<<

стр. 17
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

К раствору добавляют безводный хлорид каль-
мерного его подсыхания и засорения поверх-
ция из расчета 10 г на 100 г агара для осаждения
ности стекла с агаром необходимо закрыть ко-
примесей. Горячий агар фильтруют через капро-
нической крышкой (чтобы образующийся кон-
новое сито или фильтр со стекловатой. После
денсат не стекал на а г а р ) .
застывания его режут на маленькие блоки и по-
мещают в широкий сосуд, закрытый капроновой
III. П о д г о т о в к а а г а р о в о й п л а -
сеткой, и ставят на 3 дня под проточную водо-
с т и н ы для п р о в е д е н и я и м м у н о -
проводную воду, а затем в течение 2 дней промы-
электрофоретического анализа.
вают дистиллированной водой, 5 раз меняя воду,
Исследуемый материал (сыворотка, моча, ла-
взятую в 1000-кратном объеме к объему блоков.
в а ж н а я жидкость, околоплодные воды и т. д.)
После этого агар вновь расплавляют и фильт-
помещают в лунки и подвергают электрофорети-
руют через капроновое сито. Растворы очищен- ческому разделению. По окончании электрофо-
ного агара в буфере с добавлением мертиолата
реза вырезают траншею, куда вносят соответст-
1:100000 готовят из расчета первоначальной
вующую целям исследования антисыворотку.
(взятой в обработку) массы или объема агара-
сырца. Готовый агар разливают в маленькие Для исследования парапротеинов в сыворот-
флаконы, объем которых достаточен для разо- ке больных применяют лунки диаметром 2 мм
вого использования, и хранят в холодильнике на расстоянии 3 мм от траншеи, ширина которой
при температуре от 4 до 6 °С. составляет 2 мм и длина 60 мм. Однако необхо-
Специальный метод очистки агара [Гра- димо помнить, что в зависимости от концентра-
бар П., Буртэн П., 1963]. В большой сосуд ц и и антигена и титра антител антисыворотки
(вместимостью 25 л) помещают около 500 г расстояние лунки от траншей может изменять-
сухого волокнистого агара и промывают не ме- ся, его подбирают опытным путем (пробивают
нее 1 ч проточной водой при 50 °С и столько же ряд лунок от минимального приближения к
времени дистиллированной водой при той же траншее 1 мм, до максимального удаления —
температуре. Затем агар быстро расплавляют 10 мм). Выбирают то расстояние, которое обес-
на водяной бане так, чтобы получился 3 % рас- печило наиболее «контрастный» преципитат.
твор в дистиллированной воде. К этому раствору Лунки пробивают пробойником соответству-
добавляют а к т и в и р о в а н н ы й уголь (1 г на 1 л) ющего диаметра, а затем агаровую пробу уда-
и центрифугируют 5 мин при 60 °С. Полученной ляют при помощи водоструйного насоса. Иссле-
прозрачной жидкости дают застыть. Гель разре- дуемую сыворотку вносят в лунку пастеровской
зают на мелкие кусочки и оставляют при — 10 °С пипеткой. Наполнение лунки контролируют по
до полного замерзания. После оттаивания гель исчезновении блика (не переливать!). Заполне-
отжимают в марле. Волокнистый отжим отмы- ние лунки требует определенного навыка. Нали-
вают дистиллированной водой и снова отжи- чие автоматической пипетки значительно упро-
мают, затем расплавляют и смешивают с равным щает технику внесения образца и повышает
исходным объемом 0,85 % раствора хлорида стандартизацию исследования.
натрия. К охлажденному до 65 °С раствору по- Лунки наносят по вертикальной оси стекла,
степенно добавляют горячий спирт до появления желательно по трафарету, стабилизирующему
осадка (обычно бывает достаточно 1 , 1 объема их положение на стекле относительно полюсов
спирта). Этот первый осадок после центрифуги- и пробиваемых после проведения электрофореза
рования при той же температуре отбрасывают. траншей. Число лунок определяется количеством
298
н ы я в л я е м ы х параметров: общая характеристика
иммунологической специфичности сывороточных
белков с поливалентной антисывороткой, с моно-
специфическими антисыворотками к иммуногло-
булинам А, М, G, к легким цепям к а п п а и ламб-
да (у. и Л).
Проведение электрофореза.
Электролитные ванны прибора заполняют бу-
ферным раствором (катодная и анодная ван-
ны — одинаковым количеством раствора). Перед
использованием необходимо проверить рН буфе-
ра. У ч и т ы в а я , что в анодной ванне во время
электрофореза происходят интенсивные процессы
гидролиза, может меняться рН и ионная сила,
необходимо смешивать катодный и анодный ра-
створы по окончании процедуры.
Стекла с агаром и нанесенными образцами
соединяют с электродными кюветами при помо-
щи нескольких слоев фильтровальной б у м а г и .
Толщина слоя контактных полос, плотность при-
л е г а н и я б у м а г и к плоскости агара могут изме-
нять величину силы тока. Наилучшее разделение
фракции получают при величине подаваемого
на агаровую пластину потенциала 9 В/см по оси
электрофореза (I = 40—50 мА) в течение 3—4 ч.
Контроль за скоростью м и г р а ц и и можно осу-
ществлять, наблюдая движение «тени» альбу-
мина при боковом освещении агаровой пластины
или используя «свидетель-краситель», скорость
движения которого равна скорости миграции
альбумина ( п и р о н и н ) .
По окончании электрофореза в агаровой пла-
стине вырезают траншеи в соответствии с тра-
фаретом (размеры траншеи указаны выше) и
задачами исследования. Пластины с заполнен-
ными антисывороткой траншеями помещают во
влажную камеру, в качестве которой удобнее
всего использовать эксикатор с небольшим коли- Рис. 11. Определение типа парапротеинов и
чеством воды. Появление полос преципитации белков Бенс-Джонса. Контроль специфичности
отмечается уже на вторые сутки. Полностью антисывороток после адсорбции.
взаимодействие белков, диффундирующих из В т р а н ш е я х — а н т и с ы в о р о т к а к л-цепи; в л у н к а х :
траншеи с антигенами, расположенными по оси 1 — н о р м а л ь н а я человеческая сыворотка; 2 — моче-
электрофореза, заканчивается на 4—5-е сутки. вой концентрат, содержащий белок Бенс-Джонса
х-типа; 3 — мочевой концентрат, с о д е р ж а щ и й белок
Достаточно четкие полосы п р е ц и п и т а ц и и позво-
Бенс-Джонса Я - т и п а ; 4 — препарат о ч и щ е н н о г о
ляют анализировать нативные препараты. При
lgGx-типа в к о н ц е н т р а ц и и 0,1 %; 5 — п р е п а р а т очи-
необходимости их можно окрасить. Для эффек- щенного lgG?.-типа в к о н ц е н т р а ц и и 1 %.
тивного о к р а ш и в а н и я все белки, не участвующие
в специфической реакции, удаляют, промывая
пластину в течение 2—3 дней изотоническим
раствором, который несколько раз меняют. По
окончании п р о м ы в а н и я гель накрывают смочен-
ной в дистиллированной воде фильтровальной пленку. Высыхая, агар полностью сохраняет всю
бумагой (можно положить небольшой груз) и картину преципитации, плотно прилипает к
оставляют сохнуть при 37 °С или комнатной тем- пленке и может быть сфотографирован или со-
пературе. Когда гель высыхает и превращается хранен как документ.
в присохшую к стеклу пленку, бумагу легко уда- А н а л и з п р е ц и п и т а ц и о н н ы х дуг проводят в
ляют с его поверхности. Высушенную пластину соответствии со схемой постановки, т. е. учета
помещают в кювету с красителем следующего специфичности антисыворотки в траншеях и
состава: амидо-черный В — 1 мл, уксусная кис- взаимного их расположения с л у н к а м и , содер-
лота — 450 мл, 0,1 М ацетат натрия — 450 мл, ж а щ и м и антиген. Примерная схема расположе-
глицерин — 100 мл. Окрашивание продолжают ния лунок и траншеи при исследовании парапро-
в течение 3—4 ч. После этого пластины извле- теина типа Бенс-Джонса представлена на
кают и помещают в кюветы с отмывающей жид- рис. 11.
костью — 2 % уксусной кислотой, содержащей При исследовании парапротеинов сыворотки
10—15 % глицерина. Обработанную подобным типа Q в л у н к у помещают цельную сыворотку.
образом агаровую пластину легко снимают со В траншеи заливают антисыворотки к легкой
стекла и переносят на отмытую рентгеновскую цепи, соответствующей типу исследуемого G-na-
299
Рис. 12. Различное расположение парапротеинов типа IgG по отношению дуги IgG
(по Fauvert et al., 1962, 1978).

рапротеина. Образуется так называемая мие- клональных макроглобулинов необходимо иссле-
м а я л и н и я преципитации («ложкообразный» довать разведенные сыворотки, так как в про-
преципитат) с утолщением в одном ограничен- тивном случае л и н и я нормального IgG мешает
ном участке, идентичная по форме линии, обра- титрованию.
зующейся с антисывороткой к IgG. Моноклоно- Особого методического подхода требуют дру-
вость парапротеина и нередко высокая его кон- гие источники антигенов, подвергаемые имму-
центрация обусловливают плотность преципи- ноэлектрофоретическому анализу. Все они, и
тата и приближенность его к траншее. Чувстви- моча, и промывные воды бронхоальвеолярной
тельность метода позволяет рано выявлять син- системы, и цереброспинальная жидкость и др.,
тезируемый парапротеин. Низкие начальные как правило (исключение составляет моча, со-
концентрации — «Disglobulinemie minima» держащая в ряде случаев нефротичеекого синд-
[Greysel R. et al., 1958]— могут давать измене- рома большие количества белка), имеют низ-
ние концевого фрагмента дуги в виде утолщения кие концентрации антигенов. Поэтому иммуно-
или расщепления. электрофоретическому анализу должно пред-
Схема различных типов преципитатов пара- шествовать предварительное концентрирование
протеина представлена на рис. 12. белка в этих жидкостях. Необходимо избирать
При иммуноэлектрофоретическом титрова- наиболее щадящий режим концентрации, не
изменяющий структуры антигена. Наиболее
нии парапротеинемий другого класса — A, D, Е
(которые встречаются крайне редко) — и моно- удобным и приемлемым для любых лабораторий

