<<

стр. 16
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

микроскопом. агглютинация наблюдается при высокой кон-
Р е а к т и в ы . 1 . Гепарин кристаллический центрации в выделенном клеточном осадке
(предпочтительнее) или готовый (во флаконах) нежизнеспособных лейкоцитов.
раствор (Гедеон Рихтер). 2. Среда 199 (или фос- Более информативен в клинической практике
фатный буфер рН 7,4). 3. 0,35 % и 5 % растворы учет крайних разведений сыворотки с агглюти-
хлорида натрия. нацией.
Ход определения. Выделение Л и т е р а т у р а . Лимфоциты: выделение,
л е й к о ц и т о в . В пробирку с предварительно фракционирование и характеристика/Под ред.
внесенным раствором гепарина (25 ЕД на 1 мл Дж. Б. Натвича, П. Перлманна, X. Вигзелля.—
крови) из локтевой вены донора вносят 10 мл М.: Медицина, 1980; Руководство по иммуно-
крови, перемешивают и помещают в термо- логии/Под ред. О. Е. Вязова и Ш. К. Ходжае-
стат при 37 °С в наклонном (45°) положении на ва. — М.: Медицина, 1973; Тодоров Йордан.
1 ч. После отстаивания плазму с прилегающим Клинические лабораторные исследования в
к эритроцитам слоем лейкоцитов осторожно педиатрии.— София, 1963.
отсасывают пастеровской пипеткой и переносят
в центрифужную пробирку. После 5 мин
центрифугирования при 1000 об/мин надосадоч-
6.2.4. Д Н К и антитела к Д Н К
ную жидкость удаляют. К клеточному осадку
для лизирования примеси эритроцитов добавля-
ют 5 мл 0,35 % раствора NaCl и осторожно Реакция пассивной гемагглютинации.
ресуспендируют клетки пастеровской пипеткой, П р и н ц и п . Формалинизированные эритроци-
не допуская образования пены, в течение 30— ты барана с присоединенными к их поверхности
45 с. Вслед за этим немедленно добавляют прочной ковалентной связью ДНК агглютини-
0,6 мл 5 % раствора NaCl и тщательно пере- руют в сывороточной среде с наличием антител
мешивают (раствор становится изотоничным). к ДНК. В зависимости от конформации моле-
Полученную взвесь лейкоцитов трижды отмы- кулы антигена, используемого в реакции (натив-
вают средой 199 или фосфатным буфером. ная, высокополимерная ДНК, денатурирован-
Проводят пробу на жизнеспособность выде- ная кипячением в стандартном солевом
ленных клеток (см. в разделе «Методы исследо- растворе — ССР, прогретая в присутствии
вания клеточного и м м у н и т е т а » ) . формальдегида), различают 3 типа антител
280
свежетанированных эритроцитов в фосфатно-
к ДНК. Антитела I т и п а — к формалинизи-
рованной однотяжевой ДНК, антитела II ти- цитратном буфере рН 5,2 смешивают с равным
па — к термоденатурированной ДНК, в которой объемом ДНК в концентрации 10—20 мкг/мл
около 60 % нуклеотидов организовано в спира- в том же буфере. Смесь выдерживают в течение
лизованные участки, антитела I I I типа — анти- 30 мин при комнатной температуре, а затем
собранные центрифугированием эритроциты от-
тела к нативной высокополимерной ДНК.
Определение типов антител к ДНК более мывают троекратно ССР в разведенной в нем
информативно в клинической практике, так как нормальной кроличьей сывороткой, предвари-
может быть использовано в целях дифферен- тельно инактивированной в соотношении 1:250.
Приготовленные эритроциты хранят при 4 °С
циальной диагностики.
Р е а к т и в ы . 1. Препарат нативной ДНК с добавлением 0,4 % раствора формальдегида
(«Реахим». Олайнский завод химреактивов. в ССР с разведенной в нем кроличьей сыворот-
«Реанал», Венгрия). 2. Препараты ДНК с мо- кой. Срок годности — до 4 мес.
дифицированной первичной и вторичной В каждом случае перед сенсибилизацией
структурой. Денатурированную ДНК получают серии эритроцитов необходимо определять коли-
кипячением 50—200 мкг/мл ДНК в стандартном чество ДНК, адсорбированной на эритроцитах.
М е т о д и к а п о с т а н о в к и РПГА.
солевом растворе (0,15 М NaCl и 0,015 М ра-
створ трехзамещенного цитрата натрия) в тече- Для постановки используют полистироловые
ние 10 мин с последующим охлаждением пластины с лунками. В каждую лунку разливают
в ледяной бане. Однотяжевую формалинизи- по 0,4 мл, а в первую лунку 0,9 мл ССР и 0,1 мл
рованную ДНК получают прогреванием раство- исследуемой сыворотки. Пассажем из лунки
ра ДНК 400 мкг/мл 10 мин при 100 °С в присут- в лунку равных объемов готовят двукратные
разведения, после чего во все лунки добавляют
ствии 1,3 % формальдегида. Формальдегид
по 0,05 мл 2,5 % взвеси эритроцитов, сенсиби-
взаимодействует с освобождающимися при де-
лизированных ДНК. Пластинки энергично
натурации а м и н о г р у п п а м и азотистых оснований,
встряхивают и оставляют при комнатной тем-
препятствуя восстановлению разделившихся
пературе на 4 ч.
при нагревании цепей ДНК. 3. Формалинизиро-
Если эритроциты агглютинируют, то они
ванные и танированные бараньи эритроциты.
равномерно устилают все дно лунки. В отсут-
4. Фосфатно-цитратный буфер рН 5,2.
ствие агглютинации эритроциты собираются на
Х о д о п р е д е л е н и я . В лунки полисти-
самом дне лунки, образуя компактный диск
роловых титровочных пластин разливают 0,9 мл
или небольшое кольцо.
в первую лунку, а в остальные — по 0,4 мл
В качестве контроля одновременно с той
и добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки,
же самой сывороткой при тех же разведениях
предварительно инактивированной при 56 °С 30
закапывают формалинизированные эритроциты,
мин.
не сенсибилизированные ДНК.
Формалинизация бараньих
э р и т р о ц и т о в . Эритроциты барана отделя- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Выявле-
ют от фибринового сгустка и несколько раз ние антител к ДНК может служить характе-
промывают изотоническим раствором натрия ристикой процессов аутоиммунитета. В сочета-
хлорида (0,15 М NaCl). 12,5 % взвесь эритро- нии с определением типа антител исследова-
цитов в изотоническом растворе рН 7,0 помеща- тель может оценить активность репаративных
ют в сосуд, в который опускают целлофановый процессов, способность организма к адаптивным
мешок, содержащий нейтрализованный форма- реакциям (например, нарастание антител
лин,— 1/4 объема взвеси эритроцитов. Диализ к ДНК I типа после оперативных вмешательств).
проводят при 4 °С в течение 2 сут и далее при Антитела к ДНК I типа широко встречаются как
комнатной температуре в течение 2—5 сут про- в норме, так и при различных инфекционных
тив изотонического раствора. Взвесь эритроци- процессах (например туберкулезе), вирусных
тов периодически встряхивают. После оконча- заболеваниях ( г р и п п ) . Антитела II типа, осо-
ния диализа эритроциты отмывают в 10-кратном бенно в титрах 1:160 и выше, отражают актив-
объеме изотонического раствора хлорида натрия ность ревматических болезней. Антитела I I I типа
с повторным центрифугированием. Отмытые преобладают при системной красной волчанке
эритроциты суспендируют в равном объеме и служат дифференциально-диагностическим
изотонического раствора. 50 % взвесь эритроци- критерием.
тов при 4 °С сохраняется в течение года. В ряде случаев антитела к ДНК III типа
Обработка эритроцитов тани- можно выявить при выраженной активности
н о м . Обработку формалинизированных эритро- хронического активного гепатита или болезни
цитов танином проводят перед их использова- Шегрена.
нием. 2,5 % взвесь формалинизированных
эритроцитов с равным объемом танина, раство-
ренного в ССР в соотношении 1:200000. Смесь
инкубируют в течение 15 мин при 37 °С, после Л и т е р а т у р а . Поверенный А. М. и др.—
чего эритроциты отмывают от избытка танина Вопр. мед. х и м и и , 1966. № 12, с. 117—119. Пове-
10-кратным количеством ССР. ренный А. М. и др.— Вести. АМН СССР, 1967,
Сенсибилизация эритроцитов. № 2, с. 62—64. Белокриницкий Д. В. и др.—
Формалинизированные и танированные эрит- Вопр. ревмат., 1971, № 12. с. 62—65. Гольд-
роциты сенсибилизируют ДНК, денатурирован- фарб Д. М., Замчук Л. А. Антитела к нуклеино-
ной в присутствии формальдегида. 2,5 % взвесь вым кислотам.— М.: Наука, 1975.

281
6.2.5. Ревматоидный фактор Надосадочная жидкость при последнем промы-
вании должна быть бесцветной. Из плотного
Унифицированный метод определения реак- осадка готовят 1 % и 25 % взвесь эритроци-
ции гемагглютинации. П р и н ц и п . Ревматоид- тов в фосфатно-солевом буфере рН 7,4.
ный фактор, находящийся в сыворотке крови 2. Обработка исследуемой сыворотки: кровь,
больных, обладает свойством агглютинировать взятую из локтевой вены больных в коли-
эритроциты барана, предварительно сенсибили- честве 2—3 мл, ставят на 1 ч в термостат. Затем
зированные кроличьим иммуноглобулином. сыворотку отделяют от сгустка (центрифугиру-
Р е а к т и в ы . 1. Кроличья гемолитическая ют 20 мин при 1000 об/мин, отсасывают над-
сыворотка (амбоцептор). Используют сухую или осадочный слой) и инактивируют в водяной
жидкую прогретую гемолитическую сыворотку бане при 56 °С в течение 30 мин. Хилезные и ге-
с разными титрами, как готовую, так и получен- молизированные сыворотки непригодны для ис-
ную в лаборатории путем иммунизации кроли- следования.
ков эритроцитами барана. 2. Фосфатно-солевой 3. Разведение сывороток: сыворотки больных
буфер рН 7,4. А. Натрия фосфат однозамещен- разводят фосфатно-солевым буфером рН 7,4
ный — 24,6 г и до 1 л дистиллированной воды. в соотношении 1:5 (0,2 мл сыворотки и 0,8 мл
Б. Натрия фосфат двузамещенный — 22,4 г буфера).
и до 1 л дистиллированной воды. В. Хлорид 4. Адсорбция исследуемой сыворотки: прово-
натрия — 8,5 г и до 1 л дистиллированной воды. дят с целью устранения гетероагглютининов.
Перед опытом смешивают раствор А с раствором 1 мл 25 % взвеси эритроцитов барана центри-
Б в отношении 1:9, рН раствора доводят до 7,4. фугируют 15 мин при 1000 об/мин. Надосадоч-
Затем одну часть смеси добавляют к 9 частям ную жидкость удаляют и к осадку добавляют
раствора В. 3. Эритроциты барана: а) свежая 0,75 мл исследуемой сыворотки, предварительно
дефибринированная кровь барана, срок разведенной в фосфатно-солевом буфере в со-
использования до 7 дней, хранение при 2—8 °С; отношении 1:5. Пробирки со смесью встряхи-
б) эритроциты, консервированные в растворе вают и оставляют при комнатной температуре
Олсвера; срок хранения до 2 мес при температу- на 1 ч, а затем на 1 ч в холодильнике при
ре 2—8 °С. 4. Раствор Олсвера: глюкоза — 4 °С. После этого центрифугируют 15 мин при
20,5 г, натрия цитрат — 8 г, лимонная кисло- 1000 об/мин и осторожно сливают находящуюся
та — 0,552 г, хлорид натрия — 4,2 г, дистилли- сверху надосадочную жидкость. Далее эту над-
рованная вода — до 1 л; рН раствора 6,1. осадочную жидкость, которая является сыво-
Раствор стерилизуют дробно (кипятят на водя- роткой в разведении 1:5, используют для при-
ной бане 3 дня по 20 мин). Срок хранения до готовления разведений при постановке реакции
1 мес при температуре 2—8 °С. гемагглютинации в основном опыте.
5. Титрование кроличьей гипериммунной сы-
Х о д о п р е д е л е н и я . Постановке основ-
воротки (амбоцептор): проводят для определе-
ного опыта предшествует подготовительная ра-
ния ее агглютинирующей способности к барань-
бота.
им эритроцитам. Готовят серию разведений
1. Приготовление 1 % и 25 % взвеси барань-
амбоцептора в фосфатно-солевом буфере. Для
их эритроцитов: дефибринированную кровь ба-
этого первоначально готовят разведение сы-
рана или бараньи эритроциты в растворе Олс-
воротки 1:100 (0,1 мл сыворотки и 9,9 мл
вера центрифугируют и удаляют надосадочную
фосфатно-солевого буфера) и из него готовят
жидкость. Осадок трижды отмывают 5—6 объе-
дальнейшие разведения:
мами изотонического раствора хлорида натрия.

