфат гидролизуется.
дельном гнезде). Сверху пробирки прикрывают
специальными затычками или колпачками, на К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Липидный
которых также конденсируются и стекают вниз фосфор возрастает при гиперлипопротеидемиях.
пары хлорной кислоты. Высота блока должна
быть 2—3 см; большая часть пробирки, которая
5.8.8. Фосфонуклеотиды
находится над блоком, остается свободной
и относительно холодной, на ней и конденсиру-
ется хлорная кислота. Желательно, чтобы тем- Определение нуклеотидов эритроцитов элек-
пература в блоке поддерживалась на уровне трофоретическим методом. П р и н ц и п . Белки
200—210 °С с помощью электронного реле, эритроцитов осаждают трихлоруксусной кисло-
соединенного с контактным термометром (как той, надосадочную жидкость подвергают элект-
в термостате). Такое устройство позволяет рофорезу на бумаге в цитратном буфере рН 5,1.
сжигать большое количество проб с наимень- Пятна А'ГФ и АДФ идентифицируют в ультра-
шими затратами времени лаборанта, но можно фиолетовом свете, вырезают, элюируют и коли-
работать также с круглодонными колбами с чественно определяют прямой спектрофотомет-
д л и н н ы м и горлышками (колбы Къельдаля) на рией в ультрафиолетовом свете при длине волны
песчаной бане, но это требует больше внимания 260 нм.
за ходом минерализации. Внешний признак Р е а к т и в ы . 1. Натрия цитрат трехзаме-
того, что минерализация окончилась — просвет- щенный. 2. Гепарин, ампулированный препарат,
ление проб, но он может быть обманчивым, активность 5000 ЕД/мл. 3. Натрия хлорид
в то же время слишком длительное нагревание 0,85% раствор (физиологический раствор).
приводит к потерям, поэтому перед началом 4. Кислота трихлоруксусная 150 г/л (15 % ра-
серийных анализов надо отработать режим створ). 5. НС1 0,01 н. 6. Цитратный буфер рН
сжигания, проверяя воспроизводимость в серии. 5,1. Готовят, растворяя в воде 17,65 г натрия
После охлаждения к минерализованной про- цитрата трехзамещенного и 4,41 г лимонной кис-
бе прибавляют 7 мл воды, 1 мл раствора молибде- лоты. Объем доводят до 1 л. 7. Бумага для
новокислого аммония и 1 мл раствора эйконоге- электрофореза, разрезанная на ленты 35 X
X 200 мм.
Х о д о п р е д е л е н и я . Кровь берут с гепа-
рином из расчета 0,1 мл на 5 мл крови. Эритро-
циты отделяют центрифугированием, плазму
1
См. с. 271. отсасывают, а клетки дважды промывают изото-
2
ническим раствором натрия хлорида при 4 °С,
См. с. 271.
3
каждый раз центрифугируя, отсасывая надоса-
См. с. 271.

273
дочную жидкость и вновь ресуспендируя в но- определение показателей адениловой системы
вой порции раствора. К 0,5 мл эритроцитной крови доноров.— Лаб. дело, 1976, № 2,
взвеси добавляют 0,5 мл 15 % трихлоруксусной с. 92—94.
кислоты, перемешивают палочкой, выдержи- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Повторное
вают при 4 °С 10 мин и центрифугируют. донорство приводит к возрастанию содержа-
Надосадочную жидкость используют для опре- н и я обоих нуклеотидов.
деления нуклеотидов. Определение адениловых нуклеотидов эрит-
Электрофоретическую камеру заполняют роцитов методом тонкослойной хроматографии.
цитратным буфером рН 5,1 и смачивают бу- П р и н ц и п . Белки эритроцитов осаждаются
магу для электрофореза, согласно правилам ра- хлорной кислотой, избыток которой удаляется
боты на приборе. На место старта равномер- в виде калиевой соли. Безбелковый фильтрат
ной поперечной полосой наносят 0,05 мл иссле- хроматографируется в тонком слое на пластинах
дуемого трихлоруксусного экстракта и проводят «Силуфол», нуклеотиды идентифицируются в
электрофорез при напряжении 12—14 В/см при ультрафиолетовом свете и определяются по све-
силе тока 0,5—1 мА на 1 см поперечного сече- топоглощению элюатов.
ния.ленты в течение 3 1/2 ч. После этого электро- Р е а к т и в ы . 1. Диоксан. 2. Изопропи-
фореграммы высушивают в темноте и рассмат- ловый спирт. 3. А м м и а к , концентрированный
ривают при освещении коротким ультрафиоле- раствор. 4. Кислота хлорная, 0,8 н. (8 % НС1О4).
