<<

стр. 7
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

1973, с. 22.
тывать эритроциты. Центрифугируют при
1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную 3.4.4. Исследование
жидкость удаляют, а из осадка готовят мазки
волчаночных клеток (LE-клетки)
(помещают каплю осадка пастеровской пипет-
кой на предметное стекло и готовят мазок). Волчаночные клетки служат морфологи-
Мазки высушивают на воздухе, фиксируют и ок- ческим проявлением иммунологического фено-
рашивают гематологическими красителями мена, характерного для системной красной вол-
(см. 3.3.2). чанки. Они образуются в результате фагоцитоза
Метод с гепарином может быть использован нейтрофильными лейкоцитами (реже моноцита-
при необходимости удаления тромбоцитов. ми) ядер клеток, содержащих деполимеризован-
П р и н ц и п . При центрифугировании плаз- ную ДНК. Предполагают, что фагоцитируемая
субстанция представляет собой и м м у н н ы й ком-
мы, разведенной холодным изотоническим раст-
плекс, состоящий из волчаночного фактора (ан-
вором хлорида натрия, тромбоциты оседают
тинуклеарного фактора), остатков ядра лейко-
в осадок, а лейкоциты остаются во взвешенном
цитов и комплемента. Морфологически LE-клет-
состоянии.
Р е а к т и в ы . 1. Гепарин (500 ЕД/мл). ки характеризуются наличием в цитоплазме
нейтрофильных лейкоцитов округлого бесструк-
2. 0,85 % раствор хлорида натрия.
О б о р у д о в а н и е то же, что и в методе турного образования, напоминающего лизиро-
ванное ядро светло-фиолетового цвета, занима-
с трилоном Б.
Х о д о п р е д е л е н и я . В пробирку с 1 мл ющего центральную часть клетки с оттесненным
к периферии ядром.
гепарина добавляют 4 мл крови. Отстаивают
40—45 мин. С помощью пастеровской пипетки Реже такое же образование выявляют в мо-
ноцитах, иногда оно расположено внеклеточно,
отбирают плазму в центрифужную пробирку,
стараясь не захватить эритроциты. Центрифу- может образовывать фигуры «розеток» (образо-
вание, окруженное нейтрофилами). В отличие
гируют при 1500 об/мин в течение 10 мин. Над-
от LE-клеток обнаруживают нейтрофилы с фа-
осадочную жидкость удаляют, а к осадку добав-
гоцитированной субстанцией не гомогенного ха-
ляют 5 мл холодного 0,85 % раствора хлорида
натрия. Центрифугируют при 500—800 об/мин рактера, а с сохраненной структурой хроматина.
Такие клетки относят к клеткам Тарта и рас-
в течение 10—15 мин (если в осадке имеется
примесь эритроцитов, то повторно центрифуги- сматривают их как предстадию LE-клеток.
руют с холодным раствором хлорида н а т р и я ) . Специфичными для системной красной волчанки
считают т и п и ч н ы е LE-клетки.
Из осадка готовят мазки и окрашивают их
гематологическими красителями. Для исследования LE-феномена предложены
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . При иссле- многочисленные методы, в основе которых лежит
инкубация клеток больного в собственной плаз-
довании лейкоконцентрата у 50 здоровых людей
Р. А. Поспелова получила следующую лейко- ме (метод, предложенный Hargraves, Zimmer,
грамму: нейтрофилы палочкоядерные 1,2± 1948). Рекомендуется дополнительное механи-

126
3.4.5. Цитохимические исследования
ческое встряхивание для усиления травматиза-
ции клеток и увеличение количества LE-клеток. лейкоцитов
Метод Харгревеса — Циммера. Прин-
ц и п . Механическое повреждение лейкоцитов Цитохимические исследования проводят в
для усиления LE-феномена. мазках крови, лейкоконцентрата; они основаны
Р е а к т и в ы . 1. Метиловый спирт. 2. Краска на использовании специфических х и м и ч е с к и х
Романовского — Гимзы или другой гематологи- реакций для определения в клетках различных
ческий краситель. веществ. Эти исследования позволяют изучать
С п е ц и а л ь н о е оборудование. 1. локализацию и ориентировочно оценивать коли-
Микроскоп. 2. Металлическое сито. 3. Фарфоро- чество определяемых веществ в р а з л и ч н ы х кле-
вый пестик. 4. Центрифуга. точных элементах. Цитохимические исследова-
Х о д о п р е д е л е н и я . В пробирку н а б и - н и я относительно несложны, дают возможность
рают 10 мл венозной крови и оставляют для исследовать различные виды лейкоцитов, но ус-
свертывания на 2 ч. Свернувшуюся кровь в ы л и - тупают в точности количественному анализу,
вают на металлическое сито, поставленное на проводимому с помощью биохимических мето-
ч а ш к у Петри, и пестиком протирают сгусток дов.
в ч а ш к у . Содержимое ч а ш к и Петри выливают При цитохимическом исследовании чаще
в центрифужную пробирку и центрифугируют пользуются полуколичественной оценкой резуль-
при 2000 о б / м и н в течение 5 м и н . Надосадочную татов, используя п р и н ц и п Астальди, основан-
жидкость отсасывают и удаляют, а из осадка ный на выявлении различной степени интенсив-
(верхнего слоя) готовят мазки. Высохшие мазки ности специфической окраски. В зависимости
фиксируют и окрашивают гематологическим от нее исследуемые элементы делят на 4 г р у п п ы :
красителем. с отрицательной реакцией ( — ) , слабоположи-
Метод Цинкхама — Конли в модификации тельной ( + ), положительной (+ +) и резко
Е. Н. Новоселовой. П р и н ц и п . Механическое положительной ( + + + ). Для количественного
воздействие на кровь, облегчающее образование выражения результатов подсчитывают 100 кле-
LE-феномена. ток определенного вида, дифференцируя их по
Р е а к т и в ы . 1. Оксалат натрия. 2. Метило- указанному п р и н ц и п у , затем число клеток с оди-
вый спирт. 3. Краска Романовского — Гимзы наковой интенсивностью окраски умножают на
или азур-эозин. соответствующее данной г р у п п е число плюсов,
С п е ц и а л ь н о е оборудование. 1. сумма этих произведений составляет условные
Микроскоп. 2. Центрифуга. 3. Стеклянные бу- единицы. Например, при исследовании активно-
синки диаметром 3—4 мм. сти щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100
Х о д и с с л е д о в а н и я . В пробирку поме- просмотренных клеток в 60 клетках активность
щают 10 мг оксалата н а т р и я и 10 мл венозной фермента не выявлена ( — ) , в 35—специфи-
крови. Тщательно перемешивают и оставляют ческая окраска была слабой ( + ) и в 5— более
стоять на 1 — 1 ' / 2 ч. Вносят в пробирку 6—8 бу- интенсивной ( + + ). Результат определения ак-
синок, закрывают пробирку плотно пробкой и пе- тивности щелочной фосфатазы в нейтрофилах
ремешивают в течение 30 мин (опрокидывая в таком случае составит (60 ХО)+(35 X 1) +
пробирку пробкой вниз и вверх). Затем отстаи- +(5 X 2) = 0 + 35+ 10 = 45 ед. Можно выразить
вают в течение 1 ч п р и комнатной температуре результат в виде среднего цитохимического по-
до разделения слоев. Плазму отсасывают пасте- казателя по L. K a p l o w (1955) или среднего
ровской пипеткой и переносят в центрифужную цитохимического коэффициента (СЦК). С этой
пробирку. Центрифугируют при 1000 об/мин целью также дифференцируют 100 исследуемых
в течение 5 м и н . Надосадочную жидкость слива- клеток по указанной выше системе. Полученный
ют, из осадка готовят мазки. Фиксируют высох- процент клеток в каждой группе умножают на
шие мазки в метиловом спирте и окрашивают соответствующее данной группе число плюсов.
гематологическим красителем. Сумма этих величин, деленная на 100, пред-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . У здоровых ставляет собой СЦК для одной клетки. В ука-
людей волчаночные клетки в крови отсутствуют. занном примере СЦК щелочной фосфатазы ней-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Обнаруже- трофилов равен 0,45. В тех случаях, когда изуча-
ние LE-клеток — с п е ц и ф и ч н ы й симптом систем- емые вещества локализуются в клетках в виде
ной красной волчанки. Исследование необходи- единичных гранул ( н а п р и м е р , активность не-
мо производить до начала кортикостероидной специфической эстеразы в лимфоцитах и др.),
терапии. Отрицательный результат исследова- результат цитохимической реакции целесооб-
ния не исключает возможность данного заболе- разно выражать в процентах клеток, дающих
вания, он бывает в раннем периоде болезни, положительную реакцию.
а т а к ж е п р и выраженном нефротическом синд- Метод полуколичественйой оценки является
роме и потере с мочой большого количества ориентировочным, но позволяет сравнивать рас-
белка. Большую диагностическую ценность име- пределение исследуемых веществ в разных кле-
ет иммунологическое исследование антинуклеи- точных элементах или в одних и тех же клетках
арного фактора (см. раздел « И м м у н о л о г и я » ) . при р а з л и ч н ы х патологических состояниях ор-
Л и т е р а т у р а . Коллагсновые болезни и ганизма, а также в зависимости от течения забо-
ревматизм/Под ред. Е. М. Тареева.— М.: Мед- левания, степени его тяжести и в связи с прово-
гиз, 1961; Поспелова Р. А. Лейкоконцентрация димой терапией.
в клинической практике.— М.: Медицина, 1973, Наиболее распространены цитоэнзиматичес-
г. 771. кие исследования, дающие возможность выя-