гемолитической сыворотки
200 — 0,5 мл 1:100 + 0,5 мл фосфатно-солевого буфера
1:100+1,0 То же
300 0,5 То же
» 1:100+1,5 »»
400 0,5 »
» 1:100 + 2,0 » »
500 0,5 »
» 1:100 + 2,5 » »
0,5 »
600
» 1:100 + 3,0 » »
700 0,5 »
» 1:100 + 3,5 » »
800 0,5 »
» 1:100 + 4,0 » »
900 0,5 »
1:100 + 4,5 » »
»
1000 0,5 »

Из каждой пробирки с данным разведенцем нии 1:4 от концентрации конечного разведе-
переносят в каждую пробирку второго ряда по ния сыворотки, давшего положительную реак-
0,5 мл сыворотки, затем добавляют равный цию агглютинации.
объем 1 % бараньих эритроцитов (0,5 мл). 6. Приготовление сенсибилизированных эри-
Пробирки оставляют при комнатной температу- троцитов: к разведенной кроличьей сыворот-
ре на 15 мин, затем встряхивают и оставляют ке прибавляют равный объем 1 % эритроци-
на 2 ч при 4 °С, после чего учитывают результат. тов барана. После тщательного встряхивания
Агглютинационным титром гемолитической сы- смесь оставляют при комнатной температуре
воротки считается наивысшее ее разведение, на 15 мин; так как при добавлении кроличьей
при котором происходит агглютинация на 1+. иммунной сыворотки взвесь эритроцитов разво-
Для постановки основного опыта используют дится вдвое, то конечная ее концентрация 0,5 %
кроличью гемолитическую сыворотку в разведе- и ее используют для основной реакции.

282
Т а б л и ц а 42. Схема реакции
№ пробирки
3 6
1 5 8 9 10
2 7
4

Разведение 1 10 20 40 80 160 320 640 1280 2560
5
0,2 0,2 — — — — — — — — —
Сыворотка 1:5, мл 0,2
Фосфатно-солевой буфер, мл — 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Из каждой пробирки, начиная со 2-й, последовательно переносят по 0,2 мл в следующую
пробирку; из 10-й пробирки 0,2 мл выливают




Основной опыт (титрование Р е а к т и в ы 1. Латекс СКИ-3 — полисти-
и с с л е д у е м ы х с ы в о р о т о к ) . 1 . Готовят роловые частицы величиной 0,8 мкм. Срок хра-
последовательные двойные разведения исследу- нения 1 год. Диагностикум латексовый для об-
емой сыворотки фосфатно-солевым буфером в наружения ревматоидного фактора (каунасское
объеме 0,2 мл, учитывая исходное разведение предприятие бактерийных препаратов). 2. Гам-
1,5. ма-глобулин (готовый препарат 10 % гамма-
2. В каждую пробирку вносят по 0,2 мл 0,5 % глобулина). Хранить при 2—8 °С. 3. Глициново-
сенсибилизированных бараньих эритроцитов. боратный буфер: борная кислота — 3,1 г, гли-
Разведения, схему реакции см. в табл. 42. цин — 7 г, хлорид натрия — 8,5 г, дистиллиро-
3. Таким же образом для контроля ставят ванная вода — до 1 л; рН 8,2. Хранить в холо-
реакцию с сывороткой клинически здорового че- дильнике при 2—8 °С. Срок хранения 1 мес,
ловека и с сывороткой больного с известным Х о д о п р е д е л е н и я . Постановке основ-
высоким титром. ного опыта предшествует подготовительная ра-
4. Пробирки встряхивают и помещают в бота.
холодильник при 4 °С на 18 ч. На другой день 1. Приготовление латекс-глобулинового
оставляют их на полчаса при комнатной темпе- реагента: 10 % готовый препарат гамма-глобу-
ратуре и макроскопически учитывают наличие лина инактивируют при 60 °С 15 мин или при
агглютинации. Для обозначения интенсивности 56 °С 30 мин. Затем разводят изотоническим
агглютинации пользуются системой четырех раствором натрия хлорида до 1 % концентрации
плюсов. В реакции гемагглютинации определя- (1 мл 10% гамма-глобулина и 9 мл изотони-
ется конечное разведение исследуемой сыворот- ческого раствора).
ки, дающее положительный результат агглюти- Латекс разводят в дистиллированной воде из
нации на 1 +. расчета 1:30 (1 мл латекса и 29 мл дистиллиро-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Наличие ванной воды). Полученную взвесь тщательно
агглютинации до титра 1:20 считается нормой. взбалтывают. К 30 мл суспензии латекса
Реакция с титром 1:40 и выше—положитель- добавляют 24 мл прогретого и разведенного
1 % гамма-глобулина (5 мл латекса и 4 мл
ная.
И с т о ч н и к и о ш и б о к . 1 . Плохая кон- гамма-глобулина).
сервация эритроцитов барана. Суспензию латекса и гамма-глобулина
2. Несоблюдение правил при сенсибилиза- тщательно смешивают перевертыванием пробир-
ции эритроцитов. ки и оставляют в термостате при температуре
3. Неполная инактивация исследуемой сы- 37 °С в течение 30 мин, периодически перемеши-
воротки. вая. Затем добавляют 3 мл раствора челове-
ческого альбумина (100 мг сухого альбумина
Л и т е р а т у р а . Иммунохиминеский ана-
растворяют в 10 мл изотонического раствора
лиз. Под ред. Л. А. Зильбера.— М., 1968; хлорида н а т р и я ) , оставляют на 30 мин при ком-
Методические указания по применению унифи- натной температуре и на 18 ч в холодильнике,
цированных клинических лабораторных методов после чего смесь фильтруют через тонкий слой
исследований.—М., 1973, с. 149—153.
гигроскопической ваты и суспензия готова.
Унифицированный метод определения ревма- 2. Обработка исследуемой сыворотки: кровь,
тоидного фактора в сыворотке крови капельной взятую из пальца или из локтевой вены больных
латекс-глобулиновой пробой (латекс-тест в мо- в количестве не менее 1 мл, ставят на 1 ч в термо-
дификации Сперанского). П р и н ц и п . Ревма- стат. Затем сыворотку отделяют от сгустка,
тоидный фактор, находящийся в сыворотке центрифугируют 20 м и н при 1000 об/мин, осто-
больных, обладает свойством вступать в реак- рожно отсасывают сыворотку и инактивируют
цию преципитации с инактивированным челове- ее на водяной бане 56 °С в течение 30 мин.
ческим гамма-глобулином, адсорбированным на Хилезные, гемолизированные и проросшие сыво-
нейтральных частицах латекса. ротки непригодны для использования.

283
Х о д о п р е д е л е н и я . Сыворотку иссле- И с т о ч н и к и о ш и б о к . 1 . Потеря пре-
дуемого больного разводят в 20 раз глициново- ципитирующей способности частиц при длитель-
боратным буфером (0,1 мл цельной сыво- ном их хранении. 2. Испортившаяся при долгом
ротки и 1,9 мл буфера). 0,2 мл разведенной или неправильном хранении контрольная сыво-
сыворотки наносят на предметное стекло и до- ротка. 3. Грязная, плохо обезжиренная посуда.
бавляют пастеровской пипеткой 1 каплю латекс - К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Ревма-
глобулинового реагента (сенсибилизированной тоидный фактор выявляется часто при ревмато-
суспензией латекса). После тщательного пере- идном артрите. Величина титра коррелирует
с активностью процесса. В то же время отсут-
мешивания стеклянной палочкой смесь оставляют
на 3 мин, затем осторожно покачивают стекло ствие ревматоидного фактора в сыворотке не мо-
жет служить основанием для изменения клини-
в течение 10—15 с. Окончательный результат
ческого предположения. Существуют сероне-
учитывают через 5—6 мин в проходящем свете
гативные формы ревматоидного артрита. «Рев-
от настольной лампы.
матоидная активность» фактора может быть
Параллельно проводят исследование суспен-
секвестрирована в иммунных комплексах и быть
зии латекса со стандартной положительной
выявлена после их диссоциации.
и отрицательной сыворотками для контроля
годности реагентов. Ревматоидный фактор (факторы) может
быть выявлен и при других заболеваниях.
При количественной постановке пробы гото-
В высоких титрах он встречается при хрони-
вят различные разведения сыворотки— 1:20,
ческом активном гепатите, болезни Шегрена,
1:40, 1:80 и далее. Пробу ставят указанным
в 30 % случаев подострого бактериального
выше способом.
эндокардита, при системных заболеваниях
Оценка результатов реакции.
Реакцию считают положительной, если наблю- соединительной ткани. Наличие ревматоидного
фактора даже в низких титрах может быть
дается агглютинация частиц латекса. Величину
информативным при диагностике латентных
реакции учитывают в плюсах: 4 плюса — все
частицы агглютинированы, раствор прозрачен; форм ревматического процесса.
3 плюса — 1/4 частиц агглютинированы, рас- Л и т е р а т у р а . Механизмы иммунопато-
твор прозрачен по краю; 2 плюса — 1/2 час- логии/Под ред. С. Колна, П. А. Уорда,
тиц а г г л ю т и н и р о в а н а , раствор мутноватый; Р. Т. Мак-Класки.— М.: Медицина, 1983;
1 плюс — слабая агглютинация, раствор мут- Сперанский А. И.— В кн.: Материалы докладов
ный. на научной сессии, посвященной десятилетию
Н о р м а . Проба положительная при титре Института ревматизма АМН СССР. М., 1968,
1:20. При положительном результате в более вы- с. 75; Цончев В., Попов П., Коларов С., Карака-
соких титрах оценка производится согласно шов А. Лабораторная диагностика ревмати-
титру. ческих заболеваний.— София, 1964.