товым светом (длина волны меньше 300 нм, 5. Калия карбонат, раствор 2 моль/л. Готовят,
можно пользоваться ультрахемоскопом Блюм- растворяя 27,6 г карбоната калия (поташ,
берга или другим аналогичным прибором). К 2 СО 3 ) в воде, объем доводят до 100 мл.
Бумага слегка флюоресцирует за счет примесей, В случае необходимости препарат предвари-
а адениловые нуклеотиды, которые сильно по- тельно сушат при 105—110°С. 6. Подвижная
глощают свет в этой области, видны в виде тем- фаза для хроматографии. Смешивают 40 мл
ных пятен. Ближе к старту находится АДФ, диоксана, 20 мл изопропилового спирта, 40 мл
дальше от старта — АТФ. Контуры пятен обво- воды и 10 мл концентрированного раствора
дят карандашом, вырезают и элюируют 5 мл аммиака. Можно использовать и более
0,01 н. HCI в течение 4 ч. Одновременно простую систему, которую готовят без изопропа-
экстрагируют аналогичный участок бумаги, не нола, смешивая 40 мл диоксана, 40 мл воды
содержащий нуклеотидов; этот раствор исполь- и 10 мл раствора аммиака. 7. НС1, 0,1 н. 8. Нат-
зуют в качестве холостого опыта. Экстинкции рия хлорид, 0,85 % раствор (изотонический
всех растворов измеряются при длине волн 260 раствор). 9. Пластины для тонкослойной хро-
и 290 нм в кюветах с длиной оптического пути матографии «Силуфол».
1 см, из первой величины вычитают вторую. Х о д о п р е д е л е н и я . Кровь берут с гепа-
Р а с ч е т основывается н а данных моляр- рином, добавляя его из расчета 12 ME на 1 мл
ного коэффициента экстинкции при длине волны крови. Эритроциты отделяют центрифугирова-
260 нм, который у разных нуклеотидов несколь- нием, плазму отсасывают, а клетки 3 раза про-
ко отличается, авторы данного метода считают мывают холодным изотоническим раствором
возможным пренебречь этими небольшими раз- натрия хлорида, каждый раз центрифугируя по
3
личиями и п р и н и м а ю т его р а в н ы м 14,2-10 . Это 20 мин п р и 3000 об/мин. К 1 мл эритроцитной
значит, что такая величина оптической плот- массы добавляют 1 мл раствора хлорной кислоты,
ности получится, если фотометрировать в кювете перемешивают и через несколько минут осадок
с длиной оптического пути 1 см раствор отделяют центрифугированием. К 1 мл надоса-
концентрации 1 моль/л и вычесть из этой ве- дочной жидкости прибавляют 0,1 мл раствора
л и ч и н ы оптическую плотность при 290 нм. Для калия карбоната и оставляют на холоде, пока
раствора концентрации I мкмоль/л величина полностью не выпадут кристаллы образовав-
будет 0,0142. В данном методе окончательное шегося перхлората калия. 0,05—0,1 мл холодной
разведение пробы в 200 раз (нуклеотиды из надосадочной жидкости (если она согреется,
25 мкл эритроцитной массы оказываются в кристаллы частично растворяются) наносят
5 мл), поэтому расчет производят по формуле: в виде полоски на пластину «Силуфол» и
проводят восходящую хроматографию в течение
60—90 м и н в смеси диоксана, изопропилового
спирта и аммиака. Перед началом хроматогра-
фии камера должна быть насыщена парами
растворителя, фронт растворителя должен
пройти расстояние не менее 3 /4 пластины; если
он не пройдет его, то наиболее вероятная
причина этого — плохое насыщение камеры па-
где Е — разность оптических плотностей, изме-
рами подвижной фазы или плохая герметиза-
ренных при длинах волн 260 и 290 нм.
ция камеры.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : для АТФ
Вынутые из камеры п л а с т и н ы высушивают
600—14-00 мкмоль/л, для АДФ 250—800
на воздухе и просматривают в коротком ультра-
мкмоль/л, отношение м о л я р н ы х концентраций
фиолетовом свете (на ультрахемоскопе Блюм-
АТФ/АДФ в норме 2.
берга или другом аналогичном приборе), нахо-
дят пятна нуклеотидов и обводят их острым
Л и т е р а т у р а . Шаврова Ю. А., Бирюко- предметом. В этой системе быстрее всего
движется АМФ, медленнее АТФ. Порошок с от-
ва Т. В., Шанояп С. А. Электрофоретическое
274
меченных мест пластины соскабливают и элюи- для того, чтобы вычислить содержание органи-
руют 3 мл 0,1 н. HCI. Определяют светопогло- ческих кислот, которое соответствует разности
щение надосадочной жидкости при длине волны между суммами неорганических катионов и
анионов.