127
вить в клетках активность различных ферментов. и фотопленок по методике Меркулова: удалить
Для этого чаще используют методы азосочета- слой эмульсии после в ы м а ч и в а н и я в горячей во-
ния, в которых специфический субстрат, взаимо- де или щелочи, выдержать 5—10 дней в трех
действуя с ферментом, образует продукт реак- сменах хлороформа, промыть спиртом, высу-
ции, который окрашивается солями диазония; шить, мелко нарезать и растворить в смеси
по окраске судят о локализации фермента и его абсолютного спирта с эфиром. 2. 0,5 М раствор
активности. тетрабората рН 9,18 [19,1 г тетрабората натрия
В настоящей главе приведены наиболее рас- (бура) растворить и довести дистиллированной
пространенные в клинической практике цитохи- водой до 1 л ] . Раствор стойкий. 3. 0,1 % рас-
мические методы исследования. твор а-нафтилфосфата в растворе тетрабората
(готовят перед употреблением). 4. 0,2 % раствор
Л и т е р а т у р а . Astaldi G., Verga L. Acta
диазоля синего 0 в растворе тетрабората (гото-
haematol., 1957, vol. 17, p. 129—136; Kaplow L.
вят перед употреблением и фильтруют в защи-
Blood, 1955, vol. 10, № 10, p. 1023—1029.
щенном от света месте). 5. Гематаль 8 Бейкера:
Щ Е Л О Ч Н А Я ФОСФАТАЗА (К. Ф. 3.1.3.1.) один объем 0,1 % гематеина, приготовленного
содержится преимущественно в зрелых нейтро- на 50 % водном растворе этиленгликоля, смеши-
фильных лейкоцитах; активность фермента свя- вают с одним объемом 1,6 % водного раствора
зывают со вторичными (специфическими) гра- сульфата алюминия. Вместо гематаля можно
н у л а м и цитоплазмы. Относится к группе гидро- использовать гематоксилин: 1 г краски раство-
литических ферментов с оптимумом действия ряют в 50 мл дистиллированной воды, доводят
при рН 9,6, осуществляет гидролиз однозаме- до кипения, доливают 50 мл дистиллированной
щенных эфиров ортофосфата. Наиболее распро- воды, добавляют 0,02 г йодата натрия и 5 г
странено определение активности фермента ме- алюмокалиевых квасцов, встряхивают до раст-
тодами азосочетания. ворения и охлаждают. 6. Инкубационная среда
Метод азосочетания по Кеплоу. П р и н ц и п . (готовят перед употреблением); равные коли-
Расщепление щелочной фосфатазой а-нафтил- чества реактивов 3 и 4.
фосфата с освобождением а-нафтола, образу- С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . Хо-
ющего с солями диазония нерастворимый окра- лодильник.
шенный в коричневый цвет осадок в местах Х о д о п р е д е л е н и я . Мазки фиксируют
локализации фермента. в 0,5 % растворе целлоидина в течение 3—5 с.
Р е а к т и в ы . 1 . 10% раствор формалина После фиксации целлоидин с обратной стороны
в абсолютном метаноле. 2. 0,05 М раствор про- предметного стекла удаляют салфеткой, стекла
пандиолового буфера (рН 9,75); готовят основ- ставят в вертикальном положении на фильтро-
ной 0,2 М раствор (10,5 г 2-амино-2-метил-1,3- вальную бумагу и дают им высохнуть. Инкуби-
пропандиола растворяют в 500 мл дистиллиро- руют в инкубационной среде при комнатной
ванной воды), хранят его в холодильнике. Из температуре в защищенном от света месте в те-
основного раствора готовят 0,05 М раствор чение 30 мин. Промывают в проточной воде в те-
(25 мл основного раствора буфера смешивают чение 5—10 мин и ополаскивают в дистиллиро-
с 5 мл 0,1 н. раствора НС1 и доводят дистиллиро- ванной воде. Докрашивают ядра красителем
ванной водой до 100 мл), хранят в холодиль- (реактив 5). При использовании гематаля 8 маз-
нике. 3. а-Нафтилфосфат. Можно использовать ки окрашивают 18—24 ч, затем ополаскивают
нафтол-АS-Фосфат, нафтол-АS-ТR-фосфат или в дистиллированной и проточной воде и высу-
нафтол-АS-В1-фосфат. 4. Прочный синий RR; шивают. При использовании гематоксилина маз-
можно использовать отечественные красители ки окрашивают 30—60 мин, ополаскивают в тет-
диазоль с и н и й 2С и диазоль с и н и й 0. 5. 2 % раборатном буфере, разведенном водопроводной
раствор метилового зеленого. 6. Инкубационная водой, промывают водой и высушивают.
среда (готовят перед употреблением): 35 мг Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . У здоровых
а-нафтилфосфата, 35 мг прочного синего R R , людей большинство сегментоядерных нейтрофи-
35 мл буферного раствора. лов являются фосфатазоотрицательными и толь-
Специальное оборудование. ко в 20—30 % клеток выявлена слабая актив-
Холодильник. ность фермента ( + )• По данным М. Г. Шубича
Х о д и с с л е д о в а н и я . Высохшие н а воз- и Б. С. Нагоева, активность фосфатазы для
духе мазки фиксируют в 10 % растворе фор- здоровых обоего пола составляет 26±0,6 ед.,
малина в абсолютном метаноле при температуре или СЦК 0,26 + 0,006. Выявлено достоверное
О—5 °С в течение 30 с. На высохшие мазки нано- различие между показателями энзиматической
активности у м у ж ч и н и женщин (соответственно
сят инкубационную среду после фильтрования
21 ±0,7 и 31 ±0,8 ед.).
и оставляют мазки при комнатной температуре
на 8—10 мин. Ополаскивают в проточной воде К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Наиболь-
в течение 10 с. Докрашивают метиловым зеле- шее диагностическое значение имеет определе-
ным в течение 15 мин или гематоксилином Май- ние активности фермента при гемобластозах;
снижение активности характерно для хроничес-
ера 3—4 мин.
Метод азосочетания (модификация М. Г. Шу- кого миелолейкоза, повышение — рассматри-
бича). П р и н ц и п см. метод азосочетания п о вают как один из признаков эритремии. Повы-
Кеплоу. шение активности наблюдается также при вос-
палительных процессах, интоксикациях, опухо-
Р е а к т и в ы . I. 0,5 % раствор целлоидина
в смеси равных количеств абсолютного спирта лях, коллагенозах, циррозах печени. Показатель
и эфира. Целлоидин можно готовить из кино- может быть использован как дифференциально-
128
диагностический п р и з н а к при лейкемоидных ре- всех указанных выше заболеваниях наблюда-
акциях (активность фермента повышена) и хро- ется повышение активности и щелочной фосфа-
ническом миелолейкозе. Снижение активности тазы, а при цитохимическом методе исследова-
фермента часто сопутствует вирусному гепатиту, ния обоих ферментов используют единый суб-
инфекционному мононуклеозу и другим вирус- страт, при получении высокой активности кис-
н ы м инфекциям, лучевой болезни. лой фосфатазы М. Г. Шубич и И. В. Нестерова
предлагают проводить повторное исследование
Л и т е р а т у р а . Буйкис И. М., Руденс Ю. Ф.
после ингибирования щелочной фосфатазы с по-
Гистохимическое определение активности ще-
мощью ЭДТА.
лочной фосфатазы методом одновременного
Повышение активности кислой фосфатазы
азосочетания.— Вопросы лейкозологии (Рига),
в лимфоцитах отмечается при и м м у н и з а ц и и ,
1969, № 1,с. 369—376; Шубин М. Г.— Лаб. дело, различных аллергических заболеваниях.
1965, № 1, с. 10—14; Шубин М. Г., Нагоев Б. С. В властных клетках при острых лейкозах
Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и па- характер распределения продукта реакции раз-
тологии.— М.: Медицина, 1980, с. 41; Kaplow L. личен в зависимости от формы лейкоза. При
Blood, 1955, vol. 10, № 10, p. 1023-1029. острых лимфобластных формах активность вы-
является в гранулярной форме, при миелоб-
ластных — в диффузной форме.
К И С Л А Я ФОСФАТАЗА (К. Ф. 3.1.3.2). Об-
наруживают преимущественно в нейтрофилах
Л и т е р а т у р а . Берстон М. Гистохимия
и лимфоцитах крови; локализацию связывают
ферментов.— М.: Мир, 1965, с. 215; Руденс Ю. Ф.,
с лизосомами цитоплазмы клеток. Кислая фос-
Буйкис И. М. Вопросы лейкозологии ( Р и г а ) ,
фатаза является гидролитическим ферментом
1969, № 1, с. 377—383; Шубич М. Г., Нестеро-
с оптимумом действия рН 5,2. Для цитохими-
ва И. В. Лаб. дело, 1980, № 3, с. 150—154.
ческого исследования чаще используют методы
ПЕРОКСИДАЗА (МИЕЛОПЕРОКСИДА-
азосочетания.
ЗА) (К. Ф. 1 . 1 1 . 1 . 7 ) . Фермент, локализующий-
Метод азосочетания Берстона (модификация
ся преимущественно в специфической зернисто-
Ю. Ф. Руденса, И. М. Буйкиса). П р и н ц и п см.
сти цитоплазмы гранулоцитов и являющийся
Метод азосочетания по Кеплоу.
маркером клеток миелоидной природы. Миелопе-
Р е а к т и в ы . 1. 0,1 М раствор цитратного буфе-
ра (рН 5,2). 2. 0,05 М раствор хлорида м а г н и я . роксидаза разрушает токсическую перекись во-
3. Нафтол-АS-Фосфат (можно использовать дорода, образующуюся внутриклеточно в про-
цессе жизнедеятельности клеток.
нафтол-АS-ТR-фосфат или нафтол-АS-В1-фос-
фат. 4. Диметилформамид. 5. Диазоль синий Метод Грэхема — Кнолля. Принцип.
2С или прочный синий ВВ. 6. Краситель Рома- В присутствии пероксидазы бензидин окисляется
перекисью водорода в коричневый оксибензидин.
новского — Гимзы. 7. Изотонический раствор
хлорида натрия. 8. Инкубационная среда: 10 мг Р е а к т и в ы . 1 . 4 % формалиново-спирто-
нафтол-АS-Фосфата, растворенного в 5 мл диме- вой раствор (10 частей 40 % формалина и 90 ча-
тилформамида; 15 мл 0,1 М цитратного буфера стей 96 % спирта). 2. Реактив на пероксидазу:
рН 5,2, 45 мл дистиллированной воды, 5 мл бензидин (на кончике ножа) растворяют в 6 мл
раствора хлорида м а г н и я , 50 мг диазоля синего. 96 % спирта, прибавляют 4 мл воды и 0,02 мл
Готовят перед употреблением и используют по- 3 % перекиси водорода. Реактив годен к упот-
сле фильтрования. реблению в течение 5—6 дней. 3. Краситель
Специальное о б о р у д о в а н и е . Тер- Романовского — Гимзы.
мостат. С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . Не
требуется.
Ход и с с л е д о в а н и я . Нефиксирован-
Х о д о п р е д е л е н и я . Свежие мазки ( 1 —
ные мазки и н к у б и р у ю т в инкубационной среде
при 37 °С в течение 2 ч. Промывают изотони- 2-дневной давности) фиксируют 4 % формали-
ново-спиртовым раствором в течение 30 с. Обмы-
ческим раствором хлорида натрия. Докрашива-
ют красителем Романовского — Гимзы. Промы- вают в проточной воде и высушивают. Заливают
вают в проточной воде. Активность фермента реактивом на пероксидазу на 5 мин. Тщательно
выявляется в виде синей окраски. промывают в проточной воде и высушивают.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В сегмен- Докрашивают красителем Романовского —
тоядерных нейтрофилах активность фермента Гимзы. Пероксидаза выявляется в цитоплазме
клеток в виде коричневых гранул.
равна 38,6±2,82 ед., или СЦК 0,386 + 0,028, в
Модифицированный метод Нарциссова.
лимфоцитах —26,9±1,94 ед., или СЦК 0,268±
П р и н ц и п см метод Грэхема — Кнолля. Для
±0,019. У детей активность кислой фосфатазы
уменьшения и н а к т и в а ц и и фермента использова-
в нейтрофилах выше, чем у взрослых.
ны соответствующий фиксатор и небольшое ко-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Повыше-
личество перекиси водорода.
ние активности наблюдается в нейтрофилах при
воспалительных процессах, при туберкулезе, ин- Р е а к т и в ы . 1. 60 % водный раствор аце-
фаркте миокарда, острых хирургических заболе- тона. 2. 0,1 М раствор бората натрия (можно
в а н и я х , злокачественных опухолях. При этом использовать фосфатный или мединаловый бу-
следует учитывать, что высокие цифры актив- ферный раствор рН 7.6). 3. 5 % водный раствор
ности фермента могут быть результатом повы- трилона Б. 4. Насыщенный водный раствор
шения активности щелочной фосфатазы в ней- бензидина. 5. 0,003 % раствор перекиси водо-
трофилах, так как активность последней может рода (разводят перед употреблением из 3 % рас-
выявляться и в кислой среде. Поскольку при твора в два этапа). 6. Инкубационная среда:

129
5 п / р В. В. Меньшикова
мл 5 % водного раствора трилона Б, 10 мл активность фермента высокая при остром миело-
раствора бората натрия, 35 мл насыщенного бластном лейкозе, слабая — при остром моно-
раствора бензидина и 2 мл раствора перекиси бластном и отсутствует — при остром лимфо-
водорода. 7. 0,5 % раствор метилового зеленого бластном лейкозе.
на буферном растворе (рН 5,0) или 0,1 % вод-
Л и т е р а т у р а . Нарциссов Р. П. Лаб. де-
ный раствор метиленового синего.
ло, 1964, № 3, с. 150—151; Шафран М. Г., Пига-
Специальное оборудование.
ревский В. Е., Блинова Э. И. Цитология, 1979,
Термостат.
т. 21, № 10, с. 1206—1208; Тодоров И. Клини-
Х о д о п р е д е л е н и я . Свежеприготовлен-
ческие лабораторные исследования в педиат-
ные мазки фиксируют в 60 % водном растворе
рии.— София, 1963, с. 468.
ацетона в течение 30 с. Промывают дистиллиро-
Н Е С П Е Ц И Ф И Ч Е С К И Е ЭСТЕРАЗЫ. Труп
ванной водой. Инкубируют в инкубационной
па ферментов, гидролизующих эфиры карбоно-
среде в течение 1 ч в термостате при 37 °С.
Промывают дистиллированной водой. Докраши- вых кислот; отличаются небольшой специфич-
ностью. Локализуются в цитоплазме клеток,
вают мазки метиловым зеленым или метиле-
главным образом в лизосомах. Наибольшая
новым синим в течение 10 мин. Можно исследо-
активность обнаружена в моноцитах крови. Для
вать недокрашенные мазки.
Модифицированный метод [Шафран М. Г. определения активности ферментов используют
и соавт., 1979). П р и н ц и п см. Метод Грэ- различные субстраты (а-нафтилацетат, нафтол-
хема — Кнолля. Бензидин заменен О-дианизи- AS-ацетат, нафтол-АS-D-хлорацетат, b-нафтил-
ацетат и др.).
дином.
Р е а к т и в ы . 1. 10% спиртовой раствор а-Нафтилацетат-эстераза (метод Леффле-
формалина (1 мл 10 % формалина и 9 мл этило- ра). П р и н ц и п . Соединение а-нафтилацетата
вого спирта). 2. Спиртовой раствор О-дианизи- при определенных рН и температуре под влия-
дина (можно использовать препарат Шосткин- нием неспецифических эстераз гидролизуется
ского завода химреактивов; белые или желтова- с образованием свободного нафтола, который
тые кристаллы препарата быстро окисляются на с солями диазония дает цветное окрашивание.
воздухе, при изменении окраски он становится Р е а к т и в ы . 1 . Формалин промышленного
непригодным). 24 мг О-дианизидина растворяют производства (40%). 2. а-Нафтилацетат. 3.
в 5 мл метанола и доводят дистиллированной Ацетон х. ч. 4. 0,1 М раствор фосфатного буфера
водой до 9,9 мл. 3. 3 % раствор перекиси водоро- (рН 7,8—8,0). 5. Прочный синий ВВ (или проч-
да. 4. Реакционная смесь: к спиртовому раст- ный красный ТР). 6. Ядерный краситель (гема-
вору О-дианизидина прибавляют перед употреб- лаун кислый, метиловый зеленый и пр.). 7. Ин-
лением 0,1 мл перекиси водорода. 5. 0,25 % кубационная среда: 10 мг а-нафтилацетата, рас-
водный раствор азура А или другой ядерный творенного в 0,2 мл ацетона; 40 мл буферного
краситель. раствора (реактив № 4), встряхивают до раст-
С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . Не ворения; 50 мг соли диазония (реактив № 5),
требуется. встряхивают до растворения и фильтруют.
Ход определения. Мазки С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . 1.
фиксируют спиртовым раствором формалина Весы. 2. Эксикатор.
в течение 10—15 с. Споласкивают проточной Х о д о п р е д е л е н и я . Свежеприготовлен-
водой. На мазки наносят реакционную смесь ные и высушенные на воздухе мазки фиксируют
на 2—3 мин при комнатной температуре. Спо- в парах формалина 4 мин (фиксированные
ласкивают проточной водой. Докрашивают рас- препараты можно сохранять в холодильнике
твором азура в течение 10—15 с. Споласкивают несколько недель или 2 сут при комнатной тем-
проточной водой и высушивают. пературе). Инкубируют в инкубационной среде
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В крови при комнатной температуре 30 мин. Промывают
здоровых людей активность пероксидазы выяв- в проточной воде (2—3 м и н ) . Докрашивают
ляется преимущественно в цитоплазме грануло- кислым гемалауном 8 мин. Промывают дистил-
цитов и в меньшей степени — моноцитов. Фер- лированной водой 15 мин. Активность фермента
мент появляется в кровяных клетках на стадии выявляется в виде коричнево-черных (при упот-
промиелоцитов и у ряда миелобластов (более реблении прочного синего) или красно-коричне-
зрелых). Не содержат фермента недифференци- вых (при употреблении прочного красного) гра-
рованные бласты, часть миелобластов и лимфо- нул в цитоплазме клеток.
бласты; 3—16 % нейтрофилов окрашены резко Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В моноци-
положительно (+ + +). 60—90 % — положи- тах периферической крови активность фермента
тельно (++) и остальные—слабоположитель- содержится в виде мелкой обильной зернистости.
но ( + ). СЦК нейтрофилов здоровых людей СЦК в моноцитах составляет 0,95±0,01. Не-
равен 2,56 + 0,033. Эозинофилы характеризу- большое количество лимфоцитов (18,0±0,4 %)
ются резко положительной реакцией на перок- содержит активность фермента в виде единич-
сидазу. ных гранул в цитоплазме; в тромбоцитах пери-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Актив- ферической крови фермент выявляется в виде
ность фермента в нейтрофилах снижена при мелких гранул, в сегментоядерных нейтрофилах
инфаркте миокарда, ревматизме, туберкулезе, его активность ничтожна.
опухолях. У больных хроническим миелолейко- Среди костномозговых элементов наиболь-
зом, особенно в терминальной стадии, СЦК сни- шую активность имеют промиелоциты, миело-
жается до 1,63 ±0,19 ед. В бластных клетках циты, мегакариоциты, моноциты, ретикулярные
130
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Снижение
клетки. В моноцитах периферической крови и
активности фермента в лимфоцитах характерно
костного мозга с помощью двойной инкубации
для хронического лимфолейкоза (В-клеточного
и добавления фторида натрия (NaF) в коли-
в а р и а н т а ) ; при Т-клеточных пролиферациях ак-
честве 1,5 мг/мл показан NaF — чувствитель-
тивность неспецифической кислой эстеразы в
ный фермент.
лимфоцитах повышена.
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Снижение
активности фермента в моноцитах и увеличение Л и т е р а т у р а . Потапова С. Г., Шахба-
в лимфоцитах обнаружено при диффузных пора- зян Г. П., Демидова Н. В., Козинец Г. И.
жениях печени. Значительная активность фер- Лаб. дело, 1981, № 2, с/74—76; Kullenkam.pl 1.,
мента выявлена в миеломных клетках при плаз- Janassi G., Greaves H. Brit. J. Haemal., 1977,
моцитоме, в властных клетках при остром мо-
vol. 36. p. 231—240.
нобластном (гистиомонобластном) лейкозе и
НАФТОЛ-AS АЦЕТАТ-ЭСТЕРАЗА. Метод
при промиелоцитарном лейкозе, в то время как
Леффлера. П р и н ц и п и о б о р у д о в а н и е
при остальных формах острых лейкозов актив-
такие же, как для определения а-нафтилаце-
ность фермента в бластных клетках ничтожна.
тат-эстеразы.
При хроническом лимфолейкозе активность фер-
Р е а к т и в ы . 1 . Формалин промышленного
мента в лимфоцитах резко снижена. Фермента-
производства (40 %). 2. 0,1 М фосфатный буфер
тивная активность нейтрофилов при острых лей-
(рН 6,8—7,0). 3. Ацетон х. ч. 4. Нафтол-AS-
козах, особенно при остром миелобластном,
ацетат (можно использовать нафтол-АS-D-аце-
снижена.
тат). 5. Прочный синий ВВ. 6. Ядерный краси-
Л и т е р а т у р а . Lofjler H. Klin. Wschr., тель. 7. Инкубационная среда: 4 мг нафтол-
1961, Bd 29, H. 23, S. 1220—1227. AS-ацетата, растворенного в 0,4 мл ацетона,
40 мл буферного раствора (реактив № 2); встря-
К И С Л А Я а-НАФТИЛАЦЕТАТ-ЭСТЕРАЗА. хивают и добавляют 80 мг прочного синего ВВ,
Фермент локализуется главным образом в лизо- встряхивают и фильтруют.
сомах цитоплазмы клеток и участвует в гидро- Х о д о п р е д е л е н и я . Высушенные н а
лизе алифатических эфиров. воздухе (в течение 1—3 ч) мазки фиксируют
Метод Кулленкампфа и соавт. П р и н ц и п . в парах формалина несколько минут. Помеща-
Из соединения а-нафтилацетата при кислом рН ют в инкубационную среду на 60 мин при ком-
под влиянием фермента образуется свободный натной температуре. Промывают в проточной
нафтол, дающий цветное о к р а ш и в а н и е с фук- воде. Докрашивают ядерным красителем.
сином. Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Так же, как
Р е а к т и в ы . 1. 2,5% раствор глутараль- и а-нафтил-эстераза, фермент локализуется
дегида (рН 7,2). 2. 4 % раствор солянокислого главным образом в моноцитах крови. По сравне-
фуксина. 3. 4 % раствор нитрата натрия. 4. 0,7 М нию с активностью а-нафтилацетат-эстеразы
фосфатный буфер (рН 5,0). 5. сх-Нафтилацетат. активность нафтол-АS-ацетат-эстеразы в сег-
6. 2 % раствор метилового зеленого. 7. Инкуба- ментоядерных нейтрофилах несколько выше, а в