300
можно считать метод испарения под вентилято- (HBsAt) производства ИЭМ им. Н. Ф. Гама-
ром без нагревания. Быстро и эффективно про- леи. 3. Барбитал-натриевый буфер рН 8,1—8,4:
ходит концентрация через полупроницаемую 8,14 г барбитал-натрия (мединал), 6,48 г аце-
мембрану (диализный целлофан) в среде высо- тата натрия, 90 мл 0,1 н. НС1, до 1 л дистиллиро-
комолекулярного полиэтиленгликоля. При нали- ванной воды. Перед использованием буфера
чии вакуум-насоса применим метод ультра- необходимо строго контролировать рН и при
фильтрации через миллипоровые фильтры или несоответствии указанным значениям (в зависи-
диализный целлофан. Исчисление степени кон- мости от отклонения) исправлять величину рН
центрации можно вести по кратности объемов 0,1 н. НС1 или 0,1 н. NaOH.
(до и после концентрации). Однако более пра- Х о д о п р е д е л е н и я . Готовят 1 % агар
вильно будет измерение белка в конечном объе- на барбитал-натриевом буферном растворе рН
ме, так как это дает возможность произвести 8,1—8,4. Если применяют порошкообразный
предварительные расчеты разведений антисыво- очищенный агар, то его растворяют в буферном
ротки в тест-системе. Последняя воспроизводит- растворе при постоянном помешивании, нагре-
ся для каждого типа исследуемого объекта. вая до 90 °С (не доводя до з а к и п а н и я ) . Гелизи-
Так, концентрированная моча исследуется в той рованный агар нагревают в стеклянной колбе на
же системе, что и сыворотка. Но для лаважной, водяной бане при тех же условиях. 15 мл гото-
цереброспинальной жидкости, околоплодных вого агара, охлажденного до 45 °С, наливают
вод и т. д. необходимо в предварительных опы- на подогретое тщательно обезжиренное стекло,
тах по раститровке антисыворотки выбрать наи- уложенное на горизонтальную поверхность. На-
более оптимальную концентрацию антител. Это крыв конической крышкой, дают застыть гелю.
достигается п р и использовании метода двойной Затем пробойником наносят 4 ряда лунок по
иммунодиффузии по Оухтерлони. вертикальному размеру стекла. Расстояние
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Иммуно- между л у н к а м и по вертикали в п а р н ы х ря-
электрофоретический анализ позволяет рано вы- дах составляет 8 мм, по горизонтали —
явить низкие концентрации парапротеина и точ- 8 мм. Расстояние между п а р н ы м и р я д а м и
но их титровать. Выявление парапротеина по- равно 15 мм.
зволяет правильно и своевременно поставить Количество лунок в вертикальном ряду опре-
диагноз больным и назначить правильную те- деляется числом сывороток, поступивших для
рапию. Титрование легких цепей парапротеинов исследования. Для стандартизации постановок
позволяет дифференцированно применять тера- удобно использовать трафарет, нанесенный на
пию при амилоидозе, нередко сопутствующем миллиметровую бумагу и имеющий размеры
парапротеинемиям. Динамическое наблюдение стекла. Накладывая стекло с агаром на трафа-
за концентрацией парапротеина — объективный рет, можно быстро и точно пробить лунки в
тест оценки эффективности применяемой стеро- агаре.
идной или цитостатической терапии. В первую и последнюю пару лунок к а п и л л я -
ром вровень с поверхностью агара вносят компо-
Л и т е р а т у р а . Иммунохимический ана-
ненты иммунодиагностикума для контроля ре-
лиз / Под ред. Л. В. Зильбера.— М.: Медицина,
ж и м а опыта. АГ иммунодиагностикума и контро-
1968 г.— 300 с.; Ваппаров И., Иомтов М., Са-
лируемые сыворотки вносят в лунки, располо-
вов С. и др. Диспротеинемия.— София, 1978;
женные на стороне катода. AT иммунодиагно-
Грабар П., Буртэн П. Иммуноэлектрофорети-
стикума вносят в лунки, расположенные на сто-
ческий анализ.— М., 1963.
роне анода. После заполнения лунок стекло по-
мещают в прибор для электрофореза. На два
противоположных края стекла со стороны анода
6.4.6. Поверхностный антиген и катода кладут куски фильтровальной бумаги,
гепатита В и антитела к нему сложенные вдвое и смоченные в ацетат-барби-
таловом буфере. Фильтровальная бумага должна
Метод встречного иммуноэлектроосмофореза. закрывать 0,5—1 см поверхности агара и плотно
П р и н ц и п . Метод основан на различной под- к нему прилегать.
вижности антигена и антител в гелевых носите- Свободный конец бумаги опускают в элект-
родный сосуд, в который налит буфер. После
лях под воздействием электрического поля. Дви-
жение антигена направлено к положительному включения прибора устанавливают н а п р я ж е н и е
120—160 В, а силу тока устанавливают 30 мА.
полюсу — к аноду, антител — к катоду. При
взаимодействии антигена и антител к нему по Через 1'/2—2 ч прибор отключают, бумажные
фронту встречного движения образуется верти- соединители убирают и учитывают результаты.
кальный преципитат. Вначале проверяют реакцию у контрольных лу-
нок. В связи с тем что антитела обладают боль-
П о с у д а и о б о р у д о в а н и е . 1 . При-
шей подвижностью, они проходят большее рас-
бор для электрофореза ПЭФ-3. 2. Стекла 9Х
Х 1 2 см (очищенные фотопластинки). 3. Про- стояние до взаимодействия с антигеном. По-
бойники для лунок с внутренним диаметром этому полоса п р и ц и п и т а ц и и расположена ближе
3 мм. 4. Водоструйный насос. к лунке с антигеном. Этим она отличается от
других неспецифических полос, которые могут
Р е а к т и в ы . 1. Агар (бактоагар «Дифко»,
США; «Серва», ФРГ, или дальневосточный образовываться при проведении реакции мето-
агар, очищенный по одному из способов, описан- дом встречного иммуноэлектроосмофореза, так
ных выше). 2. Иммунодиагностикум на антиген как в сыворотке человека может присутствовать
несколько преципитирующих систем.
вирусного гепатита В (HBsAg) и антител к нему

301
Рис. 13. Схема постановки метода двойной иммунодиффузии в геле для определения антигена
вирусного гепатита (HBsAg) и метода встречного иммуноэлектроосмофореза.
1 — схема стандартного ш т а м п а для пресечения контура лунок: радиус центральной лунки 8 мм, диаметр
периферических л у н о к — 3 мм; 2 — схема внесения контролируемой а н т и с ы в о р о т к и : ДП — донорская плазма,
А Т х — истощенная кроличья антисыворотка; 3 — АГ и AT — антиген и антитела эталонного и м м у н о д и а г н о -
с т и к у м а . АТх — к о н т р о л и р у е м а я антисыворотка с р а з н ы м титром AT; 4 — AT и АГ — компоненты эталонного
и м м у н о д и а г н о с т и к у м а , АТх, АГу, АТу, А Г х — компоненты контролируемого и м м у н о д и а г н о с т и к у м а серий
«х» и «у»; 5 — АГ и AT — компоненты и м м у н о д и а г н о с т и к у м а : ИС — исследуемая сыворотка, ИР — изотони-
ческий раствор н а т р и я хлорида; 6 — схема встречного иммуноэлектроосмофореза: ДТ и АГ — к о м п о н е н т ы
и м м у н о д и а г н о с т и к у м а , ИС|, ИС2, ИСз — исследуемые сыворотки; а,б,в,г,д — р а з л и ч н ы е типы п о л о ж и т е л ь н ы х
и о т р и ц а т е л ь н ы х р е а к ц и й на HBsAg.

Перед учетом результатов рекомендуется собствует дифференцированию гепатита В от ге-
патита А, алкогольного гепатита. Учитывая воз-
пластинку с агаром поместить на 1 ч в 10 %
раствор NaCl. можность носительства антигена, необходимо
провести исследование на HBs-антиген донор-
Положительной на присутствие HBs-анти-
гена считается та сыворотка, которая с AT им- ской крови. Изучение путей передачи привело
мунодиагностикума образует полосу преципита- многих передовых клиницистов к п о н и м а н и ю
ции, расположенную ближе к лунке с исследу- необходимости обследования на HBs-антиген
емой сывороткой и находящуюся на одной пря- всех пациентов стационаров, с тем чтобы во-
время исключить возможность «шприцевого»
мой с полосой преципитации контрольных лу-
нок (рис. 13). гепатита. HBsAg является причиной вспышек
При исследовании сывороток для обнаруже- гепатита в отделениях хронического гемодиа-
ния антител к HBs-антигену реакцию ставят по лиза. Клинически обосновано исследование HBs-
той же схеме: в лунки, расположенные на сто- антител в сыворотке. Наличие их при отсутствии
антигена указывает на возможность секвестри-
роне катода, вносят АГ иммунодиагностикума,
рования антигена в и м м у н н ы х комплексах или
в лунки, расположенные на стороне анода,—
контролируемые сыворотки. В верхнюю и ниж- фиксации в тканях. Обосновано определение
HB s Ag не только при установлении этиологи-
нюю пару лунок вносят компоненты иммуно-
диагностикума. Специфичность положительных ческой причины заболевания печени, но и при
результатов по выявлению антигена и антител системных васкулитах. Так, в 45—60 % случаев
в человеческих сыворотках, полученных методом узелкового периартериита реакция на HB,Ag
встречного иммуноэлектроосмофореза, следует положительна. Находят этот антиген и при
уточнять повторной постановкой в реакции пре- некоторых формах иммунокомплексных
ципитации в геле с иммунодиагностикумом на нефритов.
антиген и антитела вирусного гепатита В. Выявление этого антигена представляется
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Поверх- важным именно потому, что современные методы
ностный антиген гепатита В — HB s -Ag, назван- терапии позволяют элиминировать его и тем
самым удалить основную причину, вызывающую
ный после публикации работ Блайберга австра-
развитие цепи взаимообусловленных патологи-
л и й с к и м , является маркером именно этого вида
ческих и з м е н е н и й . HB s Ag может быть выявлен
гепатита, его этиологической причиной. Выяв-
ление его имеет диагностическое значение и спо- в тканях, в экссудатах.

302
Л и т е р а т у р а . Наставление п о примене- ния калибровочной кривой. Антиген вносят ав-
нию иммунодиагностикума на антиген вирусного томатической пипеткой (выпускается в СССР)
гепатита В (HBsAg) и антитела к нему (HB s At) или микропипеткой в количестве 10 мкл. Под-
сухого.— М., 1977; Руководство по количествен- готовленные таким образом пластины помещают
ному иммуноэлектрофорезу / Под ред. Н. Ак- на поверхности столика прибора для электро-
сельсен, И. Крелль.— М., 1977. фореза. Стекла с агарозой соединяют с элект-
родными кюветами агарозными пленками с ши-
риной, равной ширине стекла, и толщиной 3 мм.
6.4.7. Количественный анализ Можно применять и соединительные полоски из
антигенов фильтровальной бумаги. Во избежание подсы-
хания и деформации геля в месте соединения
Метод иммуноэлектрофореза в среде, содер- с б у м а ж н ы м и полосами последние перед соеди-
жащей антитела. П р и н ц и п м е т о д а . А н - нением их с пластинами смачивают в буферном
тиген, помещенный в среду агара с антисыворот- растворе. Электрофорез ведут при потенциале
кой, образует преципитат, который под дейст- 10 В/см в течение 2—10 ч в зависимости от ха-
вием электрического потенциала образует петлю рактеристик и количества антигена, взятого в
(ракетку), вытянутую по оси электрофореза. определенном отношении к используемой анти-
Метод практически совмещает в себе описанную сыворотке. Если этот метод применяется для
выше радиальную иммунодиффузию и электро- определения иммуноглобулинов в биологических
форез. Величина петли преципитата находится жидкостях с исходно низкой концентрацией ан-
в линейной зависимости от эквивалентной кон- тигена (цереброспинальная жидкость, промыв-
центрации антигена, связанных антител и гра- ные воды бронхоальвеолярной системы), обычно
диента потенциала. Если последняя величина достаточно 2 ч. Электрофорез предпочтительно
постоянна, то первая может отражать концент- проводить при внешней температуре 4 °С (в хо-
рацию внесенного в агар антигена. лодильнике или холодной комнате). Время про-
П о с у д а и о б о р у д о в а н и е . 1 . Стек- ведения процедуры лимитируется также высотой
образующихся при реакции пиков.
л я н н ы е пластины 8 X 1 2 см. 2. Пробойники для
лунок в агаре с внутренним диаметром 3 мм. После электрофореза гелевые пластины на
3. Водоструйный насос. 4. Прибор для электро- стеклах отмывают в 0,2 М растворе хлорида
фореза ПЭФ. 5. Измеритель. 6. Измерительная натрия в течение суток. Затем высушивают и
миллиметровая линейка. окрашивают, как это описано выше.
Р е а к т и в ы . 1. Агароза (в СССР выпуска- Пики максимальной м и г р а ц и и комплексов
ется заводом химреактивов в г. Олайне). 2. Бар- антиген—антитело измеряют миллиметровой л и -
биталовый буфер рН 7,4 (ионная сила 0,07) нейкой. Ошибка измерения не должна превы-
с 2 М лактата кальция. 3. Антисыворотки (к им- шать 0,2 мм при высоте пиков от 2 до 5 см.
муноглобулинам А, М, О, к легким цепям -л и К, Стандартную кривую строят на соотношении
величины пиков и концентраций белка в разве-
к aF-протеину, секреторному IgAS), выпускае-
дениях стандартов антигена обычным путем.
мые ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи в Москве, НИИ
Клиническое значение. Метод
вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова в
может быть рекомендован для определения низ-
Москве, ИЭМ в г. Горьком. 4. Краситель и от-
ких концентраций антигена в таких биологиче-
мывающая жидкость (прописи см. в разделе
ских жидкостях, как моча, цереброспинальная,
«Иммуноэлектрофоретический анализ»).
бронхоальвеолярная жидкость, слюна и т. д.
Х о д о п р е д е л е н и я . 1 % (по объему
Высокая чувствительность и воспроизводимость
или по массе) раствор агарозы на барбиталовом
метода дают основания для более широкого ис-
буфере растворяют при подогревании на кипя-
пользования его в клинико-иммунологическом
щей водяной бане, а затем охлаждают до 45 °С.
анализе.
Предварительно выбранное количество антисы-
воротки (титрование антисыворотки проводят Л и т е р а т у р а . Laboratory techniques i n
аналогично описанной процедуре в и м м у н о - Biochemistry and molecular biology/Ed by
электрофорезе) тщательно смешивают с раство- T. S. W o r k , E. W o r k , 1970, p. I l l : 534; Руковод-
ром агарозы и заливают между двумя стеклян- ство по количественному иммуноэлектрофорезу.
ными пластинами с помещенной между ними / Под ред. Н. Аксельсен, И. Крелль, Б. Бике.—
П-образной рамкой (см. выше). Заливка ага- М., 1977.
розы и формирование слоя происходит более
успешно, если форму и пипетку, которой зали-
6.4.8. Возможные источники
вают смесь агарозы с антисывороткой, предва-
рительно нагревают до 40—45 °С. Дают остыть ошибок и неспецифические реакции
форме при комнатной температуре, а затем осто- при использовании иммунодиффузионных
рожно с н и м а ю т верхнее стекло. По линии пер- методов
пендикулярной оси электрофореза параллельно
длинной стороне стекла наносят ряд лунок на Качественные и количественные результаты
расстоянии не менее 2 см между рядами. Центры иммунодиффузионных методов прежде всего за-
соседних лунок не должны быть ближе 8 мм. При висят от профессионального мастерства иссле-
таких условиях на стекло можно поместить дователя. Тем не менее ряд объективных факто-
24 лунки. В средние лунки вносят разведения ров, которые необходимо знать и учитывать
стандарта (требования к стандарту и его раз- при критическом анализе результатов, могут
ведениям см. выше), используемые для построе- вызывать определенные отклонения.