6.3. Р Е А К Ц И Я И М М У Н Н О Г О Л И З И С А

6.3.1. Гемолитическая активность концентрации бараньих эритроцитов, коли-
комплемента чества антител, использованных для сенсиби-
лизации, величины рН, ионной силы системы.
Унифицированный метод определения гемо- В связи с тем что присоединение к иммунному
литической активности комплемента по 50 % ге- комплексу первого компонента комплемента
не происходит в отсутствие Са + + , а для при-
молизу. П р и н ц и п . Комплемент, содержа-
щийся в исследуемой сыворотке, вызывает ге- соединения 4-го компонента (следующего за
++
молиз сенсибилизированных бараньих эрит- активацией C1) необходимо наличие Mg ,
роцитов в присутствии сыворотки кролика, важно строго соблюдать концентрацию этих
иммунизированного бараньими эритроцитами веществ в буферных растворах. Необходимо
(гемолитическая сыворотка). стандартизировать время реакции, температуру.
Активность комплемента выражают в гемо- Р е а к т и в ы . 1 . Гемолитическая сыворотка
литических единицах. За одну 50 % гемолити- (гемолизин). Выпускаются стандартные серии
препарата в ампулах с титром гемолитической
ческую единицу комплемента (С Н 5 0 ) принимают
такое его количество, которое вызывает гемолиз сыворотки, указанным на этикетке. Такие сыво-
50 % 0,5 мл стандартной суспензии сенсибили- ротки имеют длительный срок годности при
зированных эритроцитов при 37 °С за 45 мин.
Эта единица условная, величина ее зависит от
комплемента в зависимости от его количества
выявило сигмовидный характер кривой
Изначально гемолитическая активность корреляции, причем полный гемолиз наступает
комплемента определялась м и н и м а л ь н ы м коли- в широкой зоне верхней части кривой, когда
чеством сыворотки, вызывающим лизис 100 % сенсибилизированные эритроциты малочувстви-
определенного количества стандартных эритро- тельны к количественному возрастанию компле-
мента.
цитов. Однако изучение литической активности
284
хранении при температуре 2—8 °С. 2. Эритроци- После приготовления 3 % взвеси эритроци-
ты барана. 3. Веронал-мединаловый буфер. тов готовят гемолитическую сыворотку.
Состав буфера (в г р а м м а х ) : 85 — N a C l ; Разведение гемолитической
5,75 — веронал; 3,75 — мединал; 0,22— с ы в о р о т к и . Перед опытом ампулу вскры-
вают, содержащийся в ней лиофильный пре-
СаС1 2 -2Н 2 О; 1 — Mg 5 Cl 2 -6H 2 O; pH 7,3—7,8
(6,75 г веронала растворяют в 500 мл горячей парат разводят стерильным изотоническим рас-
дистиллированной воды, смесь охлаждают до твором хлорида натрия согласно инструкции.
+ 20 °С, добавляют другие компоненты и дово- Гемолитическую сыворотку берут в разведении,
дят дистиллированной водой до объема 2 л. которое в 3 раза превышает ее исходную кон-
Буфер х р а н я т при температуре 3—5 °С). центрацию. Так, если титр гемолитической сы-
Х о д о п р е д е л е н и я . Постановке основ- воротки равен 1:1200, готовят разведение 1:400.
ного опыта предшествует подготовительная Исходя из необходимого для постановки реак-
ции объема гемолитической системы, отмери-
работа.
вают нужное количество гемолитической сыво-
1. Приготовление буфера: в день постановки
опыта к одной части буферного раствора доба- ротки. После этого ампулу запаивают и остаток
вить 4 части дистиллированной воды. Разведен- гемолитической сыворотки сохраняют до следу-
ющего опыта в холодильнике при 4—8 °С. Толь-
ный буферный раствор пригоден в течение 12 ч.
ко после приготовления 3 % взвеси бараньих
2. Обработка исследуемой сыворотки боль-
ного: кровь, взятую из вены больного в коли- эритроцитов и разведения по титру гемолити-
честве 2—3 мл, оставляют на 2 ч при комнатной ческой сыворотки можно приступить к приго-
товлению гемолитической системы.
температуре, затем центрифугируют 10—15 мин
Гемолитическая с и с т е м а — это
при 1500 об/мин. Сыворотку осторожно отса-
сывают и исследование проводят в тот же день. смесь равных объемов разведенной по трое-
кратному титру гемолитической сыворотки и
Приготовление гемолитичес-
3 % взвеси бараньих эритроцитов от объема
к о й с и с т е м ы . Приготовление 3 % взвеси
бараньих эритроцитов: дефибринированную плотного осадка (100 мл 3 % взвеси и 100 мл
кровь барана отмывают 3 раза 5—10-кратными разведенной гемолитической сыворотки: 0,1 мл
объемами изотонического раствора хлорида нат- гемолитической сыворотки и 99,9 мл изотони-
рия, который после третьего отмывания должен ческого раствора хлорида н а т р и я ) .
быть бесцветным. Из плотного осадка эритро- Смешивание гемолитической сыворотки
цитов готовят 3 % (по объему) взвесь в изото- (0,1 мл и 99,9 мл изотонического раствора нат-
ническом растворе. рия хлорида) с эритроцитами производят по
С т а н д а р т и з а ц и я взвеси эрит- возможности быстро, п р и ч е м гемолитическую
р о ц и т о в б а р а н а . Густота взвеси эритро- сыворотку примешивают к взвеси эритроцитов,
цитов барана оказывает значительное влияние а не наоборот. Смесь выдерживают при 37 °С
на титр комплемента и поэтому имеет существен- в термостате 30 мин для сенсибилизации эрит-
ное значение. Наиболее точным методом стан- роцитов.
дартизации эритроцитов является фотометриро- Т и т р о в а н и е к о м п л е м е н т а . Иссле-
вание. Используют для этой цели ФЭК М-56. дуемую сыворотку, разведенную 1:10 буферным
М е т о д и к а . За 15—20 м и н до н а ч а л а раствором, разливают в 2 пробирки: 0,1 и
исследования включают ФЭК и устанавливают 0,25 мл. Разлитую сыворотку ( 1 : 1 0 ) доводят
зеленый светофильтр; 1 мл 3 % взвеси отмытых веронал-мединаловым буфером до объема
бараньих эритроцитов добавляют в пробирку 1,5 мл. Затем в каждую пробирку прибавляют
к 9 мл дистиллированной воды, полученную 1,5 мл стандартизированной гемолитической
лизированную кровь вливают в 10-миллиметро- системы.
вую кювету, в другие две кюветы (такого же Одновременно с опытными пробирками ста-
объема) наливают растворитель, т. е. смесь из вят контроль на отсутствие гемолиза сенсибили-
1 мл изотонического раствора и 9 мл дистиллиро- зированных эритроцитов: 1,5 мл гемолитической
ванной воды. системы и 1,5 мл веронал-мединалового буфера.
В левый кюветдержатель ставят кювету с Пробирки встряхивают и помещают в термо-
растворителем, в правый — кювету с лизирован- стат при 37 °С на 45 мин. После инкубации их
ной кровью. Величину оптической плотности охлаждают в рефрижераторе при 2—4 °С в тече-
раствора отсчитывают по правой части бара- ние 18—19 ч. На следующий день проводят
бана. Определенной концентрации эритроцитов фотометрирование надосадочной жидкости из
соответствует определенный показатель шкалы каждой пробирки (против изотонического рас-
оптической плотности. Если 3 % взвесь ба- твора хлорида натрия или дистиллированной
раньих эритроцитов приготовлена правильно, воды в контрольной кювете колориметра).
то шкала оптической плотности показывает 0,4. Д л я у ч е т а степени гемолиза необходимо
использовать шкалу стандартных разведений
Если показатель оптической плотности менее л и з и р о в а н н ы х эритроцитов по А. П. Конникову,
0,4, то к приготовленной взвеси следует добавить которую готовят для каждой партии эритроци-
соответствующее графику количество эритроци- тов и гемолитической сыворотки, как указано
тов. Если же показатель оптической плотности на с. 286.
выше 0,4, то к приготовленной взвеси бараньих Для вычисления 50 % единицы гемолиза
эритроцитов следует прибавить соответству- строят калибровочную кривую. Контролем слу-
ющее количество изотонического раствора хло- жит оптическая плотность пробирки № 4 из
рида натрия (рис. 9). шкалы Конникова, которая соответствует 50 %

285
Рис. 9. Кривая стандартиза-
ции взвеси бараньих эритро-
цитов по ФЭК-М. Кювета
10 мл. Светофильтр зеленый.
1 — взвесь бараньих эритроци-
тов (%); II — бараньи эритро-
циты (мл), которые нужно доба-
вить к 100 мл взвеси, чтобы
получить 3 % взвесь; III — изо-
тонический раствор хлорида нат-
рия ( м л ) , который нужно доба-
вить к 100 мл взвеси, чтобы полу-
чить 3 % взвесь.




Результаты исследования: фотометрирова-
гемолизу. На оси ординат откладывают вели-
ние первой пробирки, которая содержит 0,1 мл
чину оптической плотности, измеренной на
сыворотки, показывает 0,07; второй пробирки,
ФЭКе, как контроля, так и исследуемого матери-
содержащей 0,25 мл,—0,12. Соединяют эти две
ала, и проводят горизонталь, параллельную оси
точки и линию соединения продолжают до пере-
абсцисс, до пересечения с перпендикулярами,
сечения с л и н и е й 50 % гемолиза. Из точки пере-
восстановленными на оси абсцисс в соответ-
сечения опускают перпендикуляр на линию аб-
ствующих 0,1 и 0,25 разведениях сыворотки.
сцисс, где отмечены показания разведения сыво-
П р и м е р : пробирка из шкалы Конникова
ротки (например 0,25).
№ 4, отражающая 50 % гемолиза, соответст-
Р а с ч е т ведут по формуле: 0,25 мл ( 1 : 1 0 ) :
вует показаниям ФЭК-13.
С Н 5 0 =1 мл:х.

№ пробирки
1 2 3 5 6
4

В связи с тем что 0,25 мл — это испытуемая
Гемологическая
сыворотка, разведенная 1:10, результат надо ум-
система разведе-
ножить на 10, т. е. в 1 мл исследуемой сыворотки
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
0,2
ния вдвое, мл
будет 40 СН50. В сыворотках здоровых доноров
Дистиллирован-
обычно содержится 20—40 гемолитических еди-
0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3
ная вода, мл
ниц комплемента. Уровень комплемента у жен-
40 50 60
20 30 70
Гемолиз, %
щин ниже, чем у мужчин, в пределах 10 %.