ционная среда: 2 мл реактива № 2, 2 мл реакти- лимфоцитах — слабее. В клетках костного моз-
ва № 3, 40 мл реактива № 4. 10 мг а-нафтила- га фермент обнаружен в мегакариоцитах, рети-
цетата, растворенного в 0,4 мл ацетона. Инку- кулярных и плазматических клетках, а также
бационная среда должна иметь рН 5,8 и гото- незрелых гранулоцитах.
виться перед употреблением. К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Значитель-
С п е ц и а л ь н о е оборудование. 1. ная активность фермента характерна для бласт-
Холодильник. 2. Весы. 3. Эксикатор. ных клеток при остром монобластном (гистио-
Х о д о п р е д е л е н и я . Высушенные н а монобластном) лейкозе, при остром промиело-
воздухе мазки фиксируют в глутаральдегиде цитарном лейкозе; при других формах острых
(реактив № 1) при температуре 4 °С в течение лейкозов активность фермента в бластных клет-
10 мин (нефиксированные мазки можно хранить ках не выявляется.
в холодильнике 1—2 мес). Промывают дистил-
лированной водой. Инкубируют в инкубацион- Л и т е р а т у р а . Loffler H, K l i n . Wschr.,
ной среде в течение 1'/ 2 —6 ч. Промывают дис- 1961, Bd 39, H. 23, S. 1220—1227.
тиллированной водой. Докрашивают метиловым
зеленым. НАФТОЛ-AS D - Х Л О Р А Ц Е Т А Т - Э С Т Е Р А -
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В цито- ЗА. Метод Молони с соавт. П р и н ц и п и о б о -
плазме лимфоцитов активность фермента выяв- р у д о в а н и е такие же, как для определения
ляется в виде темно-красных гранул, в нейтро- а-нафтилацетат-эстеразы.
филах и моноцитах — в виде диффузной окрас- Р е а к т и в ы . 1 . 10% раствор формалина
в метаноле (сохраняют в холодильнике). 2. Бу-
ки. СЦК лимфоцитов равен 0,57 + 0,04. Актив-
ность фермента увеличивается при увеличении ферный раствор Михаэлиса (рН 7,4). 3. Наф-
тол-АS-D-хлорацетат. 4. Ацетон х. ч. 5. Грана-
времени инкубации. Так, при инкубации в тече-
ние 1 ' / 2 ч активность фермента выявлена в товый прочный GBC или синий прочный ВВ.
49,83±2,75 % лимфоцитов, при удлинении сро- 6. Ядерный краситель. 7. Инкубационная среда:
ка и н к у б а ц и и до 6 ч эстеразоположительными 10 мг нафтол-АS-D-хлорацетата, растворенного
становятся 79,7± 1,52% лимфоцитов. Исполь- в 0,5 мл ацетона, 10 мл буферного раствора
зование в качестве фиксатора формалина дает (реактив № 2), разведенного пополам дистил-
более стабильные результаты. лированной водой (добавляют по к а п л я м ) , 10 мг
131
реактива № 5; быстро встряхивают во избежа- Специальное оборудование.
ние образования осадка, смесь фильтруют. Термостат.
С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . Не Х о д о п р е д е л е н и я . Свежеприготовлен-
требуется. ные и высушенные на воздухе мазки фиксируют
Х о д о п р е д е л е н и я . Свежеприготовлен- в ацетоне при комнатной температуре 30—60 с.
ные и высушенные на воздухе мазки фиксируют Промывают в дистилированной воде и высуши-
в холодном 10 % растворе формалина в метано- вают на воздухе. Инкубируют в инкубационной
ле в течение 30 с и затем высушивают. Фиксиро- среде в течение 1 ч при 37 °С. Промывают дис-
ванные препараты можно сохранять несколько тиллированной водой. Докрашивают 0,1 % раст-
месяцев. Помещают в и н к у б а ц и о н н у ю смесь при вором прочного красного 10 мин.
комнатной температуре на 30 мин. Промывают Метод Нахласа с соавт. (модификация
в проточной воде. Докрашивают ядерным кра- Р. П. Нарциссова). П р и н ц и п тот же.
сителем. Р е а к т и в ы . 1. 60 % раствор ацетона, на-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Фермент сыщенный трилоном Б. 2, 1/15 M фосфатный
выявляется в виде с и н и х или фиолетовых гранул буфер (рН, 7,2). 3. Сукцинат натрия. 4. Пара-
в цитоплазме сегментоядерных нейтрофилов, нитротетразолий фиолетовый. 5. Трилон Б. 6.
лимфоциты и моноциты фермента не содержат. 0,5 % раствор метилового зеленого на ацетатном
В мазках пунктата костного мозга здоровых буфере (рН 5,0). 7. Инкубационная среда:
людей наибольшую активность фермента обна- 540 мг сукцината натрия растворяют в 10 мл
руживают в промиелоцитах. По мере созревания дистиллированной воды, добавляют 10 мл бу-
гранулоцитов активность нафтол-АS-D-хлор- ферного раствора (реактив № 2) и 10 мл раст-
ацетат-эстеразы несколько снижается, но оста- вора пара-нитротетразолия в дистиллированной
ется довольно высокой. Наиболее высокая интен- воде (1 м г / м л ) , 13 мг трилона Б (рН довести до
сивность реакции наблюдается при фиксации 7,2) и дистиллированной воды до 40 мл. Среда
в парах формалина при комнатной температуре. может быть пригодна 1—2 нед при х р а н е н и и
Время фиксации до 10 мин не оказывает в л и я н и я в холодильнике.
на уровень активности фермента, лишь при Специальное оборудование.
фиксации в течение 30 м и н и дольше активность 1. Термостат или водяная баня. 2. Холодиль-
фермента снижается. ник.
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Высокая Х о д о п р е д е л е н и я . Фиксируют мазки
активность фермента обнаружена в властных ацетоном (реактив № 1) при комнатной темпе-
клетках п р и промиелоцитарном остром лейкозе, ратуре в течение 30 с. Ополаскивают дистил-
ничтожная — при остром монобластном; при лированной водой 3—5 с и высушивают. Инку-
других формах острых лейкозов в властных бируют в инкубационной среде в течение 1 ч
клетках активность не выявлена. при 37 °С. Промывают проточной водой в тече-
ние 1 м и н . Ополаскивают дистиллированной
Л и т е р а т у р а . Руденс Ю. Ф., Буй-
водой 3—5 с. Докрашивают метиловым зеленым
кис И. М. Лаб. дело., 1971, № 10, с. 592;
5—10 мин. Промывают в проточной воде. Допол-
Moloney W. С. et a l . J. Histochem. Cytochem.,
нительно фиксируют мазки п а р а м и формалина
1960, v o l . 8, p. 200—207; Schmalzl F.\ Braun-
в течение 30 мин (для предотвращения раст-
steiner H. K l i n . Wschr., 1968, Bd 46, H. 12,
ворения формазана нитротетразолия фиолето-
S. 642—650.
вого в иммерсионном масле).
ДЕГИДРОГЕНАЗЫ — группа окислитель-
а-ГЛИЦЕРОФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА
но-восстановительных ферментов, локализу-
(а-ГФДГ). Метод Нахласа с соавт. (модифика-
ющихся в митохондриях цитоплазмы клеток.
ция Р. П. Нарциссова). П р и н ц и п см. Сук-
Для исследования различных дегидрогеназ ис-
цинатдегидрогеназа.
пользуют метод Нахласа с соавт. в модифика-
циях, основанный на реакции восстановления Р е а к т и в ы . 1. 60 % раствор ацетона, на-
солей тетразолия и выпадения осадка диформа- сыщенный трилоном Б. 2. 1/15 M фосфатный
зана в местах активности ферментов. буфер (рН 7,2). 3. а-Глицерофосфат натрия.
4. Пара-нитротетразолий фиолетовый. 5. Трилон
С У К Ц И Н А Т Д Е Г И Д Р О Г Е Н А З А (СДГ; К
Б. 6. 0,5 % раствор метилового зеленого на
Ф. 1.3.9.9.1). Метод Нахласа с соавт. (моди-
ацетатном буфере (рН 5,0). 7. Инкубационная
фикация К в а г л и н о , Хейхо). П р и н ц и п . Ак-
тивность фермента оценивается по реакции вос- среда: 630 мг ex-глицерофосфата натрия раство-
становления солей тетразолия в виде осадка ряют в 10 мл дистиллированной воды, добав-
диформазана синего цвета. ляют 10 мл буферного раствора (реактив № 2),
Р е а к т и в ы . 1. 60 % водный раствор аце- 10 мл раствора пара-нитротетразолия в дистил-
лированной воде (1 м г / 1 мл), 13 мг трилона Б
тона. 2. 0,2 М фосфатный буфер (рН 7,4).
3. 0,2 М раствор с у к ц и н а т а натрия. 4. 0,6 М (рН доводят до 7,2) и дистиллированной воды до
раствор бикарбоната натрия. 5. 0,03 М раствор 40 мл. Среда пригодна в течение 1—2 нед при
х р а н е н и и в холодильнике.
хлорида а л ю м и н и я . 6. 0,03 М раствор хлорида
кальция. 7. Тетразолий нитро ВТ. 8. 0,1 % рас- О б о р у д о в а н и е и ход определе-
твор прочного красного. 9. И н к у б а ц и о н н а я сре- ния см. Сукцинатдегидрогеназа (модифика-
да: 10 мл реактива № 3, 2 мл реактива № 4, ция Р. П. Нарциссова).
0,2 мл реактива № 5, 0,2 мл реактива № 6, Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . У здоровых
10 мг тетразолия в 10 мл дистиллированной СДГ и а-ГФДГ выявляются в виде гранул в ней-
воды, дистиллированной воды до 40 мл. трофилах, лимфоцитах, тромбоцитах перифери-
132
ческой крови и миелобластах, гранулоцитах, раствор периодата на 20 мин (в темноте). Про-
мегакариоцитах, эритро- и нормобластах кост- мывают в трех сменах дистиллированной воды.
ного мозга. Ополаскивают в сернистой воде (в течение 1 —
СЦК СДГ лимфоцитов составляет 1,1 ±0,05; 2 м и н ) . Окрашивают реактивом Шиффа в тече-
а-ГФДГ—0,8±0,08. У детей активность фер- ние 30—40 мин (в темноте). Промывают в трех
мента СДГ обнаружена в 46 % лимфоцитов. сменах сернистой воды по 3 мин. Промывают
У здоровых взрослых в пунктате костного мозга в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин.