303
Все варианты методов указанной группы тигенных характеристик легких цепей парапро-
требуют использования тщательно сбалансиро- теина и нормального иммуноглобулина а н т и
ванной системы по отношению антигена и анти- сыворотки.
тел. Низкая концентрация антигенов вызывает При н а л и ч и и в исследуемом материале мо-
смещение преципитата к лунке с антигеном номерной формы можно наблюдать размытое
вплоть до полного слияния его с краем отверстия большое кольцо диффузии без четкого кольца
и невозможностью определения при двойной преципитации.
иммунодиффузии в геле. Аналогичная картина Необходимо учитывать воздействие физи-
ческих и медикаментозных факторов, которые
может наблюдаться при избытке антител (пре-
ципитат сливается с краем л у н к и , содержащей могут изменять диффузионные свойства и элект-
антитела). Число молекул антител, которое сое- рофоретическую подвижность. Так, рентгенов-
диняется с молекулами антигена, называют эк- ское или радиоактивное облучение, длительная
вивалентным количеством. Хейдельберг и Кен- терапия высокими дозами кортикостероидов мо-
далл впервые определили это количество на гут вызывать расщепление белков на субъеди-
основании опытов преципитации в пробирке как ницы с р а з л и ч н ы м и молекулярными размерами
количество антигена, которое присоединяется и массой, но с идентичными иммунологически-
к определенному количеству антител с образо- ми свойствами. Это приводит к появлению
ванием максимального количества преципитата. артефактов, которые могут быть непра-
Необходимо знать, что при использовании коли- вильно интерпретированы («ложные пара-
чественных методов иммуноэлектрофореза в протеины») .
ходе реакции все увеличивающееся число моле- Большое в н и м а н и е необходимо уделять зна-
кул антител присоединяется к молекулам анти- нию качеств среды, применяемой для иммуно-
генов, образуя преципитат, который уже не про- диффузии или иммуноэлектрофореза в соответ-
двигается в геле в ходе электрофореза. Коли- ствии с теми задачами, которые стоят перед ис-
чество антител, приводящее к преципитации в следователем. Плохая очистка геля может слу-
ходе иммуноэлектрофореза, меньше, чем экви- жить причиной электростатического взаимо-
валентное количество антител, установленное по действия антигенов с некоторыми ионизирован-
п р е ц и п и т а ц и и в пробирках. Следовательно, им- ными группами геля, антигены могут образовы-
мунные комплексы в преципитате должны быть вать преципитаты в плохо очищенном геле, ко-
относительно ненасыщены антителами. При торые могут быть п р и н я т ы за специфические.
дальнейшем ведении электрофореза уже обра- Исследователь должен творчески подходить к
зовавшиеся преципитаты остаются в геле и ста- оценке деталей исполнения метода. Так, при
новятся все отчетливее по мере того, как соот- изучении высокомолекулярных антигенов с боль-
ветствующее число молекул антител мигрирует ш и м размером молекулы, н а п р и м е р определение
к области преципитации из окружающего геля. высокополимерной ДНК в плазме методом встреч-
Таким образом, при подборе в каждом конкрет- ного иммуноэлектроосмофореза, правильнее
ном случае соотношения в системе антиген—ан- использовать агарозный гель с концентрацией
титело необходимо использовать условия (ха- его в буфере 0,7—0,8 %. Наоборот, применяя
рактеристики электрического поля, среда, время стандартный метод радиальной иммунодиффу-
п р е ц и п и т а ц и и ) , которые будут в дальнейшем зии для количественной оценки секреторного
п р и м е н е н ы в основном опыте. компонента IgAS, можно допустить применение
более плотных гелей, с которыми проще рабо-
Ложноотрицательные реакции могут наблю-
даться в системе с избытком антигена — обра- тать и к очистке которых предъявляются мень-
зование растворимых комплексов. При несба- шие требования.
лансированном отношении антиген—антитело Все иммунопреципитационные методы а н а -
возможно образование нескольких полос пре- лиза антигенов требуют тщательного подбора
ципитации или ложных «шпор», что затрудняет антисывороток. Налаживание промышленного
интерпретацию результатов в методе двойной производства гибридомных сывороток з н а ч и -
иммунодиффузии. тельно повысит специфичность реакции. Все
Необходимо учитывать молекулярную массу выпускаемые в настоящее время моноклоновые
и размер белковых субстратов, включаемых в и очищенные сыворотки требуют обязательного
реакцию, так как эти параметры оказывают зна- контроля специфичности (особенно это касается
люминесцирующих антисывороток к и м м у н н ы м
чительное влияние на скорость диффузии и
электрофоретической подвижности в гелях. Бел- глобулинам, к альфа-фетопротеину и др.). При
ки с молекулярной массой свыше 200 000 мед- работе с каждой партией антисывороток необ-
ленно диффундируют в агаре. Иммунный гло- ходимо определять концентрацию антител. Имеет
булин М, a2-макроглобулин, а 2 -липопротеин и значение вид животного, использованного в ка-
фибриноген обладают и более низкой электрофо- честве объекта и м м у н и з а ц и и (кролик, лошадь,
ретической подвижностью. коза, свинья и т.д.). Наиболее удобны для
Неправильная обработка сыворотки может практической работы в потоковых методах козьи
приводить к агрегации белков и образованию и кроличьи антисыворотки. Лошадиная антисы-
крупномолекулярных агрегатов, например агре- воротка может быть п р и ч и н о й удвоения полос
преципитации.
гированного IgG. Значительно меняется диффу-
При использовании этой антисыворотки
зия сыворотки, содержащей и м м у н н ы е комп-
часто наблюдается растворение уже сформиро-
лексы, особенно IgM с IgG. При исследовании
вавшегося преципитата как в избытке антигена,
парапротеинов могут наблюдаться двойные
кольца п р е ц и п и т а ц и и вследствие общности ан- так и антител (т. е. эта антисыворотка требует

304
очень тщательного подбора эквивалентных Такие преципитаты часто растворяются в 10 %
концентраций). В редких случаях может иметь растворе хлористого натрия в отличие от устой-
место преципитация н е и м м у н н о й природы. чивого к этой обработке иммунного преципитата.


6.5. А Н Т И Я Д Е Р Н Ы Е А Н Т И Т Е Л А
Иммунофлюоресцентный метод определения объемами изотонического раствора и четырьмя
антиядерных антител. П р и н ц и п м е т о д а . объемами ацетона. После отстаивания мате-
Тиоизоцианат флюоресцеина или производные риала надосадочную жидкость вместе с гомо-
родамина (чаще всего применяемые метки), генатом печени сливают, отделив его от квар-
конъюгированные с антителами, под действием цевого песка, а после дополнительного отстаи-
ультрафиолета светятся желто-зеленым или вания сливают надосадочную жидкость. Остав-
оранжево-красным светом, указывая на распо- шийся осадок гомогената заливают четырьмя
ложение антигена, с которым специфически свя- объемами ацетона и фильтруют через воронку
зались меченые антитела. Бюхнера с б у м а ж н ы м фильтром. Высушивание
Существуют два основных варианта метода порошка проводят в стерильных ч а ш к а х , при-
Кунса: прямой, когда метится непосредственно крытых фильтровальной бумагой, в течение 18 ч
у-глобулиновая фракция антисывороток (т. е. при 37 "С. Высушенный материал растирают в
антитела), и непрямой, в котором используется ступке, просеивают через мелкое сито и расфа-
промежуточная инкубация среза с немеченой совывают. Предпочтительнее использовать пе-
антисывороткой (или антителами, предположи- нициллиновые флаконы, которые после запол-
тельно находящимися в исследуемой сыворотке) нения порошком закупоривают резиновыми
и последующим проявлением образовавшегося пробками и заливают парафином. Порошок со-
комплекса антигаммаглобулиновой меченой сы- храняет способность устранять неспецифиче-
вороткой другого животного. скую люминесценцию в течение 3 лет.
Х о д о п р е д е л е н и я . Сыворотку крови
Непрямой метод более чувствителен и более
больного, получаемую обычным путем, раститро-
применим в условиях клинических исследований.
вывают забуференным изотоническим раствором
Однако он сопровождается повышением неспе-
хлорида натрия (1 ч 0,15 М фосфатного буфера
цифической адсорбции белков и поэтому требует
обязательной постановки контролей. рН 7,4 и 9 ч 0,87 % раствора хлорида натрия)
Антинуклеарный фактор (АНФ) определя- 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80... и т. д. Послед-
нее разведение сыворотки, при котором еще оп-
ется методом иммунофлюоресценции на крио-
ределяется четко выраженное свечение (не ме-
статных срезах печени крыс или мышей. Анти-
нее 2 + ), определяется как титр АНФ. Опыт
тела к различным антигенам клеточного ядра —
ДНК, нуклеогистону, рибосомам, нуклеолам, на- подсказывает необходимость разведения сыво-
ротки до 320—640, в редких случаях концентра-
ходящиеся в исследуемой сыворотке, вступают
в специфическое связывание с антигенами, ко- ция АНФ достигает 1 : 10240.
торое определяется меченой ФИТЦ-антиглобу- П р и г о т о в л е н и е срезов печени.
линовой сывороткой ( и м м у н н а я сыворотка, Печень извлекают из только что забитых крыс
или мышей, 1 тут же разрезают на блоки
конъюгированная с флюоресцеинизотиоциана-
10Х 10Х5 мм и помещают в термостат с жид-
том — ФИТЦ).
ким азотом на 1—2 мин. После этого блоки по-
П о с у д а и о б о р у д о в а н и е . 1 . Пред-
мещают на столик криостата, камера которого
метные и покровные стекла. 2. Чашки Петри.
охлаждена до —20 "С. Полученные срезы нано-
3. Центрифуга. 4. Люминесцентный микроскоп
сят кисточкой на тщательно вымытые обезжи-
(МЛ-2, МЛ-3, «Люмам»).
ренные предметные стекла по 3—4 среза на одно
Р е а к т и в ы . 1 . Антигаммаглобулиновая
стекло. Стекла со срезами могут храниться 1 —
сыворотка, меченная ФИТЦ. 2. Нефлюоресци-
2 мес в морозильной камере холодильника и ис-
рующее иммерсионное масло. 3. Фосфатный бу-
пользоваться по мере надобности.
фер рН 7,2—7,4 : 0,53 г однозамешенного фос-
фата калия, 0,95 г двузамещенного фосфата Предметные стекла со срезами печени (если
калия, 8,75 г хлорида натрия на 1 л дистиллиро- они извлечены из морозильника, необходимо
ванной воды. 4. Печеночный порошок (для спе- подождать, пока испарится конденсат, т. е. стек-
цифической адсорбции). У обескровленного жи- ло прогреется до комнатной температуры) по-
вотного извлекают печень и прополаскивают ее мещают в фосфатный буфер рН 7,5 на 8—10 мин.
в изотоническом растворе хлорида натрия, раз- Затем их извлекают и дают стечь буферу. На
резают на мелкие кусочки и растирают в Ф а Р˜ влажные срезы пастеровской пипеткой наслаи-
форовой ступке с кварцевым песком. Получен- вают (по капле) разведения сыворотки. Стекла
ную массу заливают двойным объемом 0,87 % с исследуемой сывороткой на срезах помещают
раствора хлорида натрия и добавляют 4 объема во влажную камеру (чашки Петри с кусочками
ацетона (по отношению к полученной смеси). смоченной ваты) при комнатной температуре
Смесь интенсивно взбалтывают 3—5 мин. Над- на 45 мин, после чего стекла со срезами промы-
осадочную жидкость сливают, а осадок промы-
вают изотоническим раствором хлорида натрия
до исчезновения гемоглобина в надосадочной
жидкости. Осадок снова разбавляют двумя Необходимо отбирать здоровых животных.
11 п / р В. В. Меньшикова 305
вают в течение 10 мин в фосфатном буфере. чения оценивают в плюсах (от 4+ до 2 + ) .
Излишки буфера на стекле вокруг срезов тща- По характеру свечения различных структурных
тельно промокают фильтровальной бумагой. На образований ядра выделяют 4 формы свечения,
влажные срезы наслаивают антисыворотку к которые отражают отличные друг от друга анти-
IgQ человека, меченную ФИТЦ и предвари- нуклеарные факторы. Дифференциация их
тельно истощенную печеночным порошком для имеет диагностическое значение.
исключения фонового свечения, которое связано Результаты непрямого метода иммунофлюо-
с взаимодействием нормальных печеночных ан- ресценции могут быть учтены при условии соб-
тител, находящихся, как правило, в небольших людения техники постановки реакции и выпол-
титрах в нормальных и патологических сыворот- нения контролей на специфичность свечения:
ках. 1) наслаивать на срезы сыворотку, истощен-
Люминесцирующая (меченная ФИТЦ) сы- ную антигеном — ДНК, нуклеопротеином или
воротка выпускается в ампулах в лиофилизиро- гистоном;
ванном виде. На этикетке ампулы обозначено 2) использовать сыворотку с заранее опре-
рабочее разведение препарата. Для употребле- деленными антителами другой специфичности.
ния сыворотку в ампуле разводят 0,5 мл забу- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Диагно-
ференного изотонического раствора хлорида стическую информативность имеют концентра-
натрия и затем адсорбируют на печеночном ция и тип антинуклеарного фактора. Низкие
порошке. На 1 мл сыворотки берут 80 мг по- титры АНФ часто определяются при разнообраз-
рошка. Смесь тщательно встряхивают. В течение ной патологии и у здоровых доноров. Высокие
часа при комнатной температуре периодически концентрации характерны для системной крас-
через 5—10 мин перемешивают, интенсивно ной волчанки (СКВ), хронического активного ге-
встряхивая. Затем центрифугируют 15 мин при патита (ХАГ), в ряде случаев при ревматоидном
9000 об/мин. Надосадочную жидкость — адсор- артрите с системными проявлениями (РА). При
бированную сыворотку — отсасывают. При тем- СКВ, как правило, выявляется диффузное све-
пературе хранения 4 °С сыворотка может быть чение ядер, при ХАГ — кольцевидное (или крае-
использована в течение 3—6 дней. вое), при РА — крапчатое. Последний тип све-
Инкубацию срезов с меченой антисывороткой чения встречается при исследовании сывороток
также проводят во влажной камере 45 мин при больных склеродермией. Сочетание высоких кон-
комнатной температуре. Затем срезы отмывают центраций АНФ с гомогенным (диффузным)
в фосфатном буфере (удаляют непрореагиро- свечением ядер гепатоцитов и низкими значе-
вавшие белки) в течение 10—15 мин и высуши- н и я м и гемолитической активности комплемента
вают на воздухе. характерно для СКВ. Нарастание титра АНФ
Микроскопирование готовых препаратов при динамическом исследовании сыворотки па-
производят при возбуждающем ультрафиолето- циента может служить р а н н и м признаком обост-
вом облучении с использованием входного свето- рения процесса (до появления клинических
фильтра УФС-3 и окулярного светофильтра симптомов) и диктовать необходимость повы-
ОС-3 в системе масляной иммерсии. Степень све- шения дозы стероидных гормонов.