260 нм.
При налаживании методики рекомендуется Хлор чаще всего определяют титрованием,
провести определение в калибровочном раство- так как, подобно другим галоидам, Cl ˜ образует
ре, содержащем в 1 мл 30—60 нмоль (15—. плохо растворимые соли с ионами серебра и
30 мкг) ампулированного препарата АТФ, кото- ртути. Основная методическая проблема — как
рый непосредственно наносят на хроматографи- установить конец титрования, т. е. появление
ческую пластину так же, как и нейтрализован- избытка серебра или ртути. Для этого исполь-
ный хлорный экстракт. Эти препараты обычно, зуются электрохимические методы или обратное
помимо АТФ, содержат также АДФ и АМФ. титрование, когда ионы хлора осаждаются иона-
Р а с ч е т проводят, исходя из молярных ми серебра, а их избыток затем оттитровывает-
коэффициентов экстинкции: для АТФ — 14 600, ся роданид-ионами, используя в качестве инди-
для АДФ—15000, для А М Ф — 14700. Если катора конца титрования соли железа. Однако
для хроматографии было взято 0,1 мл нейтра- практичнее всего прямой метод, при котором
лизованного экстракта и окончательный к исследуемому раствору добавляются соли рту-
объем после элюции был 3 мл, разведение ти и в осадок выпадает нерастворимая каломель.
составляет 1:63, поэтому, для того чтобы выра- Эти методы стали возможны потому, что появи-
зить концентрацию АТФ в мкмоль/л, надо вели- лись эффективные индикаторы на ртуть —орга-
чину умножить на 4315, для АДФ коэффициент нические вещества, ртутные соли которых окра-
составляет 4200, для АМФ 4286. Если же для шены. Когда весь хлор удален из раствора,
хроматографии берут 0,05 мл нейтрализован- новые порции титранта окрашивают его. На
ного экстракта, коэффициенты должны быть в этом основан унифицированный метод, в кото-
2 раза выше. ром в качестве индикатора на ртуть использует-
ся дифенилкарбазон.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : содержа-
ние АТФ 726 + 2,4 мкмоль/л, содержание АДФ Самые перспективные методы определения
262±1,2 мкмоль/л, АМФ 4,1 ±1,3 мкмоль/л. хлора аппаратурные, в которых используется
кулонометрическое титрование. Оно заключает-
Л и т е р а т у р а . Захаров Н. В., Рубин В. И. ся в том, что измеряется количество электри-
Тонкослойная хроматография нуклеотидов эрит- чества, необходимое для того, чтобы удалить
роцитов на пластинках силуфол.— Лаб. дело, весь хлор из раствора. Анализ сводится к тому,
1980, № 12, с. 735—738. что небольшое количество исследуемой жид-
кости (порядка 0,01—0,02 мл) —плазмы, сыво-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е т о же, что
и в предыдущем методе. ротки, мочи или пота — разводится буферным
раствором, содержащим соли азотной кислоты.
В раствор погружены три электрода: рабочий,
5.8.9. Хлор индикаторный и индифферентный. К рабочему
(серебряному) электроду прилагается положи-
тельный электрический потенциал, в результате
Хлор, как и натрий,— внеклеточный элемент,
чего через раствор течет ток, количество ко-
поэтому их определение имеет аналогичное кли-
торого измеряется специальной электронной
ническое значение с той разницей, что физиоло-
схемой — кулонометром. Атомы серебра на ра-
гические механизмы поддерживают концентра-
бочем электроде превращаются в ионы Ag + , ко-
цию натрия в значительно более узких пределах.
торые сразу же реагируют с ионами С1-,
Происходит это потому, что натрий — основной
в результате чего выпадает нерастворимое хлор-
катион внеклеточных жидкостей, на его долю
ное серебро. Когда весь хлор удален из раство-
приходится 92—93 % всех положительных за-
рядов, в то время как главных анионов три: ра, концентрация в нем резко возрастает;
это улавливается индикаторным электродом,
хлор, бикарбонат и органические кислоты, при-
чем на долю хлора приходится лишь 2 /з их об- сигнал с которого останавливает титрование.
Содержание хлора в пробе вычисляется по
щего количества. Хотя сумма анионов также
формуле Фарадея, которая связывает коли-
постоянна, как и сумма катионов, но колебания
чества электрического тока и выделившегося
хлора относительно больше, чем натрия, так как
серебра, потребовавшегося, чтобы связать весь
уравновешиваются изменениями других анио-
хлор.
нов.