286
Л и т е р а т у р а . Иммунохимический а н а - ходя из данных, у к а з а н н ы х на этикетке. Разве-
лиз/Под, ред. Л. А. Зильбера.- М., 1968; Лабо- денный таким образом препарат стрептоли-
раторная иммунология/Под ред. О. Б. Вязова.— зин-О должен содержать в объеме 0,3 мл одну
М., 1967; Резникова Л. С. Комплемент и его рабочую дозу, т. е. то количество стрептолизи-
значение в иммунологических реакциях.— М., на-О, которое почти полностью нейтрализуется
1967; Бойд У. Основы иммунологии.— М.: Мир, половиной международной единицы антистреп-
1969; Kabat E., Mayer М. E x p e r i m e n t a l I m m u - толизина-О стандарта ГИСК.
n o c h e m i s t r y . 2 ed., 1964. 3 . Т и т р о в а н и е а н т и т е л . Разведен-
ную сыворотку или разведенную надосадочную
жидкость из крови в растворителе и другие
ингредиенты разливают по пробиркам, как это
6.3.2. Антистрептолизин-О указано в табл. 43.
Результаты титрования обозначают: плюс
Унифицированный метод определения в сы- (+) — положительная реакция — отсутствие
воротке крови. П р и н ц и п . Если исследуемая гемолиза, в осадке эритроциты; плюс-минус
сыворотка содержит антитела к антигену стреп- (±) — сомнительная реакция — частичный ге-
тококка — стрептолизину-О, то добавление по- молиз; минус ( —) — отрицательная реакция —
следнего к сыворотке способствует специфиче- полный гемолиз.
скому связыванию антител и отмене феномена При чтении реакции учитывают последнюю
гемолиза эритроцитов, добавленных в качестве пробирку, в которой сыворотка еще нейтрали-
индикатора реакции к той же сыворотке. зует рабочую дозу стрептолизина-О (0,3 мл).
П о с у д а и о б о р у д о в а н и е . 1 . Термо- Гемолиз эритроцитов в этой пробирке должен
стат на 37 °С. 2. Пробирки химические. 3. Шта- отсутствовать. Титр сыворотки выражают чис-
тивы. лом единиц антистрептолизина-О в 1 мл.
Р е а к т и в ы . 1. Препарат стрептолизина-О AEST-O — интернациональная единица ан-
(предприятие по производству бактериологи- тистрептолизина-О — равна двум условным еди-
ческих препаратов Ленинградского научно-ис- н и ц а м антистрептолизина-О, принятым ранее
следовательского института вакцин и сыворо- в Советском Союзе.
ток). 2. Фосфатный буфер рН 6,5—6,7. На 1 л В табл. 43 приведено число AEST-O в 1 мл
дистиллированной воды добавляют 7,4 г п р и нейтрализации стрептолизина-О различ-
NaH(PO4) 2 ;3,17r KН2PO4; 1,81 г К 2 НРО 4 -2Н2О ными разведениями сыворотки.
и NaOH до рН 6,5—6,7. Хранить буфер в рефри- 4. К о н т р о л ь . Пробирки № 12 и 13 служат
жераторе при температуре от 3 до 8 °С. 3. Взвесь . для контроля эритроцитов и стрептолизина-О.
эритроцитов: дефибринированную или взятую Эритроциты не должны при учете реакции быть
с цитратом натрия кровь кролика или человека гемолизированы. Стрептолизин-О в дозе 0,3 мл
(любой группы) наливают в центрифужные про- рабочего разведения должен вызывать полный
бирки, отмечают уровень крови, центрифуги- гемолиз 0,2 мл 5 % взвеси эритроцитов.
руют и удаляют надосадочную жидкость. Эри- Унифицированный метод определения в ма-
троциты троекратно промывают 0,85 % раство- лом объеме крови. П р и н ц и п тот же.
ром NaCl, добавляют до метки 0,85 % раствор Р е а к т и в ы . Растворитель крови: 2,05 г
NaCI, взвесь тщательно размешивают и к 5 мл глюкозы, 0,16 г цитрата натрия, 0,5 г хлорида
такой взвеси добавляют 95 мл фосфатного буфе- натрия, до 100 мл дистиллированной воды,
ра рН 6,5—6,7. Взвесь эритроцитов готовят рН 6,1—6,3.
в день постановки опыта. После автоклавирования к растворителю до-
4. Сыворотка больных: кровь, взятую из бавляют мертиолат натрия до концентрации
пальца или локтевой вены в количестве не менее 1:20000, затем равномерно разливают в сте-
0,5 мл, ставят на 15 мин в термостат при 37 °С, рильных условиях по пробиркам и сохраняют
а затем в холодильник. Через 2—24 ч стояния в холодильнике (при температуре от 4 до 8 °С).
при температуре от 3 до 8 °С сыворотку отде- Х о д о п р е д е л е н и я . Кровь в количестве
ляют от сгустка, прогревают при 56 °С в течение 0,3 мл, взятую из пальца, смешивают с 2,7 мл
30 мин и используют для титрования антител. растворителя (на 0,5 мл крови 4,5 мл раствори-
Хилезные, гемолизированные и проросшие сыво- теля). После тщательного перемешивания раз-
ротки непригодны для титрования. При титро- веденную в растворителе кровь помещают в хо-
в а н и и антител можно использовать сыворотку лодильник. На следующий день форменные эле-
или кровь, смешанную с растворителем. менты крови (осадок) удаляют центрифугиро-
Х о д о п р е д е л е н и я . 1 . Разведением ванием, надосадочную жидкость пастеровской
сывороток. Сыворотки больных разводят фос- пипеткой отсасывают в другую пробирку, про-
фатным буфером рН 6,5—6,7. А. 1:50—0,1 мл гревают при 56 °С в течение 30 мин, затем про-
сыворотки плюс 4,9 мл буфера. Б. 1:250—0,5 мл бирки плотно закрывают резиновыми пробками
из разведения 1:50 плюс 2 мл буфера. В. и сохраняют в холодильнике до проведения
1:1000—0,5 мл из разведения 1:250 плюс 1,5 мл опыта. Определение антител в малом объеме
буфера. крови может быть Произведено после длитель-
2. П р и г о т о в л е н и е с т р е п т о л и з и - ного хранения (в течение 25 дней) крови, раз-
н а - О . Высушенный л и о ф и л ь н ы м методом веденной в растворителе.
стрептолизин-О непосредственно перед добавле- Разведение надосадочной жидкости, полу-
нием в пробирки осторожно, не вспенивая, рас- ченной из крови в растворителе. Все разведения
творяют в фосфатном буфере, рН 6,7—6,5, ис- надосадочной жидкости, полученной из крови,

287
Т а б л и ц а 43. Схема титрования антистрептолизина-О в сыворотках

Разведение 1:50 1:250 1:1000 Контроль
сыворотки
эрит- стреп-
толи-
№ пробирки ро-
цитов зина-О
2 4 6
3 11
8 9
1 13
5 7 10 12

Доза сыво-

0,4 0,2 0,15 0,4
ротки, мл 0,3 0,25 0,2 —
0,1 0,25 0,15
0,1
Фосфатный
буфер рН
6,5 — 6,7, мл 0,4
0,3 0,35 0,2 0,4
0,1 0,25 0,3
0,1 0,25 0,35 0,8 0,5
Стрептоли-

зин-О, мл 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
Термостат, 15 мин при 37 °С
5 % взвесь
эритроци-
тов, мл 0,2 0,2 0,2 0,2
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Термостат, 1 ч при 37 °С
Число интер-
националь-
ных единиц
63
в 1 мл 125 165 250 313 413 500 625 1250 2000 3000 Кон-
троль



предварительно смешанной с растворителем, де- Определение антистрептолизина-О имеет
лают на фосфатном буфере рН 6,5—6,7. Исход- особенно большое значение при дифференциа-
ное разведение крови в растворителе 1:10 соот- ции ревматизма от ревматоидного артрита,
ветствует разведению сыворотки 1:20. Исходя из так как при последнем эти антитела, как пра-
этого, из надосадочной жидкости готовят сле- вило, обнаруживаются в низких титрах.
дующие разведения. Определение антистрептолизина-О может
A. 1:50 — 1 мл надосадочной жидкости и быть использовано для выявления скрыто про-
1,5 мл буфера. текающих форм ревматизма, а также для оценки
Б. 1:250 — 0,5 мл надосадочной жидкости, степени активности ревматического процесса.
разведенной 1:50, и № мл буфера. Определение антистрептолизина-О у больных
B. 1:1000 — 0,5 мл надосадочной жидкости, с целью диагностики ревматизма рекомендуется
разведенной 1 : 50, и 1 мл буфера. производить параллельно определению титра
Разведенную надосадочную жидкость из кро- антигиалуронидазы. Обычно у больных ревма-
ви в растворителе и другие ингредиенты разли- тизмом антигиалуронидаза обнаруживается в
вают по пробиркам, как это указано в табл. 43. высоких титрах (1000 единиц и больше) чаще,
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Титр анти- чем высокие титры антистрептолизина-О. Одна-
стрептолизина-О до 250 AEST-O в 1 мл обнару- ко в некоторых редких случаях, при низких
живается у практически здоровых лиц (титры титрах антигиалуронидазы, обнаруживаются
антистрептолизина-О приведены в интернацио- высокие титры антистрептолизина-О.
нальных единицах). В связи с этим титр антител
Л и т е р а т у р а . Анохин В. Н., Черкасо-
до 250 в 1 мл следует считать в пределах нормы.
ва В. Л.— Лаб. дело, 1964, № 7, с. 406; Лям-
Повышенные титры антистрептолизина-О обна-
перт И. М. Серологические методы исследова-
руживаются при ряде стрептококковых инфек-
ния.— М., 1962: МРТУ-42-139-66. Наставление
ций (скарлатина, ангина, хронический тонзил-
по применению сухого препарата стрептолизи-
лит, ревматизм, гломерулонефрит и др.). Повы-
на-О для определения антистрептолизина-О в
шение титра этих антител является показателем
сыворотках больных.— М., 1973.
перенесенной стрептококковой инфекции. Осо-
бенно высоких титров достигают эти антитела
при ревматизме и нефрите. Характерной особен-
6.3.3. Антигиалуронидаза
ностью этих двух заболеваний является обнару-
жение антистрептолизина-О в высоких титрах
(500 AEST-O и выше) с первых дней заболева- Унифицированный метод определения в сы-
ния, что может быть использовано с целью вспо- воротке крови. П р и н ц и п . Специфические
могательного метода диагностики. антитела сыворотки больного вступают в реак-
288
цию с вносимым в нее антигеном — ферментом ка, прогревают при 56 °С в течение 30 м и н и ис-
гиалуронидазой и ингибируют ее активность, пользуют для титрования антител. Хилезные,
что проявляется в сохранении сгустка муцина, гемолизированные и проросшие сыворотки не-
образованного гиалуроновой кислотой в кислой пригодны для титрования.
среде. Разведение сывороток. Сыворотки больных
П о с у д а и о б о р у д о в а н и е . 1 . Термо- разводят 0,85 % раствором хлорида натрия:
стат на 37 "С. 2. Пробирки химические. 3. Шта- 1) 1:50—0,1 мл сыворотки и 4,9 мл 0,85 % хло-
тивы. рида натрия; 2) 1:250—0,5 мл сыворотки, разве-
Р е а к т и в ы . 1 . Препарат (лиофилизиро- денной 1:50, и 2 мл 0,85% хлорида натрия;
ванный) стрептококковый гиалуронидазы (про- 3) 1:1000—0,5 мл сыворотки, разведенной 1:250,
изводства Института эпидемиологии и микроби- и 1,5 мл 0,85 % хлорида натрия.
ологии и м . Н. Ф. Г а м а л е и АМН СССР). Б. Кровь с растворителем: для приготовле-
2. Гиалуроновая кислота. Для приготовле- ния растворителя крови к 100 мл дистиллиро-
ния гиалуроновой кислоты используют пупоч- ванной воды добавляют 2,05 г глюкозы, 0,16 г
ные канатики новорожденных. Освобожденные нитрата натрия и 0,5 г хлорида натрия рН 6,1 —
от сосудов канатики измельчают до кашицеоб- 6,3. После автоклавирования к растворителю
разного состояния, взвешивают, заливают двой- крови добавляют мертиолат до концентрации
ным объемом дистиллированной воды и поме- 1:20 000, з'атем равномерно в стерильных услови-
щают на 2—10 ч в холодильник при 3 °С. После ях разливают по пробиркам и сохраняют в холо-
этого смесь нагревают, доводят до кипения, дильнике при температуре от 4 до 10 "С.
фильтруют через стеклянную вату и сохраняют Кровь в количестве 0,3 мл, взятую из пальца,
при температуре 3 "С. смешивают с 2,7 мл растворителя (на 0,5 мл
При титровании антигиалуронидазы в крови крови 4,5 мл растворителя). После тщательного
больных рекомендуется использовать раствор перемешивания разведенную растворителем
гиалуроновой кислоты с относительной вязко- кровь помещают в холодильник. На следующий
стью, равной 3. С этой целью сопоставляют день форменные элементы крови (осадок) уда-
время истечения дистиллированной воды и рас- ляют центрифугированием, надосадочную жид-
твора гиалуроновой кислоты при температуре кость пастеровской пипеткой отсасывают в дру-
36—37 °С в вискозиметре Оствальда. Расчет гую пробирку, прогревают при 56 °С в течение
относительной вязкости раствора гиалуроновой 30 мин, затем пробирки плотно закрывают рези-
кислоты производят следующим образом. На- новыми пробками и сохраняют в холодильнике
пример, время истечения гиалуроновой кислоты до проведения опыта. Определение антител в ма-
равно 27 с, а время истечения воды — 9с, следо- лом объеме крови может быть произведено после
вательно, относительная вязкость раствора гиа- длительного хранения (в течение 25 дней) крови,
луроновой кислоты равна 3 (27:9). В том слу- разведенной растворителем.
чае, если эта величина больше 3, следует рас- Разведения надосадочной жидкости, полу-
твор развести дистиллированной водой до нуж- ченной из крови с растворителем. Все разведе-
ной вязкости и в качестве рабочей дозы взять ния надосадочной жидкости, полученной из кро-
0,3 мл. ви, предварительно смешанной с растворителем,
При отсутствии вискозиметра Оствальда за делают на 0,85 % растворе хлорида натрия.
рабочую дозу гиалуроновой кислоты принимают Исходное разведение крови в растворителе 1:10
ту дозу, которая при подкислении жидкости соответствует разведению сыворотки 1:20.
уксусной кислотой образует отчетливый сгусток Исходя из этого, из надосадочной жидкости
п р и полном просветлении среды. Рабочая доза готовят следующие разведения:
гиалуроновой кислоты обычно равна 0,3 мл. а) 1:50—1 мл надосадочной жидкости и
В том случае, если рабочая доза гиалуроновой 1,5 мл 0,85 % хлорида натрия;
кислоты больше 0,3 мл, она не может быть п р и - б) 1:250—0,5 мл надосадочной жидкости,
менена для титрования гиалуронидазы. Опреде- разведенной 1:50, и 2 мл 0,85 % хлорида натрия;
ление рабочей дозы гиалуроновой кислоты сле- в) 1:1000—0,5 мл надосадочной жидкости,
дует производить перед каждым титрованием разведенной 1:250, и 1,5 мл 0,85% хлорида
гиалуронидазы. При использовании гиалуроно- натрия.
вой кислоты, вязкость которой неизвестна, необ- Приготовление раствора стрептококковой ги-
ходимо в каждом опыте в качестве контроля алуронидазы: высушенный лиофильным мето-
титровать сыворотку с известным титром анти- дом препарат стрептококковой гиалуронидазы
гиалуронидазы. перед добавлением в п р о б и р к и растворяют в
изотоническом растворе натрия хлорида, как это
Приготовление 15 % раствора уксусной ки-
слоты: 15 мл ледяной уксусной кислоты х. ч. указано на этикетке. Разведенный таким обра-
зом препарат должен содержать в объеме 0,2 мл
прибавляют к 85 мл дистиллированной воды.
одну опытную дозу, т. е. то количество гиалуро-
Х о д о п р е д е л е н и я . Обработка сыво-
нидазы, которое нейтрализуется одной единицей
ротки больных и крови с растворителем. При
рабочего стандарта антигиалуронидазы ГКИ.
титровании антител можно использовать сыво-
ротку или кровь, смешанную с растворителем. Т и т р о в а н и е а н т и т е л . Разведенную
А. Сыворотка больных: кровь, взятую из сыворотку или разведенную надосадочную жид-
пальца или из локтевой вены в количестве не ме- кость из крови в растворителе и другие ингреди-
нее 0,5 мл, ставят на 15 мин в термостат, а затем енты разливают по пробиркам (табл. 44).
в холодильник. Через 2—4 ч стояния при темпе- П р и м е ч а н и е . Общий объем ингредиен-
ратуре от 3 до 8 °С сыворотку отделяют от сгуст- тов в пробирке равен 1 мл, он слагается из