6.6. И С С Л Е Д О В А Н И Е ФАКТОРОВ КЛЕТОЧНОГО И М М У Н И Т Е Т А
О с н о в н ы е н а п р а в л е н и я и мето- Значительно шире современные оценки фаго-
д и ч е с к и е п р и н ц и п ы . Учение о клеточ- цитоза в комплексном анализе генетически де-
ной кооперации в осуществлении иммунологи- терминированных дефектов иммунитета: распо-
ческой адаптации, иммунологического надзора знавание антигенов макрофагами и представ-
ление их Т-лимфоцитам.
за генетическим постоянством внутренней среды
Существенное значение в понимании роли
организма получило значительное развитие за
два десятилетия своего существования. Выде- клеточных реакций в формировании клини-
ческих синдромов приобретает все углубляюще-
ление тимусзависимой (Т) и тимуснезависимой
(В) клеточных систем в конце 60-х годов позво- еся изучение сывороточных факторов: лимфоки-
нов, монокинов, костномозгового стимулятора
лило изучить их функции и взаимодействие и
антителопродуцентов и др.
детализировать эффекторное звено в реализа-
ции иммунного ответа, определив субпопуляции
Т-лимфоцитов: супрессоры, хелперы, киллеры,
клетки антителозависимой цитотоксичности, от- 6.6.1. Т - л и м ф о ц и т ы
личающиеся друг от друга специфическими ре-
цепторами, по которым они и могут быть детер- Метод розеткообразования для определения
минированы в общем пуле лимфоцитов. Были Т- и В-лимфоцитов в периферической крови.
выявлены специфические различия В-клеток по П р и н ц и п . Поверхностные рецепторы, специ-
мембранным иммуноглобулинам, рецепторам к фичные для различных субпопуляций лимфо-
Fc-фрагменту иммуноглобулина G, к С 3 -компо- цитов, проявляются, связывая эритроциты, на-
ненту комплемента. Наконец, в последние годы тивные или нагруженные антителами к этим
(1981 —1983) обнаружены супрессорные функ- рецепторам. Эритроциты образуют с поверхно-
ции В-лимфоцитов. стью лимфоцита фигуру розетки. За розетку

306
к 1 мл сыворотки и инкубируют в течение 1 ч при
принимают лимфоцит, присоединивший 3—5
эритроцитов. В ряде случаев эритроциты плотно 37 °С, периодически встряхивая. Желательна
окутывают лимфоцит, образуя так называемую абсорбция сыворотки пулом лейкоцитов, учиты-
морулу. Интерпретация этого феномена крайне вая возможность наличия антилейкоцитарных
разноречива. Нередко он отражает методичес- антител. При использовании человеческой сыво-
кие неточности постановки. Феномен розетко- ротки необходимо учитывать влияние аутоцито-
образования может быть усилен путем обра- лимфотоксинов, проявляющих максимум актив-
ботки эритроцитов нейраминидазой. ности при 4 °С.
Определение Т-лимфоцитов методом спон- Перед использованием суспензии лимфоци-
танного розеткообразования с эритроцитами ба- тов проверяют их жизнеспособность. Равные
рана (Е-РОК). П р и н ц и п . Тимусзависимые объемы 0,1 % раствора водного эозина на среде
Т-лимфоциты имеют рецепторы для эритроцитов Хенкса или Рингера двойной концентрации без
барана, которые выступают, таким образом, спе- глюкозы и 0,1 % раствора трипанового синего
цифическим маркером для их распознавания на дистиллированной воде смешивают перед
употреблением и 1—2 капли добавляют к капле
(Е-РОК: E r y t h r o c y t e — розеткообразующие
клетки). сус,пензии клеток и часть смеси переносят в
камеру Горяева. Окрашенные (мертвые) клетки
Приборы и о б о р у д о в а н и е . 1.
просчитывают на 100 клеток в поле зрения. При
Центрифуга ЦЛК-1. 2. Холодильник (бытовой).
правильной обработке процент мертвых кле-
3. Термостат. 4. Микроскоп люминесцентный
ток не превышает 3.
(МЛ-2 или другие типы). 5. Камера Горяева.
Приготовление эритроцитов
6. Счетчик клеток. 7. Автоматические пипетки
б а р а н а . Используют эритроциты одного жи-
или микропипетки. 8. Пробирки силиконирован-
вотного или смесь, полученную от нескольких.
ные или пластиковые. 9. Штатив для пробирок.
Эритроциты можно хранить в течение 2 нед при
Р е а к т и в ы . 1. Среда 199, раствор Хенкса.
4 °С в растворе Олсвера (глюкоза — 2,05 г,
2. Гепарин (готовят раствор из расчета
цитрат натрия — 0,8 г, хлорид натрия — 0,42 г,
25 ЕД/мл крови). 3. Фосфатный буфер рН 7,4.
дистиллированная вода—100 мл), рН этого
4. 0,01 % раствор акридинового оранжевого.
раствора устанавливают равным 6,1 с помощью
5. 0,1 % раствор эозина, 0,1 % раствор трипа-
10 % раствора лимонной кислоты. Перед упо-
нового синего на дистиллированной воде. 6. Ги-
треблением эритроциты барана 3—4 раза отмы-
пак (изопак, верографин, уротраст). 7. Фиколл-
вают фосфатным буфером и готовят 0,5 % (по
400 (полисахарид с молекулярной массой
объему) взвесь клеток.
400000). 8. Эритроциты барана.
Х о д о п р е д е л е н и я . 10 мл крови из П о д г о т о в к а и у ч е т р е а к ц и и ро-
локтевой вены вносят в пластиковую пробирку з е т к о о б р а з о в а н и я . Реакцию проводят
с раствором гепарина (256 ЕД/мл) и осторожно по методу, описанному Jondal и соавт. в 1972 г.
перемешивают. Гепаринизированную кровь раз- В пластиковые пробирки (от 2 до 5) вносят
водят фосфатным буфером рН 7,4 в соотношении 0,1 мл взвеси лимфоцитов и добавляют равный
1 : 2; 9 мл смеси осторожно наслаивают на раст- объем 0,5 % взвеси эритроцитов барана. Соотно-
вор фиколл-гипак плотности 1,077 г/мл (12 ча- шение эритроциты: лимфоциты не должно пре-
стей 9 % фиколла и 5 частей 33,9 % гипака плот- вышать 50 : 1. Инкубируют смесь в термостате
ности 1,077 г/мл). Пробирки центрифугируют 37 °С в течение 10 мин. Затем пробы центри-
40 мин при 1500 об/мин. фугируют 5 мин при 1000 об/мин (для ЦЛК-1)
В связи с тем что могут использоваться раз- и оставляют на ночь в холодильнике при темпе-
ные системы центрифуг, необходимо применять ратуре 4 °С. Подсчет клеток мы рекомендуем
такие режимы центрифугирования, чтобы сила проводить в камере Горяева. Существующий
разделения в интерфазе составила 400 g. Вели- метод фиксации суспензии глютаровым альде-
чину центробежного ускорения G вычисляют по гидом с последующим приготовлением мазков
формуле: G = l , l - n 2 - R - 1 0 - 5 (n — число оборо- и просчетом розеток в окрашенных препаратах
тов в минуту, R — радиус от центра оси центри- позволяет накапливать стекла и анализировать
фуги до границы соприкосновения смеси фи- результаты реакций в другой, свободной от по-
колл-гипака с разделяемой суспензией в см). становки или менее загруженный, день. Однако
После центрифугирования слой лимфоцитов глутаровый альдегид изменяет поверхность
осторожно пипеткой извлекают из интерфазы эритроцитов барана, вызывает неспецифическое
и дважды отмывают буферным раствором. Кон- прилипание их к клеткам крови человека. Не
центрацию клеток доводят до 2—4 млн. в 1 мл исключено, что глутаровый альдегид десеквест-
в среде 199 ', содержащей 10 % раствор телячь- рирует скрытые антигены в мембране бараньих
ей сыворотки или сыворотки IV (АВ) группы эритроцитов, к которым имеются рецепторы у
крови человека. При использовании последней лимфоцитов человека. Более перспективен в
необходима инактивация при 56 °С в течение этом плане ацетальдегид, фиксация которым
30 мин и абсорбция эритроцитами. Для этого эритроцитов стандартизирует определение
0,5 мл осадка отмытых эритроцитов добавляют Т-лимфоцитов и делает возможным обоснован-
ное сопоставление результатов, полученных раз-
ными лабораториями.
1
Можно использовать любой буферный Для просчета клеток в камере Горяева оса-
раствор рН + 7,0—7,2 без ионов Са + + (наличие док клеток в извлеченных из холодильника про-
ионов Са + способствует конгломерации кле- бирках осторожно ресуспендируют пастеровской
ток, их коагуляции). пипеткой (несколько раз медленно набирают и
11 307
Эритроциты человека: необходимо исполь-
выпускают клеточную взвесь) и добавляют
0,02 мл 0,01 % раствора в фосфатном буфере зовать эритроциты 0 ( 1 ) резусотрицателынж
акридинового оранжевого. Этот краситель дает группы крови. Следует брать, по возможности,
ярко-зеленую люминесценцию при возбуждении кровь нескольких постоянных доноров. Приго-
ультрафиолетом. Через 2—3 мин заполняют ка- товление эритроцитов аналогично описанному
методу для эритроцитов барана. К взвеси лим-
меру Горяева и определяют процент Е-РОК пу-
тем подсчета 300 лимфоцитов в люминесцент- фоцитов в тех же соотношениях добавляют одно-
ном микроскопе. Это значительно облегчает и временно эритроциты барана и эритроциты че-
ускоряет процедуру счета ярко светящихся лим- ловека. Просчитывают лимфоциты, связавшие
фоцитов, окруженных розоватыми эритроци- эритроциты и барана, и человека. Реакцию с
аутологичными эритроцитами проводят так же,
тами.
как с аллогенными.
В день взятия крови на Т-лимфоциты необ-
ходимо проводить общий анализ крови, который
дает возможность высчитывать абсолютные зна-
6.6.2. В-лимфоциты
чения Т-клеток.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы Т-клеток,
определенные нами у 150 здоровых доноров: Определение В-клеток методом розеткообра-
54,3±0,98 %; 979,8±16,8 кл/мкл. зования с эритроцитами барана в системе ЕАС.
Определение активных Т-лимфоцитов, обра- П р и н ц и п . Тимуснезависимые В-лимфоциты
зующих розетки с эритроцитами барана (ЕА- имеют на своей мембране специфические детер-
РОК). Все подготовительные операции выпол- м и н а н т ы , позволяющие дифференцировать их от
няют так, как это описано для Е-РОК, за исклю- Т-лимфоцитов. Таким детерминантом является
чением сыворотки, которую при определении ЕА- поверхностный (мембранный) иммуноглобулин
РОК не добавляют в инкубационную среду, и класса М. Число лимфоцитов, несущих иммуно-
длительной холодовой инкубации. После термо- глобулин A, G, Е или D, крайне незначительно
статирования 10 м и н п р и 37 °С и последующего (А — 1—5 %, D и Е — 2—4 %), рецепторы для
центрифугирования при 1000 об/мин (для Fc-фрагмента иммуноглобулина G для третьего
ЦЛК-1) в течение 5 м и н проводили подсчет компонента комплемента (Сз). Выделяют и дру-
Т-активных л и м ф о ц и т о в способом, о п и с а н н ы м гие специфические рецепторы, в частности для
вируса Эпштейна—Барр, плазмоклеточный ан-
выше для общих Т-клеток.
С о д е р ж а н и е Т-активных лимфоцитов у тиген, антиген 1а. Однако последние не нашли
еще отражения в клинической практике. Чаще
150 здоровых доноров составило: 34,6 ±1,92 %,
применяется метод выявления В-клеток по
840+123 кл/мл.
их способности образовывать розетки с ба-
Определение теофиллинчувствительности Т-
р а н ь и м и эритроцитами, н а г р у ж е н н ы м и антите-
клеток. П р и н ц и п . Препараты, повышающие
л а м и в среде комплемента. Такие эритроциты
уровень внутриклеточного цАМФ (теофиллин,
аденозин), ингибируют реакцию спонтанного ро- м а р к и р у ю т и Fc, и Сз рецепторы В-лимфоцитов.
зеткообразования между зрелыми Т-лимфоци- Приборы и реактивы те же, что и для метода
тами и эритроцитами барана. определения Т-лимфоцитов. Аналогично готовят
Ход определения. Используемые и суспензию лимфоцитов.
реактивы и оборудование аналогичны для опи- Антисыворотку, содержащую
а н т и т е л а к э р и т р о ц и т а м , готовят пу-
санного выше метода определения Т-активных
лимфоцитов. Исключение составляет теофиллин тем и м м у н и з а ц и и кролика эритроцитами барана
(химически чистое соединение), 0,3 М раствор или быка. Кролику в краевую вену уха вводят
которого на дистиллированной воде, подогретой 3—5 мл 50 % суспензии эритроцитов. На 4—6-й
до 60 °С, готовят каждый раз при постановке день у него берут кровь и получают сыворотку,
метода. Охлажденный до комнатной темпера- которая в этот период на высоте иммунного от-
туры теофиллин добавляют в инкубационную вета преимущественно содержит антитела клас-
среду (без добавления сыворотки), термоста- са М. Наилучший эффект получают при работе
с гамма-глобулиновой фракцией сыворотки, ко-
тируют, центрифугируют и просчитывают клетки
так же, как и Т-активные. Выявляют 2 субпопу- торую получают высаливанием в насыщенном
ляции: теофиллинчувствительные Т-клетки, т.е. растворе а м м и а к а или риванола. Антисыворотку
инактивируют и определяют ее гемолитический
лимфоциты, утратившие способность к розетко-
и агглютинационный титр.
образованию под в л и я н и е м обработки теофил-
лином, и теофиллинустойчивые Т-клетки. Можно использовать готовую и широко до-
У здоровых доноров соотношение теофиллин- ступную кроличью гемолитическую сыворотку.
чувствительных и устойчивых Т-клеток состав- К о м п л е м е н т . Источником комплемента
ляет 1 : 3. служат свежие сыворотки мышей. Беспородных
Выявление Т-лимфоцитов, образующих ро- мышей декапитируют, кровь сливают в про-
зетки с аллогенными и аутологичными эритро- бирку, получают сыворотку, которую затем сор-
цитами. П р и н ц и п . Существуют субпопу- бируют пулом человеческих эритроцитов и опре-
ляции лимфоцитов, образующих розетки с алло- деляют активность комплемента в гемолитиче-
генными и аутологичными эритроцитами. ской системе.
Приборы, о б о р у д о в а н и е и реак- Сенсибилизация эритроцитов.
т и в ы о п и с а н ы выше. Суспензию лимфо- Смешивают равные объемы 1 % взвеси бараньих
цитов выделяют уже описанным выше эритроцитов (предпочтительнее эритроциты бы-
методом. ка) и антисыворотки к виду эритроцитов, ис-