Унифицированный меркуриметрический ме-
Определение натрия в биологических жид-
тод определения хлора. П р и н ц и п . Иссле-
костях на пламенном фотометре просто и надеж-
дуемая биологическая жидкость титруется
но; для хлора аналогичного метода нет, поэтому
раствором азотнокислой ртути, образующаяся
натрий определяют в биохимических лаборато-
каломель выпадает в осадок. Когда весь хлор
риях значительно чаще, чем хлор. Однако в не-
связан, избыток ионов ртути образует с индика-
которых случаях, если речь идет об анализе от-
тором дифенилкарбазоном темное, сине-лиловое
дельных проб в небольших лабораториях, осо-
окрашивание, что служит признаком конца
бенно при исследовании мочи, определение хло-
титрования.
ра предпочтительнее, так как не требует почти
Р е а к т и в ы . 1. Ртуть азотнокислая, раст-
никакого оборудования. Одновременное опреде-
ление и хлора, и натрия вместе с другими неорга- вор 6 ммоль/л. 2 г Hg (N0 3 ) 2 -0,5 Н 2 О растворя-
ническими ионами плазмы иногда используют ют в 200 мл воды, добавляют 20 мл 2 н. азотной
275
кислоты и доводят водой до 1 л. 2. Дифенил- 4 капли (0,2 мл) раствора дифенилкарбазона и
карбазон, спиртовой раствор: 100 мг дифенил- титруют раствором азотнокислой ртути при
карбазона растворяют в 100 мл 96 % этилово- постоянном перемешивании до появления тем-
го спирта, хранят в посуде из темного стекла ной окраски. Удобнее всего перемешивать маг-
в холодильнике. Стоек в течение месяца. нитной мешалкой. На титрование сыворотки
3. Азотная кислота, 2 н: 14 мл продажной должно пойти примерно 3 мл титранта.
концентрированной азотной кислоты (плотность
П р и м е ч а н и я . 1 . Раствор азотнокислой
1,4) разводят в 100 мл воды. 4. Калибровочный
ртути можно приготовить из красной окиси
раствор, 10 ммоль/л. Хлорид натрия (поварен-
ртути. Для этого 1,3 г HgO растворяют
ная соль) высушивают до постоянной массы
в 11 мл концентрированной азотной кислоты
при 120 °С, 584 мг препарата растворяют в воде
и доводят объем водой до 1 л. 2. Раствор
и доводят объем до 1 мл.
дифенилкарбазона должен быть красно-
Х о д о п р е д е л е н и я . Сначала устанав-
оранжевого цвета; если окраска становится
ливают величину фактора раствора для титрова-
желтой или вишнево-красной, реактив не-
ния (титранта). Для этого в маленький стакан-
пригоден.
чик или колбочку вносят 2 мл калибровочного
раствора и 4 капли (0,2 мл) раствора фенил- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : содержа-
карбазона, постоянно перемешивая, титруют ние в сыворотке или плазме 97—108 ммоль/л,
раствором азотнокислой ртути до появления выведение с мочой 150—2500 ммоль/сутки.
темного окрашивания. Фактор титранта вы-
Л и т е р а т у р а . Schales D., Schales S.
числяют, разделив 20 (количество микромолей
J. Biol. Chem., 1941, vol. 140, p. 879.
хлорид-ионов в калибровочной пробе) на число
миллилитров, пошедших на титрование. Фактор К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е определе-
указывает, какому количеству микромолей ния хлора такое же, как и натрия. Его увеличе-
хлорид-ионов соответствует 1 мл титранта. ние в плазме крови — признак выраженной
При исследовании опытной пробы поступают дегидратации, уменьшение — признак значи-
аналогично: в маленький стаканчик или колбоч- тельного избытка воды в организме. Выведение
с мочой увеличивается при спадении отеков,
ку наливают 1,8 мл воды и вносят 0,2 мл иссле-
уменьшается при их развитии.
дуемой биологической жидкости, добавляют
Раздел 6
МЕТОДЫ К Л И Н И Ч Е С К О Й И М М У Н О Л О Г И И




6.1. ОСОБЕННОСТИ МЕТОДОВ К Л И Н И Ч Е С К О Й И М М У Н О Л О Г И И

Широкое внедрение иммунологического взаимосвязь компонентов которых ему недоста-
анализа в клинику внутренних болезней, точно известна, чаще предполагается. Именно
характеризующее последнее десятилетие, отра- поэтому в условиях клинико-лабораторной
жает значительные успехи развития иммуно- практики должны использоваться высокока-
биологии. Фундаментальные исследования чественные диагностические сыворотки и препа-
функциональных клеточных взаимодействий раты. На решение этой проблемы направлено
в процессе иммунного ответа, развитие концеп- постановление ЦК КПСС и Совета Министров
ции иммунологического надзора, генетических СССР о развитии биотехнологии.