289
10 п / р В. В. Меньшикова
Таблица 44. Схема титрования антигиалуронидазы в сыворотках или в надосадочной жидкости




няется на ± одно разведение. В последующих
количества сыворотки больного, гиалурони-
опытах при отсутствии эталона для контроля
дазы, гиалуроновой кислоты и 0,85 % рас-
можно использовать одну из сывороток боль-
твора N a C l .
н ы х , титр которой был установлен по эта-
Результаты титрования обозначают: плюс
лону.
( + ) —положительная реакция — сгусток и
просветление среды; плюс и минус (±) — сом- Унифицированный метод определения в ма-
нительная реакция — хлопья и нити; минус лом объеме крови. П р и н ц и п тот же.
( —) — отрицательная реакция — мутная среда Р е а к т и в ы . Растворитель (модифициро-
без сгустка. ванный раствор Олсвера — Эйнсли): глюко-
Титр сыворотки выражают числом единиц з а — 2,05 г, нитрат натрия — 0,16 г, хлорид
н а т р и я — 0,5 г, дистиллированная вода —
антигиалуронидазы (AEHyS) в 1 мл сыворотки.
За 1 AEHyS принимают то минимальное ко- 100 мл, рН 6,1. Раствор автоклавируют, добав-
личество сыворотки, которое нейтрализует одну ляют мертиолат (1:20000) и разливают в про-
бирки.
опытную дозу гиалуронидазы.
В табл. 44 приведено число A E H y S в 1 мл при О б р а б о т к а к р о в и б о л ь н ы х . Опре-
деленный объем цельной крови больных, взятой
нейтрализации стрептококковой гиалуронидазы
различными разведениями сыворотки. из пальца пипеткой, смешивают с растворите-
лем (на 0,1 мл крови 0,9 мл растворителя).
К о н т р о л ь . 1. Пробирки № 12, 13 служат
для контроля гиалуроновой кислоты и гиалуро- После тщательного перемешивания смесь поме-
щают в холодильник при 5—10 °С. На следую-
нидазы. Гиалуроновая кислота при учете реак-
щий день ее центрифугируют и удаляют осадок.
ции при подкислении уксусной кислотой должна
Надосадочную жидкость прогревают при 56 °С
образовать полный сгусток. Гиалуронидаза дол-
в течение 30 мин.
жна разрушать гиалуроновую кислоту, которая
при этом 'теряет способность образовывать Исходное разведение крови в растворителе
сгусток при добавлении уксусной кислоты. 1:10 соответствует разведению сыворотки 1:20.
2. Для контроля условий опыта используют Дальнейшее разведение сыворотки делают на
эталон стрептококковой антигиалуронидазы, изотоническом растворе хлорида натрия (см.
2 ампулы которой вложены в коробку со стреп- раздел «Разведение сывороток»).
тококковой гиалуронидазой. Определение антигиалуронидазы — см.
табл. 44.
Содержимое а м п у л ы с эталоном разводят
Оценка полученных результа-
1:50, растворяя его в 10 мл изотонического рас-
т о в . Титр антигиалуронидазы до 300 единиц
твора, и титруют одновременно с сыворотками
(AEHyS) обнаруживают у практически здоро-
больных (см. табл. 44). Результаты титрования
вых людей. Активность фермента, не превы-
сывороток могут быть учтены, если титр эталона
шающая эти цифры, считается нормой.
соответствует указанному на этикетке или откло-

290
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Определе- нию умеренных доз стероидных гормонов.
ние титра антигиалуронидазы широко исполь- В трудных дифференциально-диагностических
зуют в диагностике ревматического процесса. случаях, когда необходимо оценить характер
Количественная характеристика антител — их лихорадки у больных ревматизмом, значитель-
титр — служит критерием активности ревмати- ное повышение титров антигиалуронидазы поз-
ческого процесса. Однако, оценивая этот пока- воляет врачу склониться в пользу активации
затель, необходимо всегда помнить, что уровень ревматизма и применить соответствующую тера-
антител в крови пациента прямо указывает на певтическую тактику.
состояние и м м у н о р е а к т и в н ы х систем и косвен- Л и т е р а т у р а . Иоффе В. И. Иммуноло-
но — на активность патологического процесса. гия ревматизма.— Л., 1962; Лямперт И. М.
У больных ревматизмом титры антигиалурони- Серологические методы исследования.— М.,
дазы достигают 1000 единиц и более. Данные 1962; МРТУ-42 № 136-66 на стрептококковую
литературы, а также опыт работы лаборатории гиалуронидазу. Наставление по применению
иммунологии I ММИ им. Сеченова указывают, стрептококковой гиалуронидазы для определе-
что больные ревматизмом с высокими функцио- ния антигиалуронидазы в сыворотках боль-
н а л ь н ы м и показателями иммунокомпетентных ных.— М., 1966; Сачков В. И., Кузнецова Н. И.,
систем хорошо поддаются терапии. Высокие тит- Анохин В. Н., Токмачев Ю. К- Иммунологи-
ры противострептококковых антител и в большей ческие методы изучения реактивности при рев-
степени антигиалуронидазы у больных ревма- матизме.— В кн.: Вопросы ревматизма. М.:
тизмом могут служить показанием к назначе- Медгиз, 1961, с. 34—48.




6.4. Р Е А К Ц И И П Р Е Ц И П И Т А Ц И И
6.4.1. С-реактивный белок концом в исследуемую сыворотку или серозную
жидкость (последние набирают также на
'/з длины капилляра — 3 см).
Капилляр протирают ватой (при заполне-
Унифицированный метод кольцепреципита-
нии капилляра не должно быть воздуха между
ции в капиллярах. П р и н ц и п . Сыворотка кро-
реагентами). Затем капилляр, заполненный на
ви, экссудат или асцитическая жидкость, содер-
/з длины, покачивают, перемещая жидкость от
жащие белок острой фазы — С-реактивный
одного его конца к другому, вследствие чего
протеин, образуют хлопьевидный преципитат
реагенты перемешиваются (необходимо произ-
при взаимодействии со специфической преципи-
вести 10—12 таких перемещений жидкости).
тирующей иммунной сывороткой к этому анти-
Перед установлением капилляра в штатив
гену.
П р и б о р ы и о б о р у д о в а н и е . 1 . Стек- следует наклонить его с тем, чтобы конец, через
который набирали сыворотку, был свободен на
л я н н ы е капилляры (комплектуются в наборе
15 мм. Затем этот конец капилляра погружают
с антисывороткой). 2. Штатив — брусок пласти-
в пластилин так, чтобы уровень жидкости в нем
лина.
был выше поверхности пластилина на 10 мм
Р е а к т и в ы . Антисыворотка к С-реактив-
(сыворотка находится на воздушном столбике).
ному белку (предприятие по производству бакте-
Чтобы не вылить содержимое капилляра при
рийных препаратов Московского научно-иссле-
фиксации, его следует держать горизонтально,
довательского института вакцин и сывороток
а штатив вертикально. Реакция проходит при
им. И. И. Мечникова).
комнатной температуре. Предварительный учет
И с с л е д у е м ы й м а т е р и а л . Сыворот-
результата реакции производят через 4 ч, после
ку крови получают обычным путем из 0,5 мл
чего капилляр со штативом оставляют на сутки
крови. Можно набирать в отдельный капилляр
при комнатной температуре или ставят на то же
из пальца или уха и отслоившуюся сыворотку
время в холодильный шкаф (температура от
отламывать, отбрасывая оставшиеся в другом
конце капилляра форменные элементы. Подоб- 2 до 8 °С).
Через 24 ч производят окончательный учет
ный метод мы рекомендуем для получения сыво-
результата реакции. Выпадение преципитата
ротки из малых объемов крови при радиальной
(хлопья, осадок) в капилляре указывает на на-
иммунодиффузии, иммуноэлектрофорезе, методе
личие С-реактивного белка в исследуемой сыво-
Оухтерлони и других методах с необходимым
ротке или серозной жидкости.
объемом исследуемого материала 2—5 мкл. Се-
Оценка реакции. Наличие преципитата в ка-
розную цереброспинальную жидкость набирают
пилляре высотой 1 мм оценивают одним ( + )
предварительно в пробирку, а из нее в капилляр.
крестом — реакция слабоположительная; пре-
Необходимо следить, чтобы жидкость была про-
ципитат высотой 2 и 3 мм оценивают соответ-
зрачной, без примеси крови.
Х о д о п р е д е л е н и я . Постановка реак- ственно двумя (++) и тремя (+ + +) кре-
стами — реакция положительная; преципитат
ции. Стеклянный капилляр берут посередине
высотой 4 мм и более оценивают четырьмя
двумя п а л ь ц а м и и, держа под углом 40—45 °,
( + + + +) крестами — реакция резко поло-
опускают концом во флакон с антисывороткой,
жительная (количество преципитата учитывают
набирая ее на '/з длины капилляра (3 с м ) .
К а п и л л я р протирают ватой и опускают тем же по всему к а п и л л я р у ) .