308
пользуемых в реакции (или кроличьей гемоли- сорную функцию (есть исследования, характе-
тической сыворотки) в субагглютинирующем ризующие их и как к л е т к и - п о м о щ н и к и ) . Теофил-
разведении. Смесь инкубируют 40 мин при 37 °С, линчувствительные клетки представлены субпо-
осторожно встряхивая каждые 10 мин. После пуляцией супрессоров, а теофиллинустойчи-
термостатирования эритроциты трижды отмы- вые — клетками-помощниками. Т-клетки, обра-
вают фосфатным буфером до 10 мин при зующие розетки с аутоэритроцитами, как пола-
1500 об/мин. Супернатант отбрасывают, а к гают, несут киллерную ф у н к ц и ю и играют ос-
осадку добавляют первоначальный объем фос- новную роль в м е х а н и з м а х аутоагрессии.
фатного буфера и равный объем абсорбирован- Изучение динамики эффекторных звеньев
ной м ы ш и н о й сыворотки, содержащей компле- клеточного иммунитета отражает активность
мент в разведении 1 : 10. Смесь помещают в тер- процесса, помогает правильно подобрать тера-
мостат при 37 °С на 30 мин. Вновь эритроциты пию, уточнить механизмы медикаментозной
чувствительности. Но, как правило, эти методы
трижды отмывают. При о т м ы в а н и и их центри-
фугируют осторожно при 1000 об/мин 5 мин, используют для научных исследований.
чтобы не вызвать а г г л ю т и н а ц и и эритроцитов. Го-
товят 0,5 % суспензию эритроцитов и просмат-
6.6.3. Реакция миграции лейкоцитов
ривают под микроскопом. При н а л и ч и и агглюти-
н а ц и и эритроцитов суспензия непригодна. Го-
П р и н ц и п . Подвижность лейкоцитов пе-
товые эритроциты, нагруженные антителами и
р и ф е р и ч е с к о й крови, их м и г р а ц и я к очагам
комплементом (ЕАС), можно х р а н и т ь в холо-
тканевой деструкции, хемотаксис к ауто- и ге-
дильнике (4 °С) 4—5 дней.
О п р е д е л е н и е ЕАС л и м ф о ц и т о в . тероантигенам, перераспределение между лим-
К 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляют 0,1 мл фоидными о р г а н а м и при стрессорно-адаптивных
сенсибилизированных эритроцитов. Оптималь- реакциях являются составляющей компонентой
ное соотношение эритроцитов к лимфоцитам общей системы реактивности, способности к со-
равно 20 : 1. Смесь инкубируют 45 мин при 37 °С, х р а н е н и ю постоянства внутренней среды.
после чего пробирки помещают в лед. Подсчет Сенсибилизированные к определенному ан-
В-клеток проводят описанным выше способом тигену лимфоциты резко снижают скорость под-
(см. «Определение Т-клеток»). вижности в среде, в которую вносят этот анти-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . И з реко- ген. Реакция осуществляется при непосредствен-
мендаций ВОЗ и нашего более чем 10-летнего ном взаимодействии антигенспецифических ре-
опыта определения Т- и В-клеток при различных цепторов с антигеном, а также через воздействие
заболеваниях ясно, что информативность этого фактора, ингибирующего м и г р а ц и ю клеток, вы-
вида иммунологического а н а л и з а ограничена. деляющегося при контакте со специфическим
Это исследование абсолютно показано при пер- антигеном. Этот феномен позволяет продемон-
в и ч н ы х иммунодефицитных состояниях не толь- стрировать органоспецифическую клеточно-
ко для их типирования, но и для дифференци- опосредованную гиперчувствительность.
рования от вторичных иммунодефицитных со- Реакция торможения миграции агармигра-
стояний. Диагностическая значимость подсчета ционным тестом. П р и б о р ы и о б о р у д о -
Т- и В-лимфоцитов выявлена при идентифика- в а н и е . 1. Пластиковые или стеклянные ч а ш к и
ции лимфопролиферативных расстройств. У ч и - д и а м е т р о м 50 мм. 2. Пробойники для агара
тывая то обстоятельство, что лимфоциты при диаметром 2,5 мм. 3. Проекционный аппарат
различных стрессорных воздействиях под в л и я - «Микрофот» типа 5ПО-1.
н и е м эндогенных гормонов некоторых лекарст- Р е а к т и в ы . 1 . Агар-агар (способ приго-
венных препаратов мигрируют из периферической товления и очистки см. выше). 2. Трис-хлорид-
крови в лимфоток, лимфоидные о р г а н ы , рыхлую н ы й буфер рН 7,3. 3. Среда 199. 4. Сыворотка
соединительную ткань, широкое применение ис- крупного рогатого скота. 5. Гепарин. 6. Анти-
следований Т- и В-клеток крови в клинической биотики (для консервации), нетоксичные для
п р а к т и к е малообоснованно. Диагностическую клеток.
ценность несут исследования этих лимфоцитов Х о д р е а к ц и и . 3 % агар-агар н а изото-
в синовиальной жидкости при ревматоидном ническом растворе натрия хлорида, забуферен-
артрите, в моче при в е р и ф и к а ц и и определенных ном трис-хлоридным буфером рН 7,3, охлажден-
форм поражения почек. Очевидна необходи- ном до 50 °С, добавляют к 10 мл смеси: 9 мл
мость изучения реакции Т-клеток на различные среды 199,1 мл сыворотки крупного рогатого
медикаментозные препараты, используемые в скота, 3000 ЕД м о н о м и ц и н а (смесь предвари-
настоящее время клиникой в качестве иммуно- тельно прогревают до 37 °С). Полученный гель
модуляторов, для объективизации их назначе- разливают в чашки (если используются стек-
ния в каждом конкретном случае. Выявление лянные, то их необходимо силиконировать),
значительного снижения Т-клеток может способ- установленные строго горизонтально в коли-
ствовать утверждению в диагнозе амилоидоза. честве, необходимом для создания слоя толщи-
Можно ожидать, что изучение субпопуляций ной 2 мм. В затвердевшем геле пробивают лунки
Т-лимфоцитов, их соотношения друг с другом и (2,5 мм) в количестве, обусловленном опытом.
в общем пуле лимфоцитов будет более инфор- Концентрацию антигена, которую необходимо
мативно в оценке ряда патологических состоя- внести в смесь, высчитывают опытным путем
н и й и эффективности выбранной терапии. (по дозе, вызывающей н а и м е н ь ш и й разброс в
Т-активная субпопуляция представляет со- повторных постановках) для каждого антигена
и серии опытов.
бой преимущественно клетки, несущие супрес-