около 88 % недифференцированных клеток име- Окрашивают светло-зеленой краской в течение
ют активность фермента ( + ), все ядерные эле- 10—20 с. Промывают в дистиллированной воде.
менты эритроидного ряда и гранулоциты прояв- Гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый
ляют активность на ( + ) и ( + + ). цвет на зеленом фоне препарата. Кроме глико-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Снижение гена, положительную реакцию могут давать та-
активности ферментов в лимфоцитах отмечено кие ШИК-положительные вещества, как кислые
в период приступа бронхиальной астмы, при и нейтральные мукополисахариды, мукопроте-
хроническом лимфолейкозе. Повышение актив- ины, гликопротеины и др. Гликоген легко отдиф-
ности ферментов обнаружено у больных злока- ференцировать от других веществ пробой со
чественными опухолями в гранулоцитах, сниже- слюной или диастазой.
ние активности — при хроническом миелолей- Проба со слюной. Препарат помещают в све-
козе. жесобранную слюну и оставляют на 30 мин
в термостате. Затем производят окраску на гли-
Л и т е р а т у р а . Нарциссов Р. П. Арх.
коген приведенным выше методом. Инкубация
анат., 1969, № 5, с. 85—91; Nachlas M. M. et a l .
препаратов со слюной способствует расщепле-
j. Histochem., Cytochem., 1957, vol. 5, p. 420—
нию гликогена, и при реакции с реактивом
436; Quaglino D., Hayhoe F. Nature, 1960, vol.
Шиффа не получается розовой окраски.
187, № 4731, p. 85—86.
Идентифицировать гликоген можно также
ГЛИКОГЕН локализуется в цитоплазме кле- путем предварительной инкубации мазков с диа-
ток и играет важную роль в энергетическом стазой (а-амилаза; К. Ф. 3.2.1.1) (1 мл про-
метаболизме клеток. При цитохимическом иссле- фильтрованной диастазы растворить в 40 мл
довании гликогена используют главным образом изотонического раствора хлорида натрия) в те-
PAS- или ШИК-реакцию (по названию реакти- чение 30 мин в термостате.
вов— шифф-йодная кислота). Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В мазках
Метод Шабадаша. П р и н ц и п . Под влия- периферической крови гликоген содержится в
нием периодата калия гликоген окисляется с об- цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мел-
разованием альдегидных соединений, легко реа- кой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в
гирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернис- виде небольшого количества крупных зерен).
тая кислота). В местах локализации гликогена В пунктате костного мозга гликоген выявля-
выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание. ется в нейтрофилах разной степени зрелости,
Р е а к т и в ы . 1. 0,03 М раствор периодата лимфоцитах и мегакариоцитах. У здоровых лю-
калия или натрия: 230 мг периодата растворяют дей количество интенсивно окрашенных нейтро-
в 100 мл дистиллированной воды. Готовят перед филов крови ( + + +) колеблется в пределах
употреблением. 2. 1 н. НС1: 82,5 мл концентриро- 2—12 %, средней интенсивности окраски
ванной НС1 отн. плотности 1,19 доливают дис- ( + + ) — в пределах 72—90%, слабо окра-
тиллированной водой до 1 л. 3. Основной фуксин шенных ( + ) —от 4 до 18%. СЦК равен
(для фуксин-сернистой кислоты). 4. Метаби- 1,71—2,04.
сульфит калия. 5. Реактив Шиффа; 1 г основного В лимфоцитах крови здоровых людей глико-
фуксина растворяют в 200 мл кипящей дистил- ген содержится в виде небольшого числа гранул
лированной воды. По мере охлаждения в раст- в 10,4 ±2,3 % клеток. В мегакариоцитах кост-
вор добавляют 1 г метабисульфита калия и 20 мл ного мозга гликоген обнаруживается в виде
1 н. НС1. Оставляют на сутки. Для полного гранул (от единичных до 30—50), напоминая
обесцвечивания добавляют растолченную таб- скопления кровяных пластинок. У здоровых лю-
летку карболена, оставляют на сутки, затем дей число гликогенположительных мегакариоци-
фильтруют. Реактив сохраняют в темноте (луч- тов составляет 62,0 ±3,55 %.
ше на холоде) в плотно закрытой посуде. Годен К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Увеличе-
к употреблению в течение нескольких месяцев ние содержания гликогена в нейтрофилах наб-
(легкая степень покраснения свидетельствует людается при различных воспалительных про-
о непригодности реактива). 6. Сернистая вода: цессах, эритремии, сахарном диабете, уменьше-
к 10 мл 10 % раствора метабисульфита калия ние — при агранулоцитозах, лучевой болезни,
добавляют 200 мл дистиллированной воды и при хроническом миелолейкозе, особенно при
10 мл 1 н. HCI. Готовят перед употреблением. прогрессировании процесса. Повышение числа
7. 0,1 % спиртовой раствор светло-зеленой гликогенположительных лимфоцитов (до 70—
краски (лихтгрюн). 80 %) характерно для лимфопролиферативных
Специальное оборудование. заболеваний, особенно хронического лимфолей-
1. Горелки. 2. Термостат. 3. Весы. коза. При тромбоцитопенической пурпуре и сим-
Х о д о п р е д е л е н и я . Препараты фикси- птоматических тромбоцитопениях число глико-
руют (тотчас после приготовления) в абсолют- генположительных форм мегакариоцитов значи-
ном спирте в течение 30 мин. Промывают в двух тельно снижено, после спленэктомии оно повы-
сменах дистиллированной воды. Погружают в шается до нормальных величин.
133
При острых лейкозах гликоген можно обна- величин и 5,2 % для патологических (не превы-
ружить в властных клетках: при остром миело- шает допустимой величины).
бластном лейкозе — в виде мелкой зернистости Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . У взрослых
в цитоплазме или в виде диффузного ее окраши- в возрасте 20—30 лет СЦК равен для мужчин
вания, при остром лимфобластном лейкозе — 1,58 + 0,01 и для женщин 1,58 + 0,03. Более вы-
в виде к р у п н ы х гранул, расположенных в цито- сокие значения получены у детей в возрасте
плазме вокруг ядра, при остром монобластном 1 — 12 мес (1,89±0,03) и 1—3 лет (1,96 + 0,03).
варианте бластные клетки содержат гликогена Метод с бромфеноловым синим (по М. Г. Шу-
немного в виде диффузной окраски, при эритро- бину). П р и н ц и п . Избирательная окраска ка-
миелозе гликоген в виде гранул обнаружива- тионного белка бромфеноловым синим.
ется в эритробластах. Р е а к т и в ы . 1 . 5 % раствор сульфосалици-
ловой кислоты (5 г сульфосалициловой кислоты
Л и т е р а т у р а . Шабадаш А. Л. Изв.
растворяют в 95 мл дистиллированной воды).
АН СССР; серия биол., 1947, № 6, с. 745—
2. 0,05 М раствор буры рН 9,55 (19,1 г буры
760; Шабадаш А. Л. Докл. АН СССР, 1949,
растворяют в 1 л дистиллированной воды).
т. 68, № 2, с. 389—392.
3. 0,1 М раствор однозамещенного фосфата
К А Т И О Н Н Ы Й БЕЛОК. Неферментный ка- калия (13,6 г КН2РО4 растворяют в 1 л дистил-
тионный белок локализуется в лизосомах гра- лированной воды). 4. 0,05 М боратный буфер
нулоцитов и играет важную роль в реализации рН 8,2 (6,13 мл реактива № 2 добавляют 3,87 мл
фагоцитарной функции клеток. При цитохими- реактива № 3, а затем доводят реактивом 3 до
ческом исследовании катионных белков исполь- рН 8,2). 5. 0,1 % раствор бромфенолового си-
зуют методы, основанные на применении диа- него в 0,05 М боратном буфере (100 мг сухого
хромных анионных красителей. бромфенолового синего растворяют в 100 мл
Метод Пигаревского (модифицированный). реактива № 4). 6. 1 % водный раствор сафра-
П р и н ц и п . Избирательная окраска кат'ион- нина или 0,05 % раствор основного фуксина.
ного белка гранулоцитов прочным зеленым при Последний готовят перед употреблением: рас-
творяют 50 мг основного фуксина в 100 мл кипя-
рН 8,1—8,2.
щей дистиллированной воды.
Р е а к т и в ы . 1 . Спиртовой раствор форма-
С п е ц и а л ь н о е оборудование. 1.
лина (1 мл формалина и 19 мл абсолютного
этилового спирта). 2. 0,2 М раствор триса: 24,2 г рН-Метр. 2. Весы. 3. Газовая или электрическая
триса (оксиметил) аминометана растворяют в плитка.
1 л дистиллированной воды. 3. 0,1 н. НС1. 4. Ме- Х о д о п р е д е л е н и я . Фиксируют мазки
таноловый трис-буфер (25 мл реактива № 2 в 5 % растворе сульфосалициловой кислоты
смешивают с 22,5 мл реактива № 3 и 52,5 мл в течение 60—90 с. Тщательно промывают дис-
метанола). 5. Забуференный спиртовой раствор тиллированной водой и высушивают. Окраши-
прочного зеленого (рН 8,1—8,2): 100 мг прочно- вают 0,1 % раствором бромфенолового синего
го зеленого растворяют в 100 мл реактива № 4. в боратном буфере (реактив № 5) в течение
Определяют рН через сутки после приготовле- 1—2 мин. Промывают в трех сменах 0,05 М бо-
ния реактива и выравнивают его добавлением ратного буфера (реактив № 4) по 1—3 мин.
в раствор порошка сухого триса (при рН ниже Высушивают и докрашивают 1 % раствором
8,1) или слабого раствора НС1 (рН выше 8,2). сафранина в течение 30—60с или 0,05 % раство-