291
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Белок ост- преципитата, или квадрат диаметра кольца, п р я -
рой фазы неспецифичен для какого-либо опре- мо пропорциональна количеству внесенного в
деленного заболевания, но характерен для ост- лунку антигена и обратно пропорциональна кон-
рого воспалительного процесса и может служить центрации антител в агаре. При этом между
признаком активности. концентрацией испытуемого антигена и пло-
щадью преципитата имеется л и н е й н а я зависи-
мость. Как показали исследования M a n c i n i
6.4.2. Циркулирующие и соавт., п р я м а я пропорциональность между
площадью преципитата (или квадратом диа-
иммунные комплексы
метра) и концентрацией антигена устанавлива-
ется лишь после прекращения роста колец. Это
Метод преципитации с 3,5 % раствором по-
время различно для р а з н ы х антигенов и зависит
лиэтиленгликоля ПЭГ-тест ОП280. П р и н ц и п .
от их молекулярной массы. Так, при одной и той
Раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) способен
же концентрации рост колец преципитации пре-
осаждать из сыворотки агрегированные иммун-
кращается для белков Бенс-Джонса через 24 ч,
ные глобулины и иммунные комплексы. Измене-
IgG — через неделю, a IgM — через 10 дней.
ние плотности раствора регистрируется на спек-
Уже через 1 ч после начала диффузии можно
трофотометре п р и длине волны 250 нм.
получить л и н е й н у ю зависимость между диамет-
Различные концентрации ПЭГ (2,5; 3,5; 7 и
ром колец преципитации и логарифмом кон-
даже 10 %) вызывают преципитацию различных
центрации. Fahey и McKelvey (1965) предло-
по молекулярной массе и размерам и м м у н н ы х
жили односуточную инкубацию. В этом случае
комплексов. Низкие концентрации ПЭГ осаж-
линейная зависимость устанавливается л и ш ь
дают комплексы крупных размеров, высокие
в небольшом диапазоне концентраций.
концентрации вызывают преципитацию низко-
Однако использование односуточной инкуба-
молекулярных соединений. 3,5 % ПЭГ флокку-
ции более удобно в практической работе. Поэ-
лирует наиболее распространенные «промежу-
тому все дальнейшее описание метода радиаль-
точные» комплексы средних размеров.
ной иммунодиффузии относится к этому вари-
П о с у д а и о б о р у д о в а н и е . 1 . Про-
анту.
бирки химические и центрифужные. 2. Пипетки.
П р и б о р ы и о б о р у д о в а н и е . 1 . Стек-
3. Центрифуга высокооборотная с ускорением
ла 9 X 12 см. 2. П-образная рамка 1 2 0 Х 9 0 Х
не менее 2000 g. 4. Спектрофотометр.
X 8 мм и толщиной 1 мм для облегчения заливки
Р е а к т и в ы . 1. Буфер боратный 0,1 М,
стекла агаром ( п р и определенном навыке агар
рН 8,4. 2. Полиэтиленгликоль (мол. м. 6000).
можно заливать непосредственно на стекло).
Х о д о п р е д е л е н и я . Готовят 7 % рас-
3. Водяная баня на 50—-60 °С. 4. Автомати-
твор полиэтиленгликоля на 0,1 М боратном
ческая пипетка вместимостью 2 мкл или пасте-
буфере рН 8,4. 200 мкл исследуемой сыворотки
ровские пипетки с оттянутым концом. 5. Влаж-
смешивают с 5 мл боратного буфера указанной
ная камера. 6. Измеритель. 7. Миллиметровая
концентрации; 4 мл этой смеси приливают к 4 мл
линейка.
7 % раствора полиэтиленгликоля (конечная
Р е а к т и в ы . 1 . Моноспецифические сыво-
к о н ц е н т р а ц и я 3,5 %). Пробирку ставят в холо-
ротки к и м м у н о г л о б у л и н а м А, М и G (выпускают
д и л ь н и к при 4 "С на 18—20 ч. После инкубации
в СССР, ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, ИЭМ в
смесь центрифугируют при 2000 g 10 мин. Надо-
г. Горьком и Институте биологических препа-
садочную жидкость удаляют. Преципитат два-
ратов им. И. И. Мечникова, Москва). 2. 3 %
жды отмывают 3,5 % раствором ПЭГ и раст-
агар «Дифко» (США) или «Серва» (ФРГ),
воряют затем в 5 мл 0,1 н. раствора едкого
дальневосточный агар, предварительно очищен-
натра.
ный ' в 0,2 М вероналовом буфере, рН 8,56.
Уровень циркулирующих иммунных комплек-
Навеску 3 г сухого очищенного агара заливают
сов (ЦИК) измеряют на спектрофотометре при
50 мл дистиллированной воды и ставят на не-
280 нм и выражают в единицах оптической
большой огонь, постоянно помешивая в течение
плотности.
40 мин, затем добавляют 50 мл 0,2 М веронало-
Учитывают только те показатели, которые
вого буфера рН 8,56 и доводят на огне до пол-
превышают величину X + 2S здоровых лиц.
ного растворения а г а р а (не доводить до кипе-
н и я ! ) . Добавляют 2 мл 1 % раствора мертио-
лата. 3. Вероналовый буфер 0,2 М, рН 8,56
6.4.3. Иммунные глобулины (5,52 г веронала растворяют в 300 мл дистилли-
рованной воды, постоянно перемешивая при
Одномерная радиальная иммунодиффузия в нагревании, добавляют 35,04 г мединала; дис-
агаровом геле для определения иммуноглобу- тиллированную воду добавляют до 1 л при ох-
линов. П р и н ц и п . Антиген, внесенный в л у н к у лаждении раствора до 20 °С). 4. Окрашива-
агарового слоя, содержащего специфические ющая жидкость: амидо-черный — 1 г, ледяная
антитела, диффундируя в агаре, образует коль- уксусная кислота — 100 мл, дистиллированная
цо п р е ц и п и т а ц и и . Диаметр колец увеличивается вода — до 1000 мл. Профильтровать. 5. Отмыва-
до тех пор, пока весь внесенный в лунку антиген ющая жидкость: ледяная уксусная кислота —
не будет связан содержащимися в геле анти- 70 мл, дистиллированная вода — до 1000 мл.
толами. Величина преципитата отражает коли-
чество антител в геле, эквивалентное концентра-
ции антигена, внесенного в лунку. Площадь См. с. 298.

292
Ход о п р е д е л е н и я . Т е х н и к а по- на расстоянии 15 мм друг от друга. Для того
с т а н о в к и о п ы т а . Т и т р о в а н и е ан- чтобы предотвратить деформацию периферичес-
т и с ы в о р о т к и и выбор рабочего ких колец, особенно IgM, за счет подсыхания
р а з в е д е н и я . Берут две стеклянные пласти- агара и появления эндоосмотических потоков
ны 9 X 1 2 см, одна из которых смазана гидро- делают по периметру агара дополнительные
фобной жидкостью ( н а п р и м е р , ГК.Ж-94), дру- лунки. Готовят разведения стандарта, меняя п и -
гая — тонким слоем агара (каплю горячего ага- петки после каждого разведения. Для исследо-
ра растирают на пластине пипеткой, а пластину вания сывороточных иммуноглобулинов исполь-
прогревают над пламенем). Между этими п л а с - зуют стандартную сыворотку (см. ниже), нераз-
тинами устанавливают П-образную р а м к у тол- веденную и разведенную до 1:2—1:8. В л у н к и
щиной 1 мм и всю систему скрепляют з а ж и - микрошприцем вносят по 2 мкл каждого разве-
мами. Готовят ряд разведений антисывороток дения и испытуемых препаратов. Пластины по-
на 0,1 М веронал-мединаловом буфере, рН 8,6. мещают во влажную камеру и инкубируют сутки
Так, для исследования сывороточных и м м у н о - при 4 °С. Через 24 ч (ровно!) пластины погру-
глобулинов разведения выпускаемых в насто- жают в забуференный изотонический раствор
ящее время антисывороток могут колебаться натрия хлорида и отмывают от несвязавшихся
белков в течение 2 сут с троекратной сменой
от 1/10 до 1/60.
Пробирки, содержащие по I мл каждого буфера. Затем пластины сушат под фильтро-
разведения антисыворотки, помещают в водя- вальной бумагой и окрашивают амидо-черным.
Учет результатов возможен в неокрашенных
ную баню при 56 °С и добавляют в них по 1 мл
пластинах на темном поле с косым освещением,
растопленного и охлажденного до 56 °С 3 % ага-
ра '. Смесь агара и антисыворотки хорошо пере- при этом используют для измерения препарато-
мешивают и быстро выливают в пространство водитель с нониусом, позволяющим измерить
между пластинами, держа последние под углом диаметр с точностью до 0,1 мм.
так, чтобы в них не попали пузырьки воздуха. Определив диаметр колец преципитации
Н а ч и н а ю т с большего разведения антисыворот- в стандартном препарате с известным уровнем
ки, добавляя каждое последующее разведение иммуноглобулинов, строят кривую на полулога-
после застывания предыдущего. На пластине рифмической бумаге, где на оси ординат откла-
можно разместить 4 ряда смеси а г а р а с анти- дывают концентрацию иммуноглобулинов, а на
сывороткой в объеме 2 мл каждое. После засты- оси абсцисс — диаметр колец. Такую кривую-
в а н и я последнего ряда агара снимают зажимы, строят для каждой пластины. Далее, измерив
рамку и пластинку, смазанную гидрофобной диаметр колец в испытуемом препарате, опре-
жидкостью. В каждом ряду, соответствующем деляют по стандартной кривой концентрацию
разведению антисыворотки, пробойником дела- иммуноглобулинов в этом п р е п а р а т .
ют лунки, куда с помощью микрошприца до- Ч у в с т в и т е л ь н о с т ь м е т о д а . Чув-
бавляют разведения стандартного препарата ствительность метода характеризуется тем м и н и -
в объеме 2 мкл. Через сутки и н к у б а ц и и п р и мальным количеством а н т и г е н а , который доста-
1 С, оценивают результаты. Рабочим разведе- точен для образования измеримого диска пре-
нием антисыворотки для каждой системы (для ципитации. Это количество различно для разных
исследования сывороток, секретов и др.) нужно белков и зависит от молекулярной массы анти-
считать максимальное разведение антисыво- гена. По данным М а н ч и н и , для альбумина таким
ротки, дающее со стандартом четкие кольца пределом является 1,25 мкг/мл. По данным
преципитации, интенсивность которых доста- Е. В. Чернохвостовой, при использовании вари-
точна для их измерения. анта с односуточной инкубацией предельной
концентрацией для IgQ и IgA является 40—
Количественное определение
50 мкг/мл, для IgM — 150 мкг/мл. Вместе с тем
иммуноглобулиноввиспытуемых
пределы чувствительности метода радиальной
п р е п а р а т а х . Растопленный и нагретый до
иммунодиффузии в геле можно расширить,
56 °С 3 % агар в объеме 4 мл смешивают с рав-
увеличивая диаметр колец преципитации. С этой
н ы м объемом антисыворотки, разведенной веро-
целью можно пользоваться вместо агара 0,8 %
нал-мединаловым буфером 0,1 М до '/2 рабочего
агарозой или ацетат-целлюлозой. Наиболее про-
разведения. Эту смесь в объеме 8 мл заливают
стым и распространенным методом является
в пространство между двумя пластинами, как
разведение антисыворотки, поскольку при разве-
описано выше (см. «Титрование антисыворо-
дении антисыворотки увеличивается площадь
ток»). Пластины с залитой смесью оставляют
геля, содержащего антитела, которые необхо-
на 10 мин при комнатной температуре. После
димы для связывания данного количества а н т и -
застывания смеси агара с антисывороткой сни-
гена, т. е. увеличивается размер преципитата.
мают зажимы, р а м к у и пластину, смазанную
гидрофобной жидкостью. На каждой пластине
пробойником делают 35 лунок диаметром 2 мм



1
Приведена концентрация, пригодная для
большинства серий агара. Для разных серий
необходимая концентрация а г а р а устанавлива-
ется э м п и р и ч е с к и .