309
В ы д е л е н и е л е й к о ц и т е в . В пробир- вают экспериментально и определяют в мкг/мл
по концентрации белка. На каждую концентра-
ку помещают 10 мл гепаринизированной крови
цию антигена и контроль используют по 2 ка-
обследуемого (25 ЕД гепарина на 1 мл крови).
пилляра и соответственно получают 4 зоны м и -
В течение 1 ч пробирку выдерживают в термо-
грации. Измерение зон миграции, исчисление их
стате 37 °С под углом 45°. Через 50 мин про-
площади проводят р а з л и ч н ы м и способами. Наи-
бирки переводят в вертикальное положение и
более распространен метод проектирования
выдерживают еще 10 мин. После отстаивания
чашек (камер) с мигрирующими лейкоцитами,
плазму осторожно отсасывают и переносят в
образующими облачко над капилляром, с ис-
центрифужную пробирку. Центрифугируют 5 мин
пользованием фотопроектора на миллиметровую
при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость уда-
бумагу или фотопленку. Проекцию зоны мигра-
ляют. Примесь эритроцитов в клеточном осадке
ции обводят карандашом и высчитывают пла-
лизируют в гипотоническом растворе хлорида
ниметром или (при использовании рентгенов-
натрия, для чего к клеточному осадку добав-
ской пленки) вырезают и взвешивают. Индекс
ляют 5 мл 0,35 % раствора и осторожно пасте-
миграции (И) определяют по формуле:
ровской пипеткой ресуспендируют клетки, не
допуская образования пены, в течение 30—45 с.
После экспозиции к суспензии клеток немедлен-
но добавляют 0,6 мл 5 % раствора хлорида нат-
рия и тщательно перемешивают. В результате
раствор становится изотоничным. Полученную
взвесь лейкоцитов трижды отмывают средой Приготовление и очистка антигенов доста-
199 или фосфатным буфером рН 7,4. точно полно отражены в ряде руководств (см.
Контрольные и опытные исследования про- рекомендованную литературу).
водят в 4 параллельных лунках, внося в каждую Клиническое значение. Выявле-
из них по 5 мкл ресуспендированной лейковзвеси ние сенсибилизированных к определенному ан-
(1,5 млн. клеток). Через 20 ч инкубации чашек тигену лимфоцитов говорит об участии этого
в термостате при 37 °С их заливают 10 % раст- антигена в развитии специфической гиперчувст-
вором формалина (в целях фиксации клеток). вительности и в ряде случаев может быть ис-
Через 4 ч слой агара осторожно удалают, чашки пользовано в диагностике опухолей, гломеруло-
промывают и высушивают. Результаты учиты- нефрита, дифференциальной диагностике неспе-
вают путем проектирования полей миграции на цифических миокардитов и кардиопатий.
бумагу с помощью аппарата «Микрофот». Ин-
Л и т е р а т у р а . Петров Р. В. Иммуноло-
декс м и г р а ц и и (И) определяют по расчету соот-
гия.— М.: Медицина, 1982; Руководство по им-
ношения величин площадей миграции в опыте
мунологии / Под ред. О. Е. Вязова, III X. Ход-
и контроле по формуле:
жаева.— М.: Медицина, 1973; Лимфоциты. Вы-
/72 J2
Да U0
,,
деление, фракционирование и характеристика
/ Под ред. Д. Натвига, П. Перлмана, X. Виг-
зеля.— М.: Медицина, 1980.
где До — средний диаметр 4 зон миграции в
опыте; Д1 — средний диаметр 4 зон миграции
в контроле; dl — средний диаметр 4 централь-
6.6.4. Фагоцитарная активность
ных лунок в опыте; dl — средний диаметр 4
нейтрофилов периферической крови
центральных лунок в контроле.
Реакция торможения миграции лейкоцитов
в прямом капиллярном тесте. Выделение лей- П р и н ц и п . Полиморфноядерные лейко-
коцитов проводят аналогично описанному выше. циты, моноциты периферической крови способны
Выделенные лейкоциты ресуспендируют в 0,1 мл связывать на своей поверхности, поглощать и
среды 299 или фосфатного буфера. Этой кле- переваривать микробную тест-культуру.
точной взвесью заполняют стеклянные капил- Обычно используют стафилококк штамма
ляры с внутренним диаметром 0,7 мм и длиной 209. Однако он практически не подвергается
12 см (капилляры необходимо точно калибро- внутриклеточному перевариванию и исключает
вать, так как от этого зависит стандартизация прямое изучение этой функции фагоцитоза.
объемов клеточной взвеси). С одного конца ка- Мы рекомендуем использовать штамм 9198.
пилляр запаивают и центрифугируют при П о с у д а и о б о р у д о в а н и е . (.Хими-
1000 об/мин в течение 5 мин. Концы капилляров, ческие пробирки. 2. Предметные стекла. 3. Шли-
содержащие клетки, нарезают кусочками по 5— фовальное предметное стекло. 4. Пипетки мер-
6 мм и погружают в стеклянные камеры, запол- ные. 5. Микроскоп. 6. Центрифуга.
ненные средой 199, закрепляя их в центре с по- Р е а к т и в ы . 1. Метанол. 2. Красители:
мощью вазелина, предварительно нанесенного азур II, эозин. 3. Глицерин. 4. Среда 199.
на дно камеры. Камеру герметически закрывают 5. Смесь донорских сывороток (2—3) A B ( I V )
(притирают с вазелином) покровным стеклом группы. 6. Изотонический раствор хлорида нат-
и помещают в термостат при 37 °С на 20 ч в рия. 7. Набор стандартов для определения кон-
строго горизонтальном положении. Оба конца центрации микробных тел по мутности. 8. Су-
капилляра открыты (камеры готовят из стеклян- точная культура Staphilococcus epidermidis
ных колец 2 0 X 1 0 X 2 мм, фиксированных на шт. 9198.
предметных стеклах смесью воск-парафин). Х о д о п р е д е л е н и я . В стерильную про-
Концентрацию вносимого антигена рассчиты- бирку с заранее внесенным раствором 0,6 мл ге-

310
парина (G. Richter), разведенного 1 : 10, вносят под микроскопом в иммерсионной системе (счи-
10 мл крови из кубитальной вены. Кровь тща- тают не менее 200 клеток) и производят расчет
тельно перемешивают и центрифугируют 10 мин показателей фагоцитоза.
при 1000 об/мин. Плазму вместе со слоем лейко- 1. Фагоцитарный индекс (ФИ) — процент
цитов осторожно отсасывают и помещают в клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их
чистую центрифужную пробирку, добавляя 5— числа.
6 мл среды 199. Лейкоциты отмывают центри- 2. Фагоцитарное число (ФЧ) — среднее
фугированием 10 мин при 1000 об/мин. Надоса- число бактерий, находящихся внутриклеточно
дочную жидкость удаляют, а находящиеся в (частное от деления общего числа поглощен-
осадке лейкоциты ресуспендируют в среде 199 ных бактерий на число клеток, вступивших в
дважды, каждый раз повторяя процедуру «Мяг- фагоцитоз).
кого» центрифугирования. После последнего 3. Оба показателя рассчитывают на мазках,
центрифугирования пипеткой отсасывают над- сделанных после 30- и 90-минутной (т. е. в общей
осадочную жидкость и часть клеточной взвеси, сложности 120-минутной) инкубации, иными
оставив в центрифужной пробирке 0,2 мл словами, речь идет о ФИЗО и ФИ120, соответст-
(10Х106 кл/мл) клеточной взвеси в среде 199. венно ФЧЗО и ФЧ120.
С косого агара с суточной культурой стафило- 4. Коэффициент фагоцитарного числа:
кокка стерильным изотоническим раствором нат-
ФЧЗО
рия хлорида смывают колонии микробов. Ис-
ФЧ120 '
пользуя стандарт оптической мутности, разводят
микробную взвесь до концентрации 1 млрд.
5. Индекс бактерицидности нейтрофилов:
микробных клеток в 1 мл; 0,3 мл этой взвеси
вносят в пробирку, содержащую 0,2 мл лейко-
цитов в среде 199, и добавляют 0,15 мл пула
свежих донорских сывороток A B ( I V ) группы
где Чу — число убитых внутри фагоцитов микро-
(для опсонизации). Осторожным ротированием
бов; Чп — общее число поглощенных фагоци-
перемешивают компоненты и термостатируют
тами микробов.
30 мин при 37 °С. По истечении указанного вре-
6. Опсонический индекс поглощения:
мени в пробирку добавляют 5 мл прогретого до
37 °С изотонического раствора натрия хлорида,
встряхивают и центрифугируют 10 мин при
1500 об/мин. По окончании центрифугирования
надосадочную жидкость удаляют и делают мазки Нормальные величины: ФИЗО
из лейкоцитарной взвеси, остатки которой вновь 94,18+1,55%; ФИ120 92,00 + 2,52%; ФЧЗО
помещают в термостат при 37 °С для продолже- 11,29 + 1,00%; ФЧ120 9,81+0,96%; КФЧ
ния инкубации еще в течение 90 мин. Затем мазки 1,16 + 0,04 %; ИБН 66,3 + 2,58 %.
приготавливают повторно из осадка двухчасовой К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Изучение
инкубации. показателей фагоцитоза имеет значение в комп-
лексном анализе диагностики иммунодефицит-
Мазки готовят как обычно, на тщательно
вымытых обезжиренных предметных стеклах. ных состояний: часто рецидивирующие гнойные
воспалительные процессы, длительно не зажи-
Каплю лейкоцитарной взвеси помещают неда-
леко от края стекла и шлифованным предметным вающие раны, склонность к послеоперационным
стеклом, поставив его под углом 45° к поверх- осложнениям. Помогает в диагностике вторичных
ности впереди капли и подождав, пока капля иммунодефицитных состояний, вызванных ле-
равномерно распределится вдоль его ребра, карственной терапией. В связи с тем что фаго-
легким быстрым движением проводят вперед, циты участвуют в э л и м и н а ц и и иммунных комп-
не отрывая от предметного стекла раньше, чем лексов и активность фагоцитоза тесно связана
иссякнет вся капля. с активностью компонентов комплемента, а имен-
Правильно сделанный мазок имеет равно- но Сз, концентрацией IgG антител, наличием
мерно матовый оттенок, не достигает краев стек- других опсонирующих факторов, исследование
ла и заканчивается остроконечными язычками. фагоцитоза играет роль в диагностике, оценке
Приготовленные мазки сушат на воздухе, активности и эффективности терапии при ревма-
затем фиксируют 10 мин в абсолютном метило- тических болезнях, коллагенозах.
вом спирте и красят по Романовскому—Гимзе Наиболее информативным для оценки фаго-
азур-эозином. цитарной активности следует считать индекс
Состав готового красителя: азур II — 3 г, поглощения, т. е. фагоцитарное число, коэффи-
водорастворимый желтый эозин — 0,8 г, мети- циент фагоцитарного числа, которые отражают
ловый спирт — 250 мл и глицерин — 250 мл. завершенность фагоцитоза и индекс бактери-
Для окраски мазков берут 2 капли основного цидности — способность фагоцита переваривать
раствора красителя на 1 мл дистиллированной захваченный микроб. Особое значение в выявле-
воды. нии п р и ч и н изменений фагоцитарной активности
Можно готовить краску непосредственно пе- имеет определение опсонического индекса погло-
ред окрашиванием мазков из азура II, эозина щения, так как он характеризует наличие сыво-
и дистиллированной воды в соотношении 3 : 2 : 5 . роточных факторов, сопутствующих миокарди-
На один мазок наслаивают 3 мл раствора кра- там, ревматизму, ревматоидному артриту и др.,
сителя. Длительность окраски 45—50 мин. способных изменить активность иммунокомпе-
После о к р а ш и в а н и я мазки просматривают гентных и ф а г о ц и т и р у ю щ и х клеток.
Раздел 7
МЕТОДЫ К Л И Н И Ч Е С К О Й М И К Р О Б И О Л О Г И И