ром основного фуксина в течение 1—2 с. Промы-
Установленная величина рН стабильна при ра-
боте в течение 4 мес. Раствор хранить в стеклян- вают проточной водопроводной водой и высу-
ной посуде с притертой пробкой (можно при шивают. Катионный белок выявляется в цито-
комнатной температуре). 6. 0,25 % водный раст- плазме клеток в виде синих гранул.
вор азура А: 250 мг азура А растворяют в 100 мл В о с п р о и з в о д и м о с т ь м е т о д а . От-
дистиллированной воды. Краситель стойкий. носительная стандартная ошибка для группы
С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . 1. здоровых составила 5,2 %.
рН-Метр. 2. Весы. Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . У здоровых
Х о д о п р е д е л е н и я . Высушенные н а в нейтрофилах обнаружено 123+1,5 ед. или
воздухе мазки фиксируют в спиртовом растворе СЦК 1,23 + 0,015, при этом не отмечено разли-
формалина 10—15 с. Во избежание фоновой чий у здоровых обоего пола. Протеинположи-
окраски можно использовать свежеприготовлен- тельные нейтрофилы составляют у мужчин
ные нефиксированные мазки (не позже чем через 83+1,4 %, у женщин 86 + 0,6 %.
48 ч после приготовления, препараты более дли- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Снижение
тельного срока необходимо фиксировать). Маз- катионного белка в нейтрофилах характерно
ки окрашивают забуференным спиртовым раст- для острого воспалительного процесса; наблю-
вором прочного зеленого (реактива № 5) в те- дается в разгаре различных инфекционных за-
чение 20 мин. Быстро ополаскивают дистиллиро- болеваний бактериальной и вирусной этиоло-
ванной водой. Окрашивают водным раствором гии. Период выздоровления сопровождается
азура А в течение 15—20 с. Смывают мазки нормализацией показателя. Изменения содер-
дистиллированной водой и высушивают. При жания лизосомального катионного белка кор-
микроскопии с желтым или оранжевым свето- релируют со степенью тяжести заболевания.
фильтром катионный белок в цитоплазме клеток
имеет вид ярко-зеленых гранул. Л и т е р а т у р а . Мазинг Ю. А., Старосель-
В о с п р о и з в о д и м о с т ь м е т о д а : ко- ская И. Я. Лаб. дело, 1981, № 10, стр. 582—
эффициент вариации V = 2,9 % для нормальных 584; Нагоев Б. С. Катионный белок лейкоцитов
134
и его значение: Методические указания.— Наль- ТЕСТ В О С С Т А Н О В Л Е Н И Я Н И Т Р О С И Н Е -
чик, 1982.— 67 с.; Пигаревский В. Е., Ма- ГО ТЕТРАЗОЛИЯ (НСТ-тест) дает возмож
зинг Ю. А. Лаб. дело, 1981, № 10, с. 579—582; ность судить о фагоцитарной и метаболической
Шубин М. Г. Цитология, 1974, № 10, с. 1321 — ф у н к ц и и гранулоцитов по образованию в цито-
плазме гранул формазана.
1322.
Метод Парка с соавт. в модификации
Л И П И Д Ы локализуются в цитоплазме кле-
Ю. И. Бажоры И соавт. П р и н ц и п . Погло-
ток главным образом в мембранах органелл и
щение гранулоцитами нитросинего тетразолия
обнаруживаются преимущественно в нейтро-
и восстановление его в формазан, выявляемый
фильных гранулоцитах. Играют в а ж н у ю роль,
в виде гранул синего цвета.
в проницаемости мембран. Цитохимическое ис-
Р е а к т и в ы . 1. Гепарин (20—25 ЕД/мл).
следование основано на применении красящих
2. 0,15 М фосфатный буфер рН 7,2. 3. 0,2 % рас-
веществ, растворяющихся в жирах (судан I I I ,
твор нитросинего тетразолия. 4. Изотонический
судан IV, черный судан и др.). Для выявления
раствор хлорида натрия. 5. Метанол. 6. 2 % рас-
нейтрального жира пользуются судаком I I I , ок-
твор метилового зеленого.
рашивающим ж и р в оранжевый цвет. Липоиды
С п е ц и а л ь н о е оборудование. 1.
выявляются лучше Суданом черным (черное ок-
Термостат. 2. Полистироловые пластинки (при-
рашивание).
меняемые для Р Т Г А ) .
Окраска судаком 1 1 1 (метод Гольдмана).
Х о д о п р е д е л е н и я . В лунку пластинки
П р и н ц и п . Растворение жиров и окраска су-
вносят 0,025 мл раствора гепарина и 0,1 мл кро-
даном I I I в оранжевый цвет.
ви, 0,05 мл фосфатного буфера и 0,05 мл рас-
Реактивы. 1. Формалиновый спирт
твора тетразолия. Содержимое л у н к и перемеши-
(1 часть формалина и 4 части 96% с п и р т а ) .
вают с помощью пипетки. Пластинку накры-
2. 70 % этиловый спирт (к 100 мл 96 % спирта
вают фильтровальной бумагой, смоченной изо-
прибавить 39,18 мл дистиллированной воды).
тоническим раствором хлорида н а т р и я и стек-
3. сх-Нафтол. 4. Раствор Судана (к 100 мл 70 %
лянной пластинкой соответствующих размеров.
спирта добавляют 20 мл дистиллированной
Для создания влажной камеры стеклянную пла-
воды, 1,2 г а-нафтола и в избытке судан I I I .
стинку п р и ж и м а ю т с помощью п р у ж и н н ы х за-
Раствор кипятят в течение 10 мин и фильтруют).
жимов. Инкубируют в термостате при 37 °С в те-
5. Краситель Романовского — Гимзы.
чение 15 мин, затем при комнатной температуре
С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е не
в течение 15 мин. После каждого этапа инку-
требуется.
бации смесь перемешивают пастеровской пипет-
Х о д о п р е д е л е н и я . Мазки крови фик-
кой (продувая воздух). Готовят мазки, высуши-
сируют в формалиновом спирте в течение 1 —
вают, фиксируют метанолом и докрашивают
3 мин. Красят в растворе Судана I I I в течение
метиловым зеленым.
10 мин. Помещают в 70 % этиловый спирт на
В о с п р о и з в о д и м о с т ь м е т о д а . Ко-
1 мин. Докрашивают красителем Романовско-
эффициент вариации у здоровых 9,2 %, у боль-
го — Гимзы или гематоксилином в течение 5—
ных — 6,6 % (не превышает допустимый).
10 мин. Промывают дистиллированной водой.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . У здоро-
Липиды выявляются в виде оранжевых зерен.
вых гранулы формазана обнаруживают в 7,2 ±
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . В мазках + 1,2% нейтрофилов.
периферической крови липиды содержатся в ци- Метод Стюарта и соавт. в модификации
топлазме нейтрофилов в виде обильной зернис- Б. С. Нагоева. П р и н ц и п см. Метод Парка.
тости. Большинство нейтрофилов (69—80%) у Р е а к т и в ы . 1. Гепарин — 10 ЕД в 1 мл
здоровых людей красятся интенсивно (+ + +). 0,9 % раствора хлорида натрия. 2. 0,1 % вод-
18—36 % дают окраску средней интенсивности ный раствор нитросинего тетразолия. 3. 50 %
( + + ) и 10% слабо окрашены ( + ). СЦК раствор формалина в 0,9 % растворе хлорида
липидов в неитрофилах 2,65±0,033. В мазках натрия. 4. 3,4 % раствор хлорида натрия. 5. 4 %
костного мозга в миелобластах обнаружено не- формалиново-спиртовой раствор. 6. 0,5 % раст-
большое содержание липидов, в промиелоцитах вор сафранина в 0,9 % растворе хлорида на-
их больше и по мере созревания нейтрофилов трия.
содержание липидов увеличивается.
С п е ц и а л ь н о е оборудование. 1.
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Повыше-
Центрифуга. 2. Термостат или водяная баня
ние содержания липидов в неитрофилах наблю-
на 37 °С.
дается при острых лейкозах и обострении хрони-
Х о д о п р е д е л е н и я . Смешивают 0,1 м л
ческих лейкозов. При острых лейкозах липиды
крови из пальца с 0,1 мл раствора гепарина.
в властных клетках обнаружены у больных при
Добавляют 0,1 мл раствора нитросинего тетра-
миелобластном и монобластном вариантах и не
золия. Инкубируют смесь на водяной бане (или
выявлены при лимфобластном остром лейкозе.
в термостате) при 37 °С в течение 10 мин.
При недифференцированном остром лейкозе
Фиксируют смесь в растворе формалина 3 м и н .
властные клетки л и ш ь в небольшом количестве
Добавляют 3 мл дистиллированной воды на 20 с
(2,2±0,82 %) содержат липиды. Уменьшение
(для лизиса эритроцитов). Добавляют 1 мл
липидов в неитрофилах выявлено п р и ревматиз-
3,4 % раствора хлорида натрия (для восста-
ме, воспалительных процессах.
новления изотонии) и оставляют при комнатной
Л и т е р а т у р а . Роскин Г. И., Левин- температуре на 10 мин. Центрифугируют 5 мин
сон Л. Б. Микроскопическая техника.— М., при 1000 об/мин. Удаляют пастеровской пипет-
1957, с. 257. кой надосадочную жидкость, из осадка готовят
135
мазки. Фиксируют мазки в формалиново-спирто- ных процессах, злокачественных новообразова-
вом растворе 30 с и докрашивают сафранином. ниях.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . У здоровых
Л и т е р а т у р а . Бажора Ю. И., Тимошев-
людей положительный НСТ-тест выявлен в
ский В. Н., Протченко П. 3., Головченко А. Н.
9,34 ± 0,4 % нейтрофилов. У здоровых СЦК
Лаб. дело, 1981, № 4, с. 198—200; Нагоев Б. С.,
составляет 13,3 ± 0,6.
Лаб. дело, 1983, № 8, 7—11; Park В. Н., Flr-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . НСТ-тест
kig S. M., Smitwick E. M. Lancet, 1968, vol. 2,
повышен при инфекционных заболеваниях бак-
p. 532—534; Stuart J., Gordon K, Lee T. J. Histo-
териальной этиологии, при гнойно-воспалитель-
chem. Cytochem., 1975, vol. 7, p. 477.