механизмов детерминации и регулирования Клиническая иммунология развивается на
и м м у н н ы х реакций организма изменили пред- л у ч ш и х традициях теоретических исследований.
ставление об иммунитете как о системе защиты, Однако далеко не всегда можно и нужно
р а с ш и р и в его роль в сложном механизме адапта- экстраполировать результаты взаимодействия
ции к постоянно меняющимся внешним услови- чистых систем, полученных в условной среде
ям обитания, в охране генетического постоян- на таковые в сложных, мало еще изученных
ства внутренней среды организма. Осмыслива- средах целостного организма. Причинно-след-
ние с этих позиций реакций иммунитета обусло- ственные взаимоотношения, установленные в
вило активное внедрение в клиническую практи- эксперименте и прямо перенесенные на больно-
ку многих новых, в том числе клеточных, го, могут привести к возникновению серьез-
реакций, заставило по-иному взглянуть на став- ных диагностических ошибок и как следствие
шие уже рутинными «старые» методы, совер- этого к неправильному лечению активными
шенствовать их. Были разработаны методы препаратами — иммуномодуляторами, разви-
определения концентрации фракций компле- тию ятрогений.
мента. Описаны способы выявления прямого, Методы иммунологических исследований
«классического» и альтернативного путей его широко используются специалистами практи-
активации. Вновь усилилось внимание к фаго- чески всех клинических дисциплин. Опыт
цитозу с позиций существующих представлений централизованных клинико-иммунологических
о клеточных кооперациях в распознавании лабораторий указывает, что наибольший удель-
антигена и реализации иммунного ответа, взаи- ный вес в их работе занимают исследования
модействия его с гуморальными компонентами. для клиник терапевтического профиля, в кото-
Особый интерес представляют сывороточные рых создаются отделения иммунопатологии,
факторы регуляции, значение которых возраста- иммунодефицитов. Эти патологические состоя-
ет с установлением их диагностической инфор- ния, объединяемые чаще по синдромному приз-
мативности. Новое значение приобретают и не- наку, нередко не имеющие четких нозологи-
специфические факторы реактивности, сыво- ческих границ, вызывают необходимость
роточные бактериолитические и статические проведения наибольшего числа иммунологи-
факторы, система пропердина, лизоцима и т. д. ческих тестов. Правильно подобранный комп-
Число методов иммунологического анализа лекс последних отражает изменение иммунной
очень быстро растет. И клиницисту, и сотрудни- реактивности, помогает выявить достаточно
точно характер и уровень этих изменений.
ку лабораторного подразделения все чаще
приходится останавливаться перед выбором, Иммунологические методы при этих заболева-
решающую роль в котором играет диагности- ниях определенно характеризуют активность
процесса, отражают эффективность применяе-
ческая информативность того или другого
мой иммунодепрессантной или модулирующей
теста. Такой своеобразно утилитарный подход,
терапии, но диагностическая информативность
отличающий клиническое использование лабо-
раторных исследований, значительно усложняет их далеко не равнозначна. При врожденных
условия проведения анализа и, самое главное, (первичных) иммунодефицитных состояниях
значение иммунных показателей определяет
его интерпретации. В отличие от экспери-
ментальных условий, когда исследователь сам диагноз. При иммунокомплексных заболеваниях
определяет время введения антигена, знает его типа системной красной волчанки они могут
подтверждать логику диагностического процес-
характеристики, строго контролирует условия
са, а при ряде других диффузных заболеваниях
проведения реакции, врач-лаборант работает со
соединительной ткани (системная склеродермия,
сложными биологическими к о м п о з и ц и я м и ,

277
узелковый периартериит и др.) изменения Таким образом, очевидно, что диагности-
иммунных показателей сопровождают пораже- ческая информативность иммунологического
ние органов и не имеют определенной диагно- анализа ограничена нешироким кругом заболе-
стической информативности. Можно выделить ваний. В то же время применение иммунных
группу заболеваний неинфекционной этиологии, методов позволяет специфически определять
развитие которых специфически проявляется в и выделять биологически активные вещества,
иммунных реакциях (I г р у п п а ) . Существуют играющие определенную роль в патогенезе за-
заболевания, в диагностике которых иммуноло- болеваний, устанавливать эффективность имму-
гические тесты играют существенную, но не номодулирующей терапии, объективизировать
определяющую роль ( I I г р у п п а ) . обоснованность ее назначения.