7. 1. О Б Щ И Е С В Е Д Е Н И Я
Микробиологические исследования при гной- в н а ч а л е озноба, при повышении температу-
но-воспалительных заболеваниях проводят с ры и т. п.
целью их диагностики, изучения этиологической 4. Соблюдать строжайшую асептику во из-
структуры, определения чувствительности воз- бежание загрязнения пробы микрофлорой окру-
будителей к антибактериальным препаратам. жающей среды.
Результаты микробиологического исследования 5. Материал для выделения аэробов и фа-
способствуют выбору наиболее эффективного культативных анаэробов брать стерильными
препарата для антибактериальной терапии, ватными тампонами (отделяемое из раны, мазки
своевременному проведению мероприятий для со слизистых оболочек, из глаза, носа, зева, цер-
профилактики внутрибольничных инфекций. викального канала, влагалища, анального от-
Возбудителями гнойно-воспалительных за- верстия), шприцем (кровь, гной, экссудаты),
болеваний (ГВЗ) наиболее часто являются непосредственно в стерильную посуду (моча,
условно-патогенные м и к р о о р г а н и з м ы (УПМ), мокрота, фекалии) (подробно см. соответствую-
входящие в состав естественной микрофлоры че- щие разделы).
ловека или попадающие извне. УПМ вызывают Материал для выделения строгих анаэробов
заболевания преимущественно у людей с пони- получают из патологического очага путем пунк-
женной иммунологической реактивностью, этио- ции шприцем, из которого предварительно уда-
логическая структура их непостоянна, часто лен воздух; при исследовании кусочков ткани их
встречаются ассоциации микроорганизмов. берут из глубины очага. При необходимости
Микробиологические исследования при за- использовать тампоны их нужно сразу после
болеваниях, вызванных УПМ, направлены на взятия материала погружать в транспортную
выделение всех микроорганизмов, находящихся среду. '
в патологическом материале, что существенно 6. Количество материала должно быть доста-
отличает их от аналогичных исследований при точным для проведения исследования, и для его
заболеваниях, вызванных истинно п а т о г е н н ы м и повторения в случаях необходимости.
м и к р о о р г а н и з м а м и , когда проводится поиск 7. Транспортировку нативного клинического
определенного возбудителя. образца в лабораторию следует производить в
Для получения адекватных результатов максимально короткие сроки — это определяет
анализа при ГВЗ особенно важно соблюдать ряд эффективность микробиологического исследо-
требований при взятии материала для исследо- вания. При длительном хранении материала
в а н и я , его т р а н с п о р т и р о в к и в лабораторию, про- происходит гибель наиболее требовательных к
ведения анализа и оценки его результатов. питательным веществам видов микробов, на-
чинают размножаться менее требовательные и
быстро растущие виды, что приводит к наруше-
7.1.1. Сбор и транспортировка проб нию количественного соотношения видов и дез-
ориентирует врача-микробиолога при интерпре-
При взятии материала для проведения мик- тации полученных результатов. Если материал
робиологического исследования необходимо соб- нельзя немедленно транспортировать в лабора-
людать ряд правил. торию, хранить его следует в холодильнике или
1. Брать материал до начала антибакте- использовать транспортные среды.
риальной т е р а п и и или через определенный про- Клинические образцы для культивирования
межуток времени после введения препарата, не- строгих анаэробов следует транспортировать в
обходимый для его выведения из организма лабораторию, максимально защищая их от воз-
(практически через 8—10 ч после введения боль- действия кислорода воздуха. Используют спе-
шинство антибиотиков уже выводится из орга- циальные флаконы, заполненные газом, не со-
низма). держащим кислорода. Уколом иглы через рези-
2. Брать материал непосредственно из очага новую крышку, плотно завальцованную, во фла-
инфекции или исследовать соответствующее от- кон вносят исследуемый материал. Материал
деляемое (гной из фистулы, мочу, желчь и п р . ) .
3. Брать материал во время наибольшего со-
держания в нем возбудителей заболевания: на-
пример, кровь для выделения гемокультуры См. с. 313.

312
можно транспортировать п р я м о в шприце, 8. К клиническому образцу, направляемому
на кончик которого надета стерильная в лабораторию, прилагают сопроводительный
пробка. документ, содержащий основные сведения, необ-
Транспортировку материала осуществляют ходимые для проведения микробиологического
также в транспортных средах ( н а п р и м е р , в смеси исследования (характер материала, фамилия,
лизированной крови донора 10 %, глицерина имя и отчество больного, название учреждения
или отделения, номер истории болезни, предпо-
10 %, изотонического раствора хлорида натрия
лагаемый диагноз заболевания, предшествую-
80%).
Материал для микробиологического иссле- щая а н т и м и к р о б н а я терапия, дата и время взя-
дования транспортируют в специальных биксах, тия материала, подпись врача, направляющего
пеналах и т. п. материал на а н а л и з ) .


7.2. П Р О В Е Д Е Н И Е М И К Р О Б И О Л О Г И Ч Е С К О Г О И С С Л Е Д О В А Н И Я

7.2.1. Микроскопическое тельных средах. Специальный прием в виде
исследование мазка штрихового последовательного посева на чашку,
разделенную на 3 части, обеспечивает такое рас-
Микроскопию мазка, окрашенного по Граму средоточение микробов, что из одной клетки в
или другими красителями, проводят при иссле- процессе ее роста и размножения формируется
довании мокроты, гноя, отделяемого из ран, сли- отдельная колония. Посевы культивируют при
зистых оболочек (мазок из зева, носа, глаза, 37 °С, учитывая требовательность бактерий к
цервикального канала и пр.) и некоторых других кислороду, наличию СО2 или анаэробных усло-
клинических образцов. Это позволяет ориенти- вий.
ровочно судить о характере микрофлоры, ее ко- Выявляют некоторые особенности изменения
личественном содержании и соотношении раз- цвета среды, ее просветления в процессе роста
ных видов микроорганизмов в патологическом культур. Многие группы микробов образуют ха-
материале. Иногда микроскопия помогает вы- рактерные формы колонии, выделяют пигменты,
явить микроорганизмы, плохо растущие на которые окрашивают колонии или среду вокруг
обычных питательных средах. На основании них; колонии изучают визуально, отмечая фор-
данных микроскопии проводят выбор набора му, величину, характер края, поверхностей, кон-
питательных сред для выделения микробов, систенцию. Из каждой колонии делают мазки,
обнаруженных в мазке. окрашивают по Граму и микроскопируют в све-
товом микроскопе с иммерсией при увеличении
в 700—900 раз. Оценивают однородность клеток,
7.2.2. Культивирование микроорганизмов форму и размер, наличие спор или других вклю-
чений, капсулы, расположение клеток (одиноч-
Посев исследуемого материала на питатель- ное, парное, гроздья, цепочки), отношение к ок-
ные среды производят с целью выделения чистых раске по Граму, интенсивность и равномерность
культур микроорганизмов, определения их так- распределения краски в клетке.
сономического положения, чувствительности к Колонии отсевают на плотные, жидкие, полу-
антибактериальным препаратам. Используют жидкие питательные среды, оптимальные для
питательные среды, позволяющие выделить культивирования определенного вида микробов.
наибольшее количество видов микроорганизмов: Выделенные чистые культуры подвергают даль-
оптимальными являются питательные среды, со- нейшему изучению в диагностических тестах,
держащие кровь животного или человека, а так- основанных на морфологических, ферментатив-
же сахарный бульон, среды для анаэробов. ных, биологических свойствах и антигенных осо-
Одновременно производят посев на дифферен- бенностях, характеризующих представителей
циально-диагностические и селективные среды соответствующего семейства, рода, вида, ва-
для выделения определенных групп микроорга- рианта.
низмов, изучения свойств культур. Посевы инку-
бируют при 35—37 °С 18—24 ч или при других
7.2.3. Дифференциация и идентификация
режимах, учитывают требовательность культи-
бактерий — возбудителей
вируемых микроорганизмов к СЬ, ССЬ. Для
гнойно-воспалительных заболеваний
культивирования строгих анаэробов используют
анаэростаты.
Количественную обсемененность материала Идентификация — это комплекс бактерио-
микрофлорой устанавливают по числу колоние- скопических и бактериологических методов изу-
образующих единиц (КОЕ) в 1 мл или 1 мг испы- чения бактерий, позволяющий определить их си-
туемого образца. стематическое положение в соответствии с со-
Важным этапом бактериологической диагно- временным кодом и номенклатурой микроорга-
стики является получение каждого микроба в чи- низмов.
стой культуре для дальнейшего изучения. Выде- Для подтверждения этиологической з н а ч и -
ление чистых культур бактерий в значительной мости выведенных микробов при заболевании
степени определяется правильностью распреде- определение рода и вида, к которому они отно-
ления посевного материала на плотных пита- сятся, является обязательным и должно быть
313
отражено в названии в виде биноминального следуемых жидкостей и тканей или контамини-
наименования, например Klebsiella pneumoniae, ровать их из окружающей среды. Поэтому для
Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli. правильной интерпретации результатов иссле-
Дальнейшее подразделение на био-, серо-, дования необходимо знать состав естественной
фаго-, колициноварианты позволяет маркиро- микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях,
вать выделенные штаммы, что помогает в оценке когда исследуемый материал в норме стерилен,
их этиологической роли, определении идентично- как, например, кровь, ликвор, экссудаты, все вы-
сти культур, выделенных из разных источников, деленные из него микробы могут считаться воз-
при проведении эпидемиологического обследо- будителями заболевания. В тех случаях, когда
вания в лечебных учреждениях. исследуемый материал имеет собственную мик-
рофлору, как, например, фекалии, мокрота и пр.,
нужно учитывать изменения ее качественного
7.2.4. Определение чувствительности и количественного состава, появление несвойст-
микроорганизмов к антимикробным венных данному биотопу видов микроорганиз-
препаратам мов, количественную обсемененность материала.
Так, например, при микробиологическом иссле-
довании мочи степень бактериурии (число мик-
Чувствительность к антимикробным препа- 5
робных клеток в 1 мл мочи), равная и выше 10 ,
ратам изучают у культур микроорганизмов,
свидетельствует об инфекции мочевых путей. Бо-
имеющих этиологическое значение. Определение
лее низкая степень бактериурии встречается
антибиограмм помогает лечащему врачу пра-
у здоровых людей и является следствием загряз-
вильно выбрать препарат для лечения больного.
нения мочи естественной микрофлорой мочевых
путей.
Установить этиологическую роль условно-
7.2.5. Серологические
патогенной микрофлоры помогают также нара-
методы исследования
стание количества и повторность выделения мик-
робов одного вида от больного в процессе забо-
Применяют для диагностического подтверж-
левания. Существенную помощь оказывают изу-
дения бактериальных инфекций в случаях невоз-
чение патогенных свойств выделенных культур,
можности выделения возбудителя заболевания
принадлежность их к определенным био-, серо-,
или установления его этиологической роли. На-
фаговариантам.
растание титра антител в сыворотке больных не
При интерпретации данных микробиологиче-
менее чем в 3—4 раза подтверждает диагноз за-
ского анализа следует учитывать клинику забо-
болевания.
левания, антибактериальную терапию, предше-
ствующую исследованию. Стерильность посева
или скудность роста в изучаемых пробах может
7.2.6. Оценка результатов
быть следствием антибактериальной терапии,
исследования
так же как изменение микробного пейзажа в
жидкостях и тканях организма, имеющих собст-
венную микрофлору. Особое внимание при оцен-
Принадлежность УПМ к естественной микро-
ке результатов анализа следует обращать на
флоре организма человека создает ряд трудно-
правильное взятие материала для исследования
стей при оценке этиологической роли. УПМ мо-
и быстроту его транспортировки в лабораторию.
гут представлять нормальную микрофлору ис-