293
Т а б л и ц а 45. Содержание иммуноглобулинов в стандартных препаратах ВОЗ
и Института эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи А М Н СССР
IgG IgM IgA
1
МЕ/мл мг/мл МЕ/мл МЕ/мл
мг/мл' 1
мг/мл

96,2
96,2 93,5
ВОЗ (67/97) 8,04 1,42 0,85
Институт им. Га-
2
143,5 11,52 144,0
126,6 1,2
малея 1,8

1
Уровень иммуноглобулинов в весовых е д и н и ц а х — средний уровень, полученный в 10 лабора-
ториях с разными реферанс-антигенами.
2
Уровень и м м у н о г л о б у л и н о в в стандарте Института и м . Н. Ф. Гамалеи получен при сравне-
нии со стандартом ВОЗ.



Однако с разведением антисыворотки умень- ошибка метода увеличивается до 10 %. При
шается плотность преципитата и необходимы этом в зависимости от природы антигена и кон-
дополнительные изменения методики для того, центрации антисыворотки меняется наклон стан-
чтобы этот преципитат можно было измерить. дартной кривой, что также отражается на вос-
Так, можно усилить интенсивность колец окра- производимости метода. При определении IgM,
шиванием их амидо-черным или нигрозином дающего наименьшие кольца преципитации и
с ледяной уксусной кислотой. Плотность преци- наиболее крутую стандартную кривую по срав-
питата можно повысить также с помощью ряда нению с д р у г и м и и м м у н о г л о б у л и н а м и , ошибка
копреципитирующих факторов. Например, нор- определения составляет 13 %, а при определе-
мальная кроличья сыворотка, используемая вме- нии IgG — 10 %.
сто буфера для разведения антисыворотки, бу- Стандарт и требования к нему.
дет включаться в комплекс антиген — антитело, Одним из важных условий количественного оп-
усиливая плотность преципитата. Аналогичный ределения иммуноглобулинов является правиль-
эффект оказывает дополнительная обработка ный выбор стандарта, по которому строится
пластин антиглобулиновой сывороткой: пласти- калибровочная кривая. Такой стандарт должен
ны после инкубации и отмывки погружают быть единым, чтобы можно было сравнивать
в раствор антисыворотки, содержащей антитела результаты, полученные в разных лаборато-
к глобулину сыворотки, включенной в агар; риях.
спустя сутки кольца преципитации можно уви- Использование очищенных иммуноглобули-
деть в неокрашенных пластинах. нов в качестве такого референс-препарата неце-
Наиболее эффективным способом повышения лесообразно, во-первых, потому, что очищенные
чувствительности метода радиальной иммуно- белки менее стабильны при х р а н е н и и и, во-вто-
диффузии является использование меченной 131 1 рых, потому, что при выделении иммуноглобу-
антисыворотки. В этом случае агар можно линов возможны изменения их структуры (рас-
131
смешивать с антисывороткой, меченной 1 в та- щепление, агрегирование и т. п.) и, следователь-
ком разведении, что кольца преципитации ви- но, антигенных и диффузионных свойств. Неже-
зуально не обнаруживаются, учет результатов лательно также использовать в качестве стан-
дарта сыворотки больных парапротеинемически-
возможен лишь при авторадиографии. Возмож-
на и другая модификация этого метода — обыч- ми ретикулезами, так как содержащиеся в т а к и х
ная постановка радиальной иммунодиффузии со сыворотках IgG и IgM структурно отличаются
столь высокими разведениями антисыворотки, от нормальных иммуноглобулинов. Наиболее
что кольца преципитации визуально не выявля- целесообразно использовать в качестве стан-
ются. Последующая обработка такой пластины, дарта нормальную человеческую сыворотку или
131
меченной 1 антисывороткой к глобулину сы- плазму.
воротки, включенной в агар, и авторадиогра- Отделение биологической стандартизации
фия повышают чувствительность реакции в 32— Национального института по медицинским ис-
следованиям в Лондоне выпустило такой стан-
64 раза.
В о с п р о и з в о д и м о с т ь м е т о д а ра- дарт. Он представляет собой плазму 465 здоро-
диальной иммунодиффузии определяется дли- вых взрослых мужчин-доноров, проживающих
в А н г л и и . Часть этого препарата была исполь-
тельностью инкубации и наклоном стандартной
кривой. Если результаты учитывают после пре- зована ВОЗ как международный стандарт и м -
кращения роста колец, когда между всеми кон- муноглобулинов G, А, М человека.
центрациями антигена и площадью соответст- В СССР стандартная сыворотка для коли-
вующих им преципитатов устанавливается ли- чественного определения иммуноглобулинов ме-
нейная зависимость, то ошибка метода состав- тодом радиальной иммунодиффузии выпуска-
ется Институтом эпидемиологии и микробио-
ляет 2 %. При более короткой инкубации, когда
л и н е й н а я зависимость между концентрацией ан- логии им. Н. Ф. Гамалеи (Москва) и Горьков-
тигена и диаметром колец устанавливается ским институтом эпидемиологии и микробиоло-
л и ш ь в небольшом диапазоне концентраций, гии (табл. 45, 46).
294
Т а б л и ц а 46. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке здоровых людей в зависимости
от возраста, мг/100 мл
16
Имму- 7—12 13— 24— 4-5
Колебание 9—11 12— Взрос-
1 — 15 сут — 4-6 6-8
ногло-
показателей мес 24 мес 36 мес лет
сут мес лет лет 16 лет лые
булин 3 мес

656
IgG 693 1199 1185
1250 1418 1432 1432 1637
Верхний предел 4746
1268
Среднее геометри-
822
852 390 392 638 789 883 967 945 944 1086
ческое
232 222 339 498 570 550
572 653 625 604 720
Нижний предел
207
151 161 205 280
69 313 461 469 538
Верхний предел
IgM Среднее геометри-
77 143
23 71 85 182 321
124. 218 258
ческое
37 74
8 33 73
35 106 103 142 192
Нижний предел
107 157
94 188 128 138 164
150 143 182
160
Верхний предел
Среднее геометри-
80 84
11 49 85 95 92 102 93 91 106
ческое
49
22 58 47 51 63
1 49 61 51 61
Нижний предел
IgA



Выпускаемые стандарты следует использо- При некоторых заболеваниях повышение
вать как референс-препараты для калибровки уровня IgM сопутствует хронизации процесса.
Уровень сывороточного IgG колеблется в очень
собственного рабочего стандарта, в качестве
широких пределах при разных заболеваниях.
которого может быть использована любая смесь
свежих сывороток от здоровых доноров. Рабочий Повышение его чаще сопутствует активности
процесса. В клинической практике интерпрета-
стандарт следует сохранять при низкой темпе-
ция результатов исследования иммуноглобули-
ратуре (— 20 °С и ниже) либо в лиофилизиро-
нов должна осуществляться в комплексе с кли-
ванном состоянии.
ническими д а н н ы м и , результатами других и м м у -
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Относи-
нологических показателей.
тельная простота исполнения, доступность реак-
Определение иммуноглобулинов в других, не-
тивов способствовали широкому внедрению ме-
жели сыворотка, биологических жидкостях име-
тода в клиническую практику. Однако данные
ет большую диагностическую информативность.
литературы и наш собственный опыт работы
Уровень иммуноглобулинов мочи позволяет быть
этим методом с сыворотками самых различных
более объективным в оценке активности почеч-
больных в течение более 10 лет позволяют реко-
ного процесса и глубины поражения клубочко-
мендовать ограничение применения этого мето-
да довольно узким спектром нозологических вого аппарата. Появление IgM в моче крайне
редко и наблюдалось только в тяжелых случаях
форм. В первую очередь речь идет о диагности-
волчаночной нефропатии и при амилоидозе. Со-
ке заболеваний, сопровождающихся синтезом
держание иммуноглобулинов в бронхоальвео-
моноклоновых парапротеинов. Метод радиаль-
лярной жидкости при фиброзирующем альвео-
ной иммунодиффузии выступает в данной ситу-
лите коррелирует с глубиной морфологических
ации скрининговым методом, представляющим
изменений альвеолярной мембраны. Уровень
патологическую сыворотку для детального ана-
IgG в желчи позволяет дифференцировать
лиза в иммуноэлектрофорезе и др. Высока диаг-
воспалительные заболевания желчевыводящих
ностическая информативность метода в оценке
путей. Большую роль в диагностике заболеваний
первичных и вторичных иммунодефицитов, про-
женской половой сферы, изучении причин бес-
являющихся блокированием синтеза или врож-
плодия играет характеристика иммуноглобули-
денным отсутствием отдельных классов иммуно-
нов в шеечном секрете (шеечный фактор).
глобулинов или их всех — тип Брютона. Высо-
кое содержание сывороточных иммуноглобули- Л и т е р а т у р а . Малкина Л. А., Шахани-
нов А, М, G наблюдается при системной красной на К. Л.— Журн. микробиол., 1975, № 3, с. 33;
волчанке, болезни Шегрена, хроническом актив- Стефани Д. В. Иммунология детского возра-
ном гепатите, ювенильном ревматоидном артри- ста.— м., 1981; Чернохвостова Е. В. Количест-
те. Причину повышения уровня иммуноглобу- венное определение иммуноглобулинов методом
линов отдельных классов в каждом конкретном радиальной иммунодиффузии в геле: Методи-
случае необходимо анализировать отдельно и ческие рекомендации.— М., 1975; Fahey 1.,
редко можно связать с определенным заболева- McKelvey E. J. I m m u n o l o g y , 1965, v o l . 94, p. 84—
нием; например, повышение уровня IgA патогно-
102.
монично для особой формы геморрагического
нефрита, при поражениях печени алкогольной
6.4.4. Альфа-фетопротеин
природы, неспецифическом язвенном колите.
Высокие значения IgM характерны для ревма-
Двухмерная иммунодиффузия в геле.
тоидного артрита, особенно в начальном, труд-
П р и н ц и п и в о з м о ж н о с т и метода.
ном для диагностики, периоде заболевания, при
Исследуемые объекты, содержащие антигены и ан-
обострении системной красной волчанки.
295
Рис. 10. Схема постановки метода двойной д и ф ф у з и и в геле для определения а-фетопротеина.
a с х е м а с т а н д а р т н о г о ш т а м п а : д и а м е т р периферических лунок 4 м м . радиус центральной л у н к и 9 мм; б —
т и п ы р е а к ц и й ; R - - с х е м а постановки о п ы т а ; AT — к р о л и ч ь я моноспенифическая антисыворотка против
а-фетопротеина человека; АГ — а-фетонротеин; 1,2,3,4 — и с п ы т у е м ы е с ы в о р о т к и ; ИР — изотонический
раствор хлорида натрия.