Г р у п п а 1. 1. Первичные и м м у н н ы е дефи- В основе иммунной реакции лежит специфи-
циты. ческое взаимодействие антигена с антителом.
2. Парапротеинемии. Именно оно обусловливает правильность
полученного ответа. Но необходимо строгое
3. Гепатома, тератобластома яичка (а-фето-
протеин). выполнение всех требований к ингредиентам
4. Сывороточный НВ гепатит (НВs-антиген). реакции, технике ее постановки и учета.
5. Рак желудочно-кишечного тракта (канце- Иммунный ответ целостного организма —
ро-эмбриоспецифический антиген). это сложная, взаимосвязанная, генетически де-
6. Аутоиммунная гемолитическая анемия. терминированная система последовательных
реакций. В лабораторной практике при изучении
7. Тиреоидит Хашимото.
составных компонентов этой системы истори-
Г р у п п а I I . 1 . Системные заболевания
чески сложилось и сохраняется сейчас условное
соединительной ткани (ревматические болезни).
2. Хронический активный гепатит, болезнь разделение на гуморальные и клеточные факто-
ры иммунитета. Поэтому в изложении материала
Шегрена.
мы будем придерживаться этой т р а д и ц и и .
3. Некоторые болезни почек ( и м м у н о -
комплексный нефрит).




6.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ
ГУМОРАЛЬНОГО И М М У Н И Т Е Т А — Р Е А К Ц И Я А Г Г Л Ю Т И Н А Ц И И

пациента в реакции с предварительно сенсиби-
О б щ и е п р и н ц и п ы . Агглютинация —
склеивание частиц — носителей а н т и г е н н ы х де- лизированными эритроцитами донора (непря-
мой тест).
терминант антителами, находящимися в реак-
П о с у д а . 1. Пробирки химические. 2. Па-
ционной смеси. В результате образуются конгло-
стеровские пипетки. 3. Мелкие белые тарелочки.
мераты частиц, которые в среде электролита вы-
Р е а к т и в ы . 1. Раствор 5 % цитрата нат-
падают в осадок и становятся видимыми для
рия. 2. 0,9 % раствор хлорида натрия. 3. Анти-
глаза. Частицами — носителями антигена могут
быть естественные клетки: клетки крови — эри- глобулиновая сыворотка (сыворотка Кумб-
троциты, лейкоциты, реже тромбоциты, бакте- са) С титром преципитинов не ниже 1:256—
риальные клетки, а также созданные искусствен- 1 :512.
но: латекс, полистирол, бентонит, частицы угля Прямая реакция Кумбса. Х о д о п р е д е -
и т. д. Основные требования, предъявляемые л е н и я . 3 мл крови берут из локтевой вены
к этим носителям,— возможность прочно при- исследуемого в одну пробирку с предварительно
соединять а н т и г е н ы и не давать спонтанной внесенным 1 мл 5 % раствора цитрата натрия.
агглютинации. Широкое распространение Эритроциты трижды отмывают в большом объе-
(доступность, удобство использования, легкость ме изотонического раствора натрия хлорида
учета) в лабораторной практике получило путем центрифугирования при 1500 об/мин, в
применение в качестве носителей специально течение 10 мин. Из отмытых эритроцитов го-
обработанных эритроцитов (человека или жи- товят 5 % взвесь на изотоническом растворе
(1 капля отмытых эритроцитов и 19 капель
вотных).
Реакции агглютинации, в которых в качестве изотонического раствора). На сухую чистую
субстрата использованы эритроциты, получили белую тарелку наносят каплю антиглобулиновой
название реакций г е м а г г л ю т и н а ц и и . сыворотки, к ней добавляют каплю 5 % взвеси
эритроцитов исследуемого. Сыворотку переме-
шивают с эритроцитами стеклянной палочкой.
6.2.1. Антитела к эритроцитам Рядом ставят контроль, используя вместо сы-
воротки изотонический раствор. Каждую новую
Реакция Кумбса. П р и н ц и п . При наличии серию антиглобулиновой сыворотки ставят ана-
неполных (блокирующих) антител на поверх- логичным путем со стандартными сенсибилизи-
ности эритроцитов исследуемого пациента про- рованными эритроцитами и с интактными до-
исходит агглютинация эритроцитов при инкуба- норскими эритроцитами различной группы. Пе-
ции их с антиглобулиновой сывороткой (прямой ремешанные эритроциты с сывороткой слегка
тест Кумбса) или с разведениями сыворотки покачивают не более 10 мин.

278
У ч е т р е а к ц и и . Появление агглютина- в диагностике аутоиммунных гемолитических
ции указывает на наличие неполных антител анемий, эссенциальных или вторичных.