3.5. ТРОМБОЦИТЫ

рованная вода — 100 мл. 2. 1 % раствор окса-
Кровяные пластинки — тромбоциты — отно-
сятся к третьей группе клеточных элементов лата аммония. Раствор к и п я т я т и фильтруют.
крови. Обладают а н т и г е н н ы м и свойствами, Хранят в холодильнике. Сравнительный анализ
основная роль их — участие в гемостазе (см. разных разводящих жидкостей позволил счи-
тать лучшим 1 % раствор оксалата аммония,
раздел 4).
так как он дает быстрый и полный лизис
эритроцитов.
3.5.1. Подсчет количества С п е ц и а л ь н о е оборудование. I.
Микроскоп. 2. Фазово-контрастное устройство.
В практике при подсчете тромбоцитов ис- 3. Счетная камера Горяева. 4. Осветитель к
пользуют методы, основанные на двух п р и н ц и - микроскопу (ОИ-7, ОИ- 18).
пах: 1) непосредственный подсчет в крови (с по- Х о д о п р е д е л е н и я . Разводят исследуе-
мощью счетной камеры или счетчика) и 2) под- мую кровь в 200 раз; для этого в сухую пробирку
счет в мазках крови на определенное количество набирают 4 мл реактива 1 или 2 и 0,02 мл
эритроцитов с пересчетом на 1 мкл или 1 л крови. Перемешивают и оставляют на 25 —
с учетом общего количества эритроцитов в кро- 30 мин для гемолиза эритроцитов. Подготавли-
ви. Каждая группа методов имеет преимущества вают счетную камеру (см. подсчет лейкоцитов).
и недостатки. Существенным преимуществом Перемешивают разведенную кровь и заполняют
первой группы методов является их большая камеру; подносят каплю ее с помощью стеклян-
точность. Непосредственный подсчет тромбоци- ной палочки или пастеровской пипетки к краю
покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь
тов в крови удобен еще и потому, что не требует
равномерно без пузырьков воздуха заполняла
для расчета сведений о количестве эритроци-
тов, но подсчет в камере более трудоемкий, всю поверхность сетки, не затекая в бороздки.
Помещают счетную камеру во влажную камеру
поскольку тромбоциты в нативном виде пред-
ставлены мелкими и плохо контрастированными на 5 мин для оседания тромбоцитов (чашка
элементами. Недостатком этих методов является Петри с уложенной по краям смоченной водой
необходимость подсчета тромбоцитов в ближай- фильтровальной бумагой). Подготавливают
фазово-контрастное устройство в соответствии
шие часы после взятия крови. Подсчет тромбо-
с инструкцией, приложенной к нему. Произво-
цитов в мазках крови значительно уступает по
своей точности методам непосредственного под- дят подсчет тромбоцитов в 25 больших квадра-
тах.
счета в камере или с помощью счетчиков и
автоматов. Ошибки при подсчете в мазках крови Тромбоциты выглядят в счетной камере в
могут быть обусловлены несколькими п р и ч и н а - виде мелких, хорошо преломляющих свет
ми: плохое качество мазка и связанное с этим образований.
неравномерное распределение тромбоцитов, не- Расчет числа тромбоцитов проводят, исходя
точный подсчет эритроцитов в крови. Суще- из разведения крови (200), числа сосчитанных
ственное неудобство метода — необходимость квадратов (25) и объема одного большого ква-
одновременного подсчета тромбоцитов и эритро-
цитов в крови. Преимущество его — возможность
подсчета тромбоцитов в любое время независимо
от момента взятия крови. В качестве унифици-
рованных утверждены два метода, основанных
на обоих п р и н ц и п а х .
Унифицированный метод подсчета в камере
(1972). П р и н ц и п . Подсчет тромбоцитов в
1 мкл (или 1 л) с учетом разведения крови
и объема квадрата счетной сетки с примене-
нием фазово-контрастного устройства для X — число тромбоцитов в 1 мкл крови; а —
контрастирования тромбоцитов. число тромбоцитов, сосчитанных в 25 больших
Р е а к т и в ы . Применяют реактив 1 или 2. квадратах.
Практически число сосчитанных тромбоци-
1. Кокаина гидрохлорид — 3 г, натрия хло-
рид — 0,25 г, фурацилин — 0,025 г, дистилли- тов умножают на 2000.
136
В о с п р о и з в о д и м о с т ь . П о данным Подсчет в автоматическом счетчике. Исполь-
Т. А. Одесской и соавт., ошибка метода состав- зование счетчиков и автоматов существенно
ляет 6,5 %. облегчает подсчет тромбоцитов в крови, повы-
Унифицированный метод подсчета в мазках шает точность и ускоряет процедуру подсчета.
крови (по Фонио). П р и н ц и п . Метод основан Для автоматического подсчета количества
на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных тромбоцитов приспособлены отечественный ге-
мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом матологический комплекс КГ-2 и различные
на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания зарубежные счетчики: «Пикоскель» PS-4 фирмы
в этом объеме количества эритроцитов. «Medicor» (ВНР), «Coulter» 431A фирмы
Р е а к т и в ы . Применяют реактив 1 или 2. «LJC — I n s t r u m e n t » (Швеция), «Tromboco-
unter С» фирмы «Coultronics France SA» (Фран-
14 % раствор сульфата магния. 2. 6 % раствор
ция), автомат «Hemalog-8» фирмы «Technicon»
этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).
(США) и др.
С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . Не
Принцип работы большинства счетчиков
требуется.
Х о д о п р е д е л е н и я . Смешивают кровь основан на кондукторометрическом методе
(см. 3.3.1.).
с реактивом 1 или 2, для этого взятый капил-
ляром Панченкова реактив до метки «75» вно- Специальное оборудование.
сят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую Счетчик для тромбоцитов.
тем же капилляром, до метки «О». Содержимое Х о д и с с л е д о в а н и я соответствует ин-
струкции, приложенной к прибору.
пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки.
Фиксируют и окрашивают по Романовскому — Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . П о данным
Гимзе (см. 3.3.2) в течение 2—3 ч (при исполь- В. В. Соколова и И. А. Грибовой, количество
зовании реактива 1) и в течение 30—45 мин тромбоцитов у здоровых людей составляет.
(при использовании реактива 2). 180 • 109 6 — 320 • 1 0 6 / м к л (или 180 - 1 0 9-
Высохшие мазки микроскопируют с иммер- 320 • 1 0 / л ) .
сионным объективом, подсчитывая количество К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Снижение
тромбоцитов в тонких местах препарата (эри- количества тромбоцитов в крови — тромбоцито-
троциты должны быть расположены изолиро- пения — является важным симптомом при не-
ванно) . Тромбоциты в мазках выглядят в виде которых формах геморрагического диатеза.
фиолетовых округлых образований размером Наиболее выраженная тромбоцитопения (50 X
X 10 3 /мкл и ниже) наблюдается при обостре-
2—4 мкм с отчетливо видимой центрально рас-
положенной зернистой частью — грануломером нии тромбоцитопенической пурпуры. Тромбоци-
и более светлой периферической незернистой топения обычно сопутствует острым лейкозам
зоной — гиаломером. в развернутой стадии и особенно терминальной
Подсчет производят следующим образом: в стадии хронических лейкозов. Умеренная тромбоци-
топения (100 • 10 3 /мкл и более) наблюдается
каждом поле зрения микроскопа считают число
эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок при коллагенозах, циррозах печени. Повышение
до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 количества тромбоцитов в крови — тромбо-
эритроцитов. Для удобства счета и большей цитоз — характерно для миелопролифератив-
точности следует пользоваться специальным ных заболеваний, наблюдается при злокаче-
окуляром с уменьшенным полем зрения; при ственных новообразованиях. Высокий тромбоци-
тоз (1000 • 10 3 /мкл и более) может быть у
отсутствии окуляра можно уменьшить поле
зрения простым приемом (см. 3.3.6.). больных после спленэктомии.
Р а с ч е т : количество тромбоцитов на 1000
Л и т е р а т у р а . Одесская Г. А., Шитико-
эритроцитов составляет А°/оо. Зная число эри-
ва А. С., Папаян Л. П. Лаб. дело, 1970, № 2,
троцитов в 1 мкл (в 1 л) крови, легко подсчи-
с. 78—79; Соколов В. В., Грибова И. А. Гемато-
тать количество тромбоцитов в 1 мкл крови
логические показатели здорового человека.—
(в 1 л).
М.: Медицина, 1972.— 104 с.; Feissly R., Lu-
Например. А = 60%о; число эритроцитов din H. Rev. Hemat., 1949, vol. 4, p. 481; Fonio A.
5000000 в 1 мкл (5 • 10 6 /мкл или 5 • 10 | 2 /л). Dtsch. Ztschr. Chir., 1912, Bd. 117, S. 176.
Составляют пропорцию:
60— 1000;
X — 5 000 000, откуда 3.5.2. Исследование функций
тромбоцитов

В клинической практике наиболее распро-
странены исследования агрегационных, адгезив-
ных и других свойств тромбоцитов (см. раз-
= 300 • 1000 мкл (300 • 103/мкл или 300 • 109/л). дел 4).




137
3.6. И З М Е Н Е Н И Я КРОВИ ПРИ ЛЕЙКОЗАХ

Исследование крови имеет особоенно важное клеток может варьировать от единичных (5—
диагностическое значение при гемобластозах. 10%) до значительного числа (70—80%).
Поэтому во всех случаях, когда клинически Соответственно резко сокращается число зрелых
возникает подозрение на лейкоз (слабость, лихо- гранулоцитов. Количество незрелых грануло-
радка неясного генеза, геморрагический синд- цитов чаще небольшое или они вовсе отсут-
ром, увеличение печени, селезенки, лимфати- ствуют. К последним случаям применим термин
ческих узлов, кожные поражения и др.), необ- « h i a t u s leukemicus».
ходим общий клинический анализ крови. Значительно реже встречаются так называе-
Показатели красной крови. Появление ане- мые алейкемические формы (стадии) острых
мии — ранний лабораторный симптом острых лейкозов, когда в периферической крови бласт-
лейкозов. При этом анемия чаще нормохромно- ные клетки отсутствуют. Диагноз в этих случаях
го типа. При н а л и ч и и кровопотерь развивается может быть установлен после исследования
гипохромная микроцитарная анемия. При хро- пунктата костного мозга (см. 3.7).
нических лейкозах анемия обычно развивается Помимо количественных сдвигов лейкоци-
уже в стадии развернутых клинико-гематологи- тарной формулы, важное диагностическое зна-
ческих проявлений, а в начале заболевания чение имеет изменение морфологических особен-
показатели красной крови обычно не изменены. ностей клеток. Так, при острых лейкозах власт-
Исключение составляют лейкозы миелопролифе- ные клетки могут иметь неправильную форму.
ративной природы, особенно эритремия, при Отличаются полиморфным ядром, с укрупнен-
которой р а н н и м и и основными лабораторными ными нуклеолами, включениями в цитоплазме.
симптомами являются эритроцитоз, повышение При разных формах острых лейкозов морфо-
содержания гемоглобина и гематокрита в крови. логия властных клеток различна. При остром
Умеренный эритроцитоз может быть в начале миелобластном и миеломонобластном лейкозе
доброкачественного сублейкемического миелоза ядра клеток круглые, иногда неправильной
(миелофиброза), который затем снижается до формы, в цитоплазме содержат азурофильную
нормальных цифр, а в дальнейшем, к терми- зернистость и нередко тельца Ауэра. При остром
нальной стадии, сменяется анемизацией. промиелоцитарном лейкозе отмечается выра-
При лимфопролиферативных заболеваниях женный полиморфизм властных клеток, ха-
в начальной стадии показатели красной крови рактерна крупная фиолетовая зернистость,
нормальны, по мере прогрессирования процесса обильно заполняющая цитоплазму клеток, часто
развивается анемия. Малокровие обычно бывает встречаются тельца Ауэра.
нормохромного, нормоцитарного или макроци- При остром монобластном лейкозе властные
тарного типа, с небольшим повышением числа клетки крупные с бобовидным ядром и скудной
ретикулоцитов, иногда умеренным нормобласто- мелкой зернистостью в цитоплазме. При остром
зом. Следует иметь в виду возможность разви- лимфобластном лейкозе бласты меньших разме-
тия при хронических лейкозах, особенно при ров, ядро округлое с 1—2 нуклеолами, цито-
хроническом лимфолейкозе, аутоиммунной гемо- плазма обычно не содержит зернистости. Мор-
литической анемии. В этих случаях выявляется фологические черты властных клеток не всегда
анемия нормохромного типа с высоким содержа- надежны для дифференциации различных форм
нием ретикулоцитов в крови, нередко появле- острых лейкозов. С этой целью обычно проводят
нием нормобластов в мазках периферической цитохимические исследования. Для практиче-
крови. ских целей может быть достаточным небольшой
Лейкоциты и лейкоцитарная формула. Общее набор цитохимических реакций (PAS — ре-
количество лейкоцитов в крови резко изменяет- акция, исследование активности пероксидазы,
ся при лейкозах. Особенно выраженные измене- неспецифических эстераз). В табл. 27 приведены
3
ния в виде гиперлейкоцитоза (100-10 /мкл, результаты исследования властных клеток при
9
или 100-10 /л и выше) наблюдаются при наиболее часто встречающихся формах острых
хроническом миелолейкозе, хроническом лимфо- лейкозов.
лейкозе. Умеренный лейкоцитоз (до 15 • 10 9 - Для хронических лейкозов миелопролифе-
2 0 - 10 9 /л) может быть при эритремии, хро- ративной природы характерно наличие большо-
ническом моноцитарном лейкозе, сублейкеми- го числа гранулоцитов (до 80—90 %) в мазках
ческом миелозе. В последнем случае может крови при уменьшении лимфоцитарных и моно-
наблюдаться и лейкопения. При парапротеине- цитарных элементов. При хроническом миело-
мических гемобластозах чаще развивается лейкозе в лейкоцитарной формуле находят все
лейкопения, но может быть и нормальное число переходные формы от властных клеток до зрелых
лейкоцитов в крови. Изменения числа лейкоци- нейтрофилов. Часто отмечают увеличение числа
тов при острых лейкозах непостоянны; наряду эозинофилов и базофилов. В развернутой клини-
с нормальным количеством может наблюдаться ко-гематологической стадии хронического мие-
лейкопения и умеренный лейкоцитоз. Наиболь- лолейкоза обнаруживают следующую лейко-
шее значение в лабораторной диагностике цитарную формулу: миелобласты 1—3 %, про-
лейкозов имеет исследование лейкоцитарной миелоциты 3—8 %, нейтрофильные миелоциты
формулы (табл. 26). Важнейший признак острых 5—10 %, нейтрофильные метамиелоциты 10—
лейкозов появление в мазках крови властных 15 %, нейтрофильные палочкоядерные 12—
клеток — бластемия. Количество властных 15 %, нейтрофильные сегментоядерные 25—