титела, помещенные в гель, диффундируют в его Р е а к т и в ы . 1. Агар (очищенный и гото-
толще и, взаимодействуя друг с другом, обра- вый к употреблению). 2. 0,85 % раствор хлорида
зуют в зоне эквивалентных количественных со- натрия, забуференный вероналовым буфером
о т н о ш е н и й п р е ц и п и т а т ы (рис. 10). ( н а 85 мл изотонического раствора хлорида
Метод обладает высокой специфичностью, натрия 15 мл буфера, рН 8,4—8,6) -до рН 7,0—
чувствительностью и разрешающей способно- 7,2 с консервантом (мертиолат 1:10000).
стью. Простота исполнения метода позволяет Х о д о п р е д е л е н и я . Подготовка имму-
воспроизвести его в любых лабораториях. Двух- нодиагностикума: содержимое ампул растворя-
мерная иммунодиффузия в геле позволяет не ют в изотоническом растворе хлорида н а т р и я
только и (учить композицию биологических мате- (объем растворителя у к а з а н на этикетке ампу-
р и а л о в , ни и к а ч е с т в е н н о и количественно оха- л ы ) . Получают слегка опалесцирующий рас-
рактеризовать примеси в высокоочищенных твор.
(с химической точки зрения) препаратах. Ис- П о с т а н о в к а и у ч е т р е а к ц и и . Чи-
пользуя возможности качественного анализа ме- стую стеклянную камеру подсушивают, проведя
тода, можно в ы я в и т ь м и н и м а л ь н ы е антигенные ее несколько раз над пламенем горелки, и поме-
различия двух с р а в н и в а е м ы х систем ( н а п р и м е р , щают на горизонтальную поверхность. В камеру
появление в сыворотке или экскретах больных заливают 23 мл расплавленного 1 % прозрач-
белков с и з м е н е н н ы м и антигенными свойст- ного агара Дифко на изотоническом растворе
хлорида н а т р и я рН 7,0—7,2, с мертиолатом
в а м и ) . Характеризуя количественные сторо-
1:10 000 и закрывают покровным стеклом. Через
ны компонентов системы, метод позволяет про-
30—40 мин в застывшем агаре просекают кон-
извести расчеты эквивалентных соотношений
туры лунок стандартным штампом. Агаровые
антигена и антител, без чего невозможен
пробки отсасывают с помощью трубки, диаметр
квалифицированный анализ специфически
которой на 2,5—3 мм меньше диаметра трубок
взаимодействующих белковых компонентов во
ш т а м п а , и получают л у н к и с ровными к р а я м и .
всех методах, в основе которых лежит фено-
В каждой камере можно отштамповать 6 фигур
мен преципитации: от одномерной диффузии
и провести анализ 12 испытуемых сывороток.
в геле до радиоиммунологического ана-
лиза. В центральную л у н к у фигуры заливают AT,
Определение антигена первичного рака пе- а в две периферические, противоположные друг
чени и тератобластом в сыворотке и асцити- другу, лунки — AT и м м у н о д и а г н о с т и к у м а . Ос-
ческой жидкости. П р и н ц и п . Моноспецифи- тавшиеся четыре боковые л у н к и заливают испы-
ческая антисыворотка, помещенная в лунку туемыми сыворотками и изотоническим раство-
агарового геля, диффундирует в нем. При нали- ром хлорида натрия. Реагенты вносят капил-
чии в исследуемой сыворотке или асцитической л я р а м и в л у н к и вровень с поверхностью агара.
ж и с к о с т и специфического эмбрионального анти- После заполнения лунок реагентами плекси-
гена альфа-фетопротеина АФ11 — маркера пер- гласовую поверхность к а м е р ы смазывают тон-
вичного (но не вторичного или метастатичес- к и м слоем технического вазелина, камеру закры-
кого) рака печени или тератобластомы, он (ан- вают стеклянной пластинкой и оставляют при
г и г е и ) образует в зоне эквивалентных коли- комнатной температуре на 24—48 ч. Перед
честв четкий преципитат с антителами а н т и с ы - регистрацией результатов открытую камеру ре-
воротки. комендуется поместить на 1 ч в 10 % раствор
П р и б о р ы и о б о р у д о в а н и е . Стан- N a C l . Такая обработка способствует исчезно-
дартный набор и м м у н о д и а п ю с т и к у м а (ИЭМ им. в е н и ю непрозрачных ореолов вокруг лунок с ис-
Н. Ф. Гамалеи, Москва) в комплекте со ш т а м п о м пытуемыми сыворотками, затрудняющих учет
для пробивания лунок. результатов.

296
Р е з у л ь т а т ы р е а к ц и и оценивают п о и последующее снижение ( ! ) уровня антигена
плюсовой шкале. Реакцию считают положитель- в отличие от гепатомы, когда происходит неук-
ной, если л и н и я преципитации иммунодиагнос- лонное нарастание титров. В редких с л у ч а я х
тикума сливается с л и н и е й преципитации, обра- острого алкогольного гепатита можно выявить
зованной антигеном испытуемой сыворотки и а н - антиген. В подобных ситуациях нарастание тит-
тителами иммунодиагностикума. В зависимости ров АФП отражает, по всей вероятности, актив-
от места слияния полос реакцию считают: слабо- ность процессов регенерации печеночной парен-
положительной ( + ). если слияние полос наблю- х и м ы . И н ы м и словами, АФП выступает здесь
дается у л у н к и с испытуемой сывороткой. Со- как косвенный п р и з н а к цирротической перест-
держание альфа-фетопротеина в сыворотке ройки органа. Н а л и ч и е антигена в околоплод-
больного меньше 50 мкг/мл; положительной н ы х водах беременных — достоверный признак
( + +), если л и н и и преципитации иммунодиаг- тяжелого врожденного уродства плода, позво-
ностикума и испытуемой сыворотки находятся ляющий рекомендовать прерывание беремен-
на одинаковом расстоянии от центральной лун- ности. Появление альфа-фетопротеина в сыво-
ки. Содержание альфа-фетопротеина в сыво- ротке беременных женщин во II и I I I триме-
ротке больного 50 мкг/мл; резко положитель- стре — физиологическое явление: проникнове-
ной (+ + +), если л и н и я преципитации испы- ние эмбрионального антигена в кровоток бе-
ременной.
туемой сыворотки диффузна и сдвинута в сто-
рону центральной лунки, а л и н и я преципита- Приведенные факты свидетельствуют о необ-
ции иммунодиагностикума резко загибается ходимости повторных исследований материала
при выявлении АФП.
в месте с л и я н и я с линией преципитации сыворот-
ки больного. В некоторых случаях, когда реак-
Л и т е р а т у р а . Абелев Г. И. и соавт.—
ция идет в сильном избытке антигена, содержа-
Биохимия, 1963, т. 28, № 4, с. 625—634; Абе-
щегося в испытуемой сыворотке, л и н и я преци-
лев Г. И. и соавт.— Бюл. экспер. биол. мед.,
питации этого антигена с антисывороткой не об-
1971, № 76, с. 475; Наставление по применению
разуется, а л и н и я п р е ц и п и т а ц и и иммунодиагно-
иммунодиагностикума для первичного рака пе-
стикума резко обрывается. При таком типе реак-
чени (ПРП) и тератобластом (ТБ).—М., 1977;
ции содержание альфа-фетопротеина в сыво-
Татаринов Ю. С.— Вопр. мед. химии, 1964, т. 10,
ротке больного больше 50 мкг/Мл. В этих слу-
№ I, с. 90—91.
чаях необходимо повторно поставить реакцию
с разведенной испытуемой сывороткой и уста-
6.4.5. Парапротеины
новить идентичность выявляемого антигена
альфа-фетопротеину иммунодиагностикума; от-
Иммуноэлектрофоретический анализ.
рицательной (—), если л и н и я п р е ц и п и т а ц и и
иммунодиагностикума достигает своими кон- П р и н ц и п . Белки исследуемой биологической
ц а м и лунок с испытуемыми сыворотками, так среды, предварительно разделенные в электри-
же как и лунок с изотоническим раствором ческом поле в соответствии с электрическим
хлорида натрия. зарядом и подвижностью, зависящей от величи-
Диагностическими считают все три описан- ны заряда, градиента потенциала и свойств
ных типа положительных реакций. среды-носителя, проявляются в реакции преци-
В редких случаях сыворотки больных дают питации с антисывороткой, содержащей специ-
неспецифическую реакцию с компонентами и м - фические антитела к исследуемым антигенам.
мунодиагностикума. Как правило, это широкий Метод обладает высокой разрешающей спо-
диффузный преципитат, который образуется при собностью, несложен в исполнении. Он позво-
взаимодействии испытуемой сыворотки как с ан- ляет получить представление об относительной
тисывороткой, так и с антигеном иммунодиаг- концентрации компонентов в системе, опреде-
ностикума. П р и н ц и п и а л ь н о е отличие неспецифи- лить индивидуальный антиген, не выделяя его
ческой реакции от специфической заключается из смеси. Изменение физических свойств одного
в том, что образующийся преципитат н и к а к не из компонентов, ведущих к отклонениям в имму-
связан со специфической л и н и е й п р е ц и п и т а ц и и нологической специфичности, как это наблюда-
иммунодиагностикума: он либо пересекает спе- ется при гаммапатиях, четко выявляется при
цифическую л и н и ю преципитации, либо образу- использовании иммуноэлектрофоретического
ется независимо от нее. При обработке 10 % анализа.
раствором NaCI неспецифический преципитат П о с у д а и о б о р у д о в а н и е . 1 . Прибор
исчезает совсем или заметно ослабляется. для электрофореза ПЭФ-3, выпускаемый заво-
дом «Физприбор» в г. Фрунзе, или для и м м у н о -
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Выявление
электрофореза УЭФ, выпускаемый э к с п е р и м е н -
альфа-фетопротеина — высокоинформативный
тальными мастерскими Института физиологии
тест в диагностике гепатом. Он позволяет также
и м . А. Богомольца в г. Киеве. 2. Стекла 9Х 12 см.
дифференцировать первичные и вторичные гепа-
томы, установить этиологическую причину опу- 3. Пробойник лунок диаметром 1,5 мм. 4. Нож
холи яичка. Однако в определенных ситуациях для прорезания траншей в агаре. 5. Водяная
антиген может появляться в сыворотке или баня. 6. Эксикатор. 7. Бачки для окрашивания
других биологических жидкостях вне связи с ге- стекол с агаром и для последующего отмывания.
патомой или тератобластомой. АФП нередко Р е а к т и в ы . 1. Агар-агар. 2. Вероналовый
и в высоких т и т р а х может быть обнаружен буфер 0,05 М, рН 8,6, ионная сила 0,1 (0,05 М
при остром гепатите А. Но п р и этом заболевании раствор веронала натрия, 0,01 М раствор диэ-
повторные исследования выявляют нарастание тилбарбитуровой кислоты и 0,05 М раствор

297
Добавляя к надосадочной жидкости 0,2—0,3
ацетата натрия). 3. Краситель (амидо-черный
или кислотный сине-черный). Антисыворотки: объема горячего спирта, получают белый хло-
пьевидный осадок, хорошо формирующийся при
а) поливалентная к сывороточным белкам чело-
стоянии при 37 °С. Большую часть опалесциру-
века; б) моноспецифические антисыворотки к
ющей надосадочной жидкости удаляют водо-
различным классам иммуноглобулинов; в) анти-
струйным насосом, а остаток — центрифуги-
сыворотки к легким цепям типа каппа (х) и
рованием. Осадок промывают абсолютным спир-
ламбда (А.). Все перечисленные сыворотки вы-
том, сушат при 37 °С и растирают. Получают
пускаются в СССР.
Ход и с с л е д о в а н и я . I. П р и г о т о в - белый порошок, который хорошо сохраняется
л е н и е а г а р а : предпочтительнее использо- в закрытых банках. Подобный порошок очень
удобен для приготовления любых концентра-
вать готовый к употреблению очищенный и лио-
ций геля, прозрачен, пригоден для разделения
ф и л и з и р о в а н н ы й бактоагар фирмы «Дифко»
крупномолекулярных белков.
(США) или «Серва» (ФРГ). Если таковых
нет, можно с успехом применять дальневосточ-
П . З а л и в к а п л а с т и н . Стеклянные
ный агар-агар (зарубежные авторы рекомен-
пластины 9 X 12 см (можно использовать фото-
дуют а н а л о г и ч н ы й дальневосточному японский
графические стекла), тщательно вымытые и
агар-агар) после предварительной обработки.
обезжиренные, заливают 1 % раствором агара
Предлагаем несколько способов очистки
на вероналовом буфере при 45 °С. Стекла пред-
агара.
варительно укладывают на столик с горизон-
Способ Клаузена [Clausen, 1970]. А г а р
тальным уровнем. Для образования слоя агара
предварительно отмывают в проточной водопро-
толщиной 1 мм на пластину достаточно 10 мл
водной воде. После этого набухший агар, отжа-
раствора агара. Для разливки агара удобно
тый от излишков воды, растворяют при 90 °С
использовать мерную п и п е т к у вместимостью
в дистиллированной воде, добавленной из рас-
10 мл, предварительно прогретую. Для образо-
чета 10 % (по массе или объему) раствора.
вания ровного слоя геля, избежания неравно-

<<

стр. 16
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>