на поверхности эритроцитов. Реакция может При системных заболеваниях (системная
быть проведена в пробирках. В этом случае красная волчанка, хронический активный гепа-
2 капли (0,1 мл) различного разведения тит, болезнь Шегрена) бывает чаще положи-
антиглобулиновой сыворотки (в зависимости от тельной непрямая реакция Кумбса.
титра преципитинов) помещают в пробирки и
добавляют каплю отмытых эритроцитов. Осто-
6.2.2. Резус-фактор
рожно встряхивают и инкубируют 30 мин
при 37 °С.
У ч е т р е а к ц и и проводят после центри- Реакция конглютинации с применением же-
фугирования при 1500 об/мин в течение 1 мин латина. П р и н ц и п . Эритроциты с наличием
(центрифуга ЦЛК-1). резус-антигена агглютинируют в среде с непол-
Непрямая реакция Кумбса. Х о д о п р е д е - ным антирезус-антителами в присутствии анти-
л е н и я . Из локтевой вены исследуемого берут глобулиновой сыворотки.
3 мл крови в чистую сухую пробирку. Р е а к т и в ы . 1. Групповые (по системе
Реакция идет в два этапа: АВО) антирезусные сыворотки. 2. Стандартные
первый — сенсибилизация стандартных эритро- эритроциты всех групп системы АВО. 3. 10 %
цитов неполными антителами, предположитель- раствор желатина (ампулированный).
но находящимися в исследуемой сыворотке; Х о д о п р е д е л е н и я . Кровь и з локтевой
второй — агглютинация сенсибилизированных вены необходимо брать в две пробирки. В одну
эритроцитов антиглобулиновой сывороткой. пробирку с предварительно внесенным 1 мл 5 %
Необходимо использовать троекратно отмы- раствора цитрата натрия — 3 мл, в другую —
тую в изотоническом растворе смесь эритроцитов только 3 мл крови. Пробирки должны быть
различных аллотипов 0(1) группы резусположи- тщательно промаркированы. В сопроводитель-
тельных. Каплю этих эритроцитов вносят в про- ном направлении указывают полностью фами-
бирку и на них наслаивают 3 капли исследуемой лию, имя, отчество и группу крови пациента.
сыворотки. Пробирки энергично встряхивают Кровь, смешанная с цитратом натрия, слу-
и помещают в термостат при 37 °С на 40 мин. жит источником эритроцитов. По одной капле
Параллельно опыту ставят контрольные пробы. (0,05 мл) исследуемых эритроцитов вносят в
Первая: в пробирку с 2 каплями стандартных 3 химические пробирки. В первые две добавляют
отмытых резусположительных эритроцитов 0(1) 0,1 мл антирезусной сыворотки различной серии
группы вносят 3 капли антирезусной сыворотки соответствующей группы крови. Далее во все
АВ (IV); вторая: в пробирку с 2 каплями три пробирки доливают 0,1 мл (2 капли) 10 %
отмытых стандартных резусотрицательных раствора желатина, предварительно прогретого
эритроцитов 0(1) вносят 3 к а п л и сыворотки на водяной бане температуры 40—45 °С. Таким
A B ( I V ) . Контрольные пробирки помещают, образом, 3-я пробирка, в которой находятся
так же как и опытные, в термостат при 37 °С на .только эритроциты и желатин, служит контро-
40 мин. лем на спонтанную агглютинацию в присутствии
После термостатирования из пробирок желатина. В целях одновременного определения
осторожно отсасывают сыворотку. Эритроциты резус-антител используются стандартные эрит-
трижды отмывают в изотоническом растворе роциты 0(1) группы резусположительные, в ко-
натрия хлорида. На сухую чистую тарелку торые добавляют сыворотку крови из пробирки
без раствора цитрата и то же (что и в трех
наносят в 3 точках по 1 капле антиглобулиновой
сыворотки. В первую каплю добавляют эритро- предыдущих пробирках) количество желатина.
циты, сенсибилизированные сывороткой пациен- В качестве контроля необходимо использовать
та, во вторую и третью — эритроциты контроля стандартные резусположительные и отрица-
0(1) резусположительных с антирезусной сыво- тельные эритроциты всех 0(1), А ( I I ) , В(III),
роткой A B ( I V ) и 0(1) резусотрицательные с AB(IV) групп крови. Содержимое всех пробирок
антирезусной сывороткой A B ( I V ) . Эритроциты осторожно перемешивают, встряхивают и поме-
тщательно перемешивают стеклянной палочкой щают в термостат при 46—48 °С на 30 мин.
с антиглобулиновой сывороткой. После этого После термостатирования во все пробирки вно-
осторожно покачивают тарелку в течение 10 мин, сят по 8 мл 0,85 % раствора хлорида натрия
но не более. и перемешивают осторожным ротированием.