7.3. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

наиболее частыми возбудителями сепсиса яв-
7.3.1. Кровь
ляются Staph. aureus. Streptococcus группы D,
Str. viridans, Str. pneumoniae. Среди грамотри-
Микробиологическое исследование крови
производят при заболеваниях, связанных с про- цательных преобладают Е. coli, Klebs. pneumo-
никновением микроорганизмов в ток крови. В niae, Ps. aeruginosa, Bacteroides f r a g i l i s . Из гри-
бов чаще других встречается C a n d i d a albicans.
норме кровь человека стерильна. В ток крови
микробы попадают в результате осложнения при Взятие к р о в и для исследова-
ряде заболеваний, при переливании крови и раз- н и я . Кровь для посева следует брать до начала
личных манипуляциях, когда развиваются сеп- антибактериальной терапии или через опреде-
сис, бактериемия, бактериальный шок. Исследо- ленный промежуток времени (8—10 ч) после
вание крови на содержание микроорганизмов введения лекарственного препарата, необходи-
следует проводить у больных с длительной неяс- мый для его выведения из организма. Если по-
ной лихорадкой, особенно у людей с пониженной сев крови производят во время антибактериаль-
иммунологической реактивностью. ной терапии, рекомендуется добавлять в пита-
Э т и о л о г и я . Септицемия и бактериемия тельные среды вещества, нейтрализующие дей-
ствие лекарственных препаратов. Так, при пени-
могут быть вызваны практически всеми микро-
организмами — патогенными и условно-пато- циллинотерапии с этой целью можно использо-
генными. Среди грамположительных бактерий вать пенициллиназу, при применении цефало-
314
чественное содержание (выделение единичных
споринов — цефалоспориназу, тетрацикли-
клеток чаще свидетельствует о контаминации),
нов —ионы магния, являющиеся антагонистами
наличие монокультуры или ассоциации (ассо-
тетрациклина.
циации чаще выделяются при загрязнении посе-
Кровь от больного для посева следует брать
ва, однако у больных со сниженной иммунологи-
в начале озноба при подъеме температуры.
ческой реактивностью возможна смешанная ин-
Кровь для посева берут из вены, строго соб-
фекция), повторность выделения одной и той же
людая правила асептики. Для этого кожу на ме-
культуры от больного и идентичность гемокуль-
сте венопункции тщательно обрабатывают спир-
том и йодом повторно. Шприцем, стерилизован- туры с культурами, выделенными из другого
материала от этого же больного.
ным в автоклаве, набирают 10—15 мл крови
(2—3 мл у маленьких детей), которую либо не- При окончательном заключении микробиолог
должен сопоставить данные микробиологическо-
посредственно у постели больного засевают в пи-
го исследования с клиникой заболевания и ре-
тательную среду, либо помещают в стерильную
зультатами других анализов.
посуду, содержащую вещества, препятствующие
Если через 10 дней после посева крови роста
свертыванию крови (0,3 % раствор цитрата нат-
микробов на питательных средах не обнаружено,
рия, 0,1 % оксалата натрия, 1 мл гепарина
анализ можно считать отрицательным.
и др.). Материал быстро транспортируют в лабо-
раторию, где производят дальнейшее исследова- Среды для культивирования
ние. Хранить кровь в холодильнике можно не а н а э р о б о в . 1. Плотная питательная среда
более 1—2 ч, при более длительном хранении типа КАБ: 1 г. твин 80, 2 г Na 2 HPO 4 , 1 г раство-
возможен лизис бактерий. римого крахмала, 1 г гидрокарбоната натрия
растворяют при подогревании в 60 мл дрожжево-
П р о в е д е н и е и с с л е д о в а н и я . Про-
го аутолизата. Раствор фильтруют, добавляют к
изводят посев 5—10 мл крови на 50—100 мл
жидкой питательной среды — 1 % сахарный 940 мл растопленного мясо-пептонного агара,
хорошо перемешивают и автоклавируют в тече-
бульон, «двухфазную» среду, а также жидкие и
ние 20 мин при 0,5 атм. После фильтрации при-
полужидкие среды для культивирования анаэро-
бавляют 250 мг 1-цистеина гидрохлорида, 0,4 мл
бов '. При подозрении на брюшной тиф или дру-
тиогликолевой кислоты и 6 г глюкозы; устанав-
гие инфекции применяют специальные питатель-
ливают рН 7,0—7,2, разливают в пробирки по
ные среды [Биргер М. И., 1982]. Для количест-
10 мл, стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. Эту осно-
венного определения массивности обсеменения
ву хранят в условиях холодильника. Перед ис-
крови делают посев нескольких капель крови из
пользованием среду регенерируют 20 мин в кипя-
шприца на поверхность ч а ш к и Петри с 5 % кро-
щей водяной бане, быстро охлаждают до 50 °С,
вяным агаром. Посевы инкубируют в термостате
прибавляют 0,1 мл раствора гемина (50 мг геми-
в течение 10 дней. Просмотр посевов производят
на растворяют в 1 мл 1 н. NaOH, добавляют
ежедневно. При наличии роста на питательных
100 мл дистиллированной воды, автоклавируют
средах делают высевы на чашки с 5 % кровяным
при 1 атм 15 м и н ) ; 1 мл лизированной двукрат-
агаром, которые инкубируют в аэробных и анаэ-
ным замораживанием и оттаиванием цитратной
робных условиях. Из колоний, выросших на
крови донора перемешивают, выливают в чашку
чашках с кровяным агаром, выделяют чистую
Петри, после застывания подсушивают 10—
культуру, идентифицируют ее и определяют чув-
15 мин. Используют для посева или помещают
ствительность к антибиотикам. Посевы крови на
для х р а н е н и я в анаэробные условия при комнат-
«двухфазной» среде просматривают, наклоняя
флакон и таким образом увлажняя поверхность ной температуре. Для придания среде селектив-
скошенного агара бульоном с кровью. При этом ных свойств перед разливом в ч а ш к и прибав-
исключается необходимость в высевах на плот- ляют один из следующих антибиотиков:
ные среды и снижается возможность загрязне- 75 мкг/мл неомицина или канамицина, 50 мкг/мл
ния посевов. Во избежание высыхания питатель- гентамицина, 40 мкг/мл налидиксовой кислоты
ных сред пробки флакона парафинируют. В та- (невиграмон, неграм).
ком виде флаконы можно выдерживать в течение 2. Жидкая питательная среда. Ее основной
месяца, что бывает необходимо при выделении состав и способ приготовления те же, что и для
медленно растущих микроорганизмов. плотной среды. Однако вместо мясо-пептонного
Однократный посев крови не всегда приводит агара используют мясо-пептонный бульон (со-
к выделению гемокультуры. Более информатив- держание агар-агара в среде 0,6 г/л). Приготов-
ным является трехкратный посев крови с интер- ленную основу разливают по 100—150 мл во
валами между посевами в сутки. У леченых флаконы и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин, хра-
больных кровь для посева следует брать 5— нят в холодильнике. Перед использованием сре-
ду регенерируют 20 м и н на кипящей водяной
6 раз.
Оценка результатов микробиоло- бане, быстро охлаждают до 50 °С, прибавляют
гического исследования крови зависит от вида 1 мл раствора гемина (на 100 мл среды), 10—
выделенных микроорганизмов и массивности ро- 15 % по объему стерильной сыворотки крупного
ста. Выделение патогенных видов с несомнен- рогатого скота (можно использовать лошади-
ностью свидетельствует об их этиологической ную сыворотку, стерильную асцитическую жид-
роли в заболевании. В том случае, когда из кро- кость), разливают по 5 мл в пробирки и хранят
ви выделены УПМ, следует учитывать их коли- в анаэробных условиях при комнатной темпера-
туре, выдержав предварительно микроанаэро-
статы со средой при 37 °С в течение 2 сут для
1
См. с. 315. контроля стерильности среды. Используется так-
315
вых путей, поэтому его желательно избегать.
Катетеризацию производят только в случаях
необходимости — если больной неспособен мо-
читься или для разграничения воспалительного
процесса в почках и мочевом пузыре. С этой
целью мочевой пузырь опорожняют и вводят
в него 50 мл раствора, содержащего 40 мг неоми-
цина и 20 мг полимиксина. Через 10 мин берут
пробы мочи для исследования. При локализации
процесса в мочевом пузыре моча остается сте-
рильной, при инфекции в почках отмечается
бактериурия.
Мочу можно получить от больного путем над-
лобковой п у н к ц и и мочевого пузыря. Этот метод
взятия мочи дает наиболее достоверные резуль-
таты исследования, однако имеется опасность
и н ф и ц и р о в а н и я больного.
Микробиологическое исследование мочи на-
до проводить как можно быстрее после ее полу-
чения от больного, с тем чтобы избежать раз-
множения находящихся в ней микроорганизмов.
Рис. 14. Схема посева мочи секторным методом. Размножение микробов в моче до начала анали-
за приводит к ложным результатам при количе-
А, I, I I , I I I — последовательность посева мочи по
секторам. ственном определении бактериурии и может дез-
ориентировать в отношении возбудителя заболе-
вания. Если немедленное исследование мочи
невозможно, то ее следует хранить в холодиль-
нике при 4 °С не более суток.
же стандартная «Питательная среда для контро-
ля стерильности сухая», к которой добавляют П р о в е д е н и е и с с л е д о в а н и я . Оп-
ределяют степень бактериурии — количество
растворимый к р а х м а л , твин 80, гемин в коли-
колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл мочи
чествах и способом, как указано выше. Готовые
методом секторных посевов мочи. Платиновой
к употреблению среды х р а н я т также в анаэроб-
петлей диаметром 2 мм (вместимостью 0,005 мл)
ных условиях.
3. Желточная анаэробная среда. К 500 мл ре- производят посев мочи — 3—4 штриха на
генерированной плотной среды для анаэробов сектор ч а ш к и Петри с простым агаром (рис. 14).
(основа), охлажденной до 60 °С, с соблюдением После этого петлю прожигают и производят 4
правил асептики прибавляют желток одного штриховых посева из сектора А в сектор I и ана-
я й ц а (поверхность должна быть деконтаминиро- логичным образом из сектора I в сектор II и из
вана погружением яйца на 1 ч в 96 % спирт; сектора II в сектор I I I (каждый раз прожигая
яйцо не должно содержать антибиотиков), пере- петлю). Чашки инкубируют при 37 °С 18—24 ч,
мешивают, разливают в ч а ш к и Петри. После за- после чего подсчитывают число колоний, вырос-
стывания подсушивают, х р а н я т в анаэробных ших в р а з н ы х секторах. Определение степени
условиях. бактериурии по количеству выделенных колоний
производят согласно табл. 47.
Колонии, выросшие на плотной питательной
7.3.2. Моча среде, отсевают в пробирки со скошенным ага-
ром, выделенную чистую культуру идентифици-
руют и определяют ее чувствительность к анти-
Микробиологическое исследование мочи про-
бактериальным препаратам.
изводят при воспалительных заболеваниях моче-
У с к о р е н н ы е методы определе-
испускательных путей.
Э т и о л о г и я . Наиболее частыми возбуди- н и я с т е п е н и б а к т е р и у р и и основаны
телями воспалительных процессов мочевого на определении продуктов метаболизма, обра-
зующихся при размножении микроорганизмов
тракта являются грамотрицательные бактерии:
Е. coli, Proteus, Providencia, Enterobacter, Kleb- в моче. Они дают менее точные результаты, чем
siella, Ps. aeruginosa, Serratia, Streptococcus метод секторных посевов, и используются преи-
группы Д. Возбудителями могут быть также мущественно при массовых профилактических
обследованиях больших контингентов людей или
Staph. a u r e u s , Staph. e p i d e r m i d i s , C a n d i d a a l b i -
для экспресс-диагностики. При положительном
cans, Mycoplasma и другие микроорганизмы.
Взятие мочи для исследова- результате, полученном ускоренными методами,
н и я . Микробиологическое исследование мочи необходимо дальнейшее исследование с по-
нужно проводить до начала антибактериальной мощью более точного бактериологического ме-
тода.
терапии.
После тщательного туалета н а р у ж н ы х поло- Нитратный тест. Нитриты, являющиеся про-
вых органов в стерильную посуду собирают дуктами метаболизма представителей семейства
среднюю порцию свободно выпущенной мочи энтеробактерий, могут быть обнаружены в моче
в количестве 3—5 мл. Взятие мочи с помощью с помощью реактива Грисса. Готовят два рас-
катетера связано с риском и н ф и ц и р о в а н и я моче- твора: а) 1,25 г сульфаниловой кислоты раство-
316
степень бактериурии, вид выделенных культур,
Т а б л и ц а 47. Определение степени бактериурии
методом секторных посевов их чувствительность к лекарственным веще-
ствам.
Количество колоний О ц е н к а р е з у л ь т а т о в . Основная за-
Количество
в секторах дача при и н т е р п р е т а ц и и полученных д а н н ы х
Сектор А бактерий в
заключается в доказательстве этиологической
1 мл мочи
I 11 111 роли микроорганизмов, выделенных из мочи.
Учитывают комплекс тестов: степень бактериу-
1-6 Менее 1000 рии, вид выделенных культур, повторность их
— — — 3000
8—20 выделения в процессе заболевания, присутствие
— — —
20—30 5000 в моче монокультуры или ассоциации микро-
— — —
30—60 10000
организмов.
— — —
70—80 50 000
Степень бактериурии позволяет дифференци-
— —
100—150 100000
5—10
ровать инфекционный процесс в мочевых путях
Не сосчи-
— —
тывается 20—30 500 000 от контаминации мочи нормальной микро-
— —
40—60 1 000 000
То же флорой.

100—140 5 000 000
10—20
» » Оценку производят на основании следующих

Не сосчи- 30—40 10000000
» » критериев.
тывается
1. Степень бактериурии, не п р е в ы ш а ю щ а я
60—80 100000000
Еди-
» » То же 3
10 КОЕ/мл мочи, свидетельствует об отсутст-
нич-
вии воспалительного процесса и обычно являет-
ные
коло- ся результатом к о н т а м и н а ц и и мочи.
нии 2. Степень бактериурии, равная 104 КОЕ/мл,
расценивается как сомнительный результат.
Исследование следует повторить.
3. Степень бактериурии, р а в н а я и выше
5
10 КОЕ/мл мочи, указывает на н а л и ч и е воспа-
ряют в 500 мл 30 % уксусной кислоты; б) 2,5 г
лительного процесса.
а-нафтиламина растворяют в 500 мл 30 % уксус-
Изменение степени бактериурии в процессе
ной кислоты. Оба раствора хранят в защищен-
заболевания может быть использовано для
ном от света месте.
контроля за течением процесса и эффектив-
Непосредственно перед исследованием оба
ностью терапии: уменьшение степени бактериу-
раствора смешивают в равных количествах, 1 мл
рии свидетельствует о благоприятном течении
смеси добавляют к 1 мл мочи. Появление крас-
заболевания и эффективности использованных
ного окрашивания свидетельствует о присутст-
вии в 1 мл мочи не менее 105 микробных клеток. лекарственных препаратов.
В некоторых случаях у больных, получающих
ТТХ-тест. Трифенилтетразолия хлорид (ТТХ)
антибактериальную терапию, при плохом оттоке
под действием продуктов жизнедеятельности

<<

стр. 17
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>