138
Т а б л и ц а 26. Изменения лейкоцитарной формулы при некоторых лейкозах

Властные Зрелые
Незрелые
Лимфоциты Моноциты
Форма лейкоза гранулоциты
клетки гранулоциты

Острые лейкозы В большом В небольшом Значительно Нормальны Снижены
количестве снижены или снижены
количестве
»
Хронический Единичные, Снижены
В значитель- Несколько
миелолейкоз при властном ном количест- снижены
ве
кризе — резко
повышены
В небольшом Снижены или Снижены или
Сублейкеми- Единичные Иногда сни-
нормальны
ческий миелоз жены нормальны
количестве
Обычно от- Отсутствуют Увеличены Нормальны Нормальны
Эритремия
сутствуют или снижены или снижены
или единичные
Хронический Единичные Часто отсут- Резко сниже- Резко увели- Снижены
ны
лимфолейкоз ствуют чены
Хронический Нормальны
То же
Единичные Единичные Резко увели-
м о н о ц и т а р н ы й или отсут- или отсут- или снижены чены
лейкоз ствуют ствуют




Хронический лимфолейкоз имеет типичные
35 %, эозинофилы незрелые 1—3 %, эозинофилы
изменения лейкоцитарной формулы в виде выра-
зрелые 2—6 %, базофилы 1—3 %, лимфоциты
женного лимфоцитоза, достигающего 80—90 %.
5—10 %, моноциты 2—3 %. Прогностически
При этом лимфобласты не превышают 0,5—2 %,
неблагоприятным признаком является увеличе-
пролимфоциты — 3—5 %. Остальные лимфоид-
ние незрелых форм, базофилов и уменьшение
ные элементы представлены зрелыми лимфоци-
зрелых нейтрофилов.
тами. Число зрелых нейтрофилов резко умень-
шено (8—15%), незрелые гранулоциты, как
правило, отсутствуют или единичные (0,5—1 %).
Т а б л и ц а 27. Цитохимическая характеристи- Характерным морфологическим признаком л и м -
ка властных клеток при острых лейкозах фопролиферации является наличие в мазках
крови теней Боткина — Гумпрехта. Лейкемиче-
Активность
ские лимфоциты нередко морфологически не
а-наф- хлора- отличаются от нормальных, обычно узкоплаз-
Форма ШИК-
перок- тилаце- цетат- менные, иногда голоядерные формы, реже с би-
лейкоза реакция
сидазы тат-эс- эсте- полярно вытянутой цитоплазмой. Значительный
теразы разы полиморфизм клеток выявляется при волосато-
клеточном лейкозе, когда клетки имеют неров-
_
_ ные контуры (как бы «фестончатые»), ци-
Миело- + +
топлазма интенсивно и неравномерно окра-
бластный (диффуз-
шена.
ное рас-
При плазмоцитоме и макроглобулинемии
положе-
Вальденстрема изменения лейкоцитарной фор-
ние)
мулы не столь постоянны, как при хроническом
То же
Промиело- + ± +
лимфолейкозе. Они могут либо отсутствовать,
цитарный
± либо характеризоваться умеренным лимфоци-
±
Монобла- ±
+
тозом, моноцитозом. При плазмоцитоме в маз-
стный (диффуз-
ках крови может быть небольшое количество
ное рас-
плазматических клеток, значительное увеличе-
положе-
ние их наблюдается редко. Хронический моно-
ние)
цитарный лейкоз отличается значительным

Лимфо- —
±
+
моноцитозом, в лейкоцитарной формуле мо-
( гра ну-
бластный
гут быть единичные монобласты и промо-
лярное
ноциты.
располо-
Тромбоциты. Тромбоцитопения наблюдает-
жение)
ся обычно при острых лейкозах и в развернутой,
особенно терминальной стадии хронических
лейкозов. При миелопролиферативных заболе-
ваниях в начальной стадии часто встречается
В терминальной стадии при развитии власт-
тромбоцитоз. М. С. Дульцин отметил этот
ного криза резко увеличивается количество
симптом у 75 % больных в начальной стадии
властных клеток. При эритремии отмечается
хронического миелолейкоза. Тромбоцитоз,
нейтрофилез обычно с палочкоядерным сдвигом.

139
иногда з н а ч и т е л ь н ы й , является постоянным ных для и с к л ю ч е н и я миеломной болезни,
симптомом эритремии. болезни Вальденстрема.
Скорость оседания эритроцитов (СОЭ).
Небольшое увеличение СОЭ может быть при Л и т е р а т у р а . Абрамов М. Г. Гематоло-
острых и хронических лейкозах, хотя это далеко гический атлас.— М.: Медицина, 1979; Воро-
не обязательный гематологический признак. бьев А. И. Бриллиант М. Д. Острые лейкозы.—
При выраженной интоксикации СОЭ увеличена, В кн.: Руководство по гематологии / Под ред.
при гнойно-воспалительных осложнениях резко А. И. Воробьева, Ю. И. Лорие, М., 1979, с. 155;
увеличена. Характерно резкое увеличение СОЭ Дульцин М. С. Хронический миелоидный лей-
(50—70 м м / ч ) при парапротеинемических гемо- коз.— В кн.: Лейкозы. М.: Медицина, 1965,
бластозах. Этим симптомом часто манифести- с. 215; Морозова В. Т. Лабораторная диагности-
рует заболевание и требует обследования боль- ка лейкозов.— Л.: Медицина, 1977.




3.7. КОСТНЫЙ МОЗГ
Исследование костного мозга проводят с Х о д о п р е д е л е н и я . Пунктат костного
диагностической целью для подтверждения или мозга разводят в 200 раз, для чего в пробирку
установления диагноза, главным образом раз- с 4 мл слабого раствора уксусной кислоты вносят
л и ч н ы х форм гемобластозов и анемий. Диагно- пипеткой 0,02 мл пунктата (в таком виде пробир-
стическое значение имеет исследование костного ка должна быть для дальнейшего исследования
мозга при поражении его лимфогранулемато- доставлена в лабораторию). Содержимое
зом, туберкулезом, болезнью Гоше, Ниманна — пробирки тщательно перемешивают и заполняют
Пика, метастазами рака. Широко проводят счетную камеру (заполнение камеры и ее под-
исследование костного мозга при острых лейко- готовку к работе см. 3.2.1). После оседания
зах с прогностической целью, для контроля за форменных элементов (через 1—2 мин) под-
считывают миелокариоциты, т. е. все ядерные
терапией.
Для исследования костного мозга произво- элементы в 100 больших квадратах ( а н а л о г и ч н о
дят пункцию грудины или подвздошной кости подсчету числа лейкоцитов в крови).
с последующим цитологическим анализом мазков Рассчитывают количество миелокариоцитов
пунктата, а также трепанобиопсию подвздошной на 1 мкл пунктата по следующей формуле:
кости с последующим гистологическим исследо-
ванием срезов костного мозга.


3.7.1. Пункция костного мозга
где X — число миелокариоцитов в 1 мкл пункта-
Пункцию грудины или подвздошной кости та; п — количество миелокариоцитов в 100
проводят в процедурном кабинете с соблюде- больших квадратах; 200 — разведение; 250 —
нием правил асептики. Техника пункции подроб- множитель для приведения к 1 мкл, так как
но описана. Для проведения качественного
исследования необходимо обратить внимание на
тщательное обезвоживание иглы Кассирского и
ш п р и ц а , так как примесь воды повреждает
Практически число подсчитанных в 100 боль-
клеточные элементы.
ших квадратах миелокариоцитов умножают
Учитывая быструю свертываемость содержи-
на 500.
мого пунктата, необходимо его по получении
тотчас развести (для подсчета кариоцитов) и Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Количество
быстро приготовить мазки. Дальнейшую обра- миелокариоцитов колеблется в широких пре-
ботку мазков пунктата производят так же, как делах (41600—195000; отклонения 1,5 S) и
и мазков крови. При необходимости клетки в большой степени зависит от разведения пунк-
костномозгового пунктата могут быть окрашены тата кровью.
цитохимическими методами (см. 3.4.5). К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Количе-
ство миелокариоцитов дает ориентировочное
представление о клеточности костного мозга.
3.7.2. Подсчет миелокариоцитов Увеличение количества миелокариоцитов ха-
рактерно главным образом для лейкозов миело-
П р и н ц и п . Разведение пунктата, подсчет пролиферативной природы, особенно выражено
клеток в счетной камере в определенном коли- оно при хроническом миелолейкозе. Умеренное
честве квадратов с последующим пересчетом на увеличение наблюдается после кровопотери,
1 мкл пунктата. при гемолитических анемиях. Уменьшение коли-
Р е а к т и в ы . 3—5 % раствор уксусной кис- чества ядерных клеток свидетельствует об апла-
лоты. зии кроветворения, может быть при агрануло-
Специальное оборудование. цитозе, после лучевой и цитостатической те-
Счетная камера Горяева. 2. Микроскоп. рапии.

140
Л и т е р а т у р а . Грибова И. А. Гематоло- ним симптомом хронических лейкозов миелопро-
лиферативной природы, особенно эритремии.
гическая норма.— В кн.: Руководство по гема-
Мегакариоцитоз костного мозга характерен
тологии / Под ред. А. И. Воробьева, Ю. И. Ло-
также для геморрагической тромбоцитемии,
рие. М.: Медицина, 1979, с. 54.
может наблюдаться после кровопотери, при
раке, циррозах печени с гиперспленизмом,
3.7.3. Подсчет мегакариоцитов тромбоцитопенической пурпуре. Уменьшение
числа мегакариоцитов характерно для острых
Количество мегакариоцитов можно оценить лейкозов, лимфопролиферативных заболеваний
и особенно в резкой степени — при апласти-
ориентировочно, просматривая под малым уве-
личением микроскопа мазки пунктата костного ческих анемиях.
мозга или срезы трепаната костного мозга, или Л и т е р а т у р а . Крылов А. А., Дмитриев
подсчитывать число клеток в счетной камере. В. И. Воен.-мед. журн., 1970, № 1, с. 80—81;
Подсчет в счетной камере. П р и н ц и п . Малаховский