У ч е т р е а к ц и и . При наличии в сыворот- У ч е т р е з у л ь т а т о в . Результат можно
ке пациента неполных антител в опытной смеси считать достоверным только при совпадении его
будет наблюдаться агглютинация. Контроль с в обеих пробирках разных серий антирезусной
резусположительными 0(1) эритроцитами дол- сыворотки и правильно прошедших контролях.
жен дать агглютинацию. В контроле с резусот- Агглютинация эритроцитов в первых двух про-
рицательными 0(1) эритроцитами агглютинации бирках, видимая в проходящем свете или под
не должно быть. В ряде случаев неполные анти- микроскопом (в сомнительных случаях), указы-
тела вступают в реакцию при низкой температу- вает на наличие резус-антигена. Склеивание
ре (4 °С), о чем необходимо помнить в исследо- эритроцитов в 4-й пробирке документирует не-
ваниях при подозрении на холодовую иммунную полные резус-антитела в сыворотке исследуе-
цитопению. мого. Если происходит агглютинация в 3-й
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Выявление пробирке, содержащей только эритроциты и же-
антител к эритроцитам играет ведущую роль латин, результат реакции в первых двух пробир-
279
Постановка реакции лейко-
ках не может быть учтен вследствие возмож-
а г г л ю т и н а ц и и . Готовят ряд (кратных
ности неспецифической агглютинации.
двум) разведений исследуемой сыворотки (5—8
Резус-антитела. Определение в грудном мо-
пробирок), которую предварительно инактиви-
локе (молозиве). Грудное молоко в количестве
руют 30 мин при 56 °С. К 0,1 мл (2 капли)
10—15 мл, взятое в пробирку, центрифугируют
сыворотки добавляют по капле взвеси лейко-
10 м и н при 1000 об/мин. Со дна пробирки отса-
сывают небольшое количество и 2—3 капли цитов. Пробирки интенсивно встряхивают и тер-
мостатируют в течение полутора часов при 37 °С.
наслаивают на стандартные эритроциты 0(1)
группы. Затем добавляют 0,1 мл 10 % раствора После извлечения из термостата пробирки
центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. Над-
желатина и ставят в термостат при 46 °С на 30
мин. Дальнейший ход реакции и учет результа- осадок удаляют, а к клеточному слою добавляют
тов уже описан выше. 2 капли 3 % уксусной кислоты для удаления
примеси эритроцитов и осторожно перемеши-
И с т о ч н и к о ш и б о к . Раствор желати-
вают. Каплю клеточной взвеси помещают на
на: наличие помутнения, хлопьев, утрата способ-
ности «застывать» при температуре 4—8 °С мо- предметное стекло и рассматривают под малым
увеличением микроскопа.
жет приводить к ложноположительным резуль-
татам. Антирезусные сыворотки: снижение титра У ч е т р е а к ц и и п р о в о д я т п о двум
критериям: выраженности агглютинации (ин-
антител при длительном или неправильном
тенсивная, т. е. крупные агломераты, значи-
хранении (определяется в контрольных иссле-
тельная площадь свободной жидкости,— 4 плю-
дованиях каждый раз при использовании новой
са; выраженная агглютинация, когда наряду с
серии). Ошибки при использовании иногруп-
а г л о м е р а т а м и лейкоцитов в жидкости можно
пных сывороток.
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Определе- видеть небольшое количество свободных кле-
ние резус-фактора обязательно при переливании ток,— 3 плюса; степень агглютинации, при
крови и у беременных. В последнем случае которой среди взвешенных клеток выявляются
необходимо исследование резус-фактора у отца островки агглютинатов,— 2 плюса и слабая
будущего ребенка. мелкоглыбчатая агглютинация, когда в поле
Прогноз гемолитической болезни зависит от зрения преобладают свободные клетки, но встре-
д и н а м и к и резус-антител, которые необходимо чаются небольшие комочки склеившихся кле-
исследовать в течение беременности. ток,— 1 плюс) и величина разведения сыворот-
ки, в которой еще отмечается агглютинация.
Возможные и с т о ч н и к и ошибок.
6.2.3. Антитела к лейкоцитам Часто встречается неспецифическая агглютина-
ция, особенно п р и крупноглыбчатой интенсивной
П р и н ц и п м е т о д а . При наличии в реакции. В каждом случае необходимы контроли
исследуемой сыворотке антител к лейкоцитам выделенных лейкоцитов с нормальной совмести-
последние образуют агглютинаты, видимые под мой референтной сывороткой. Спонтанная

<<

стр. 15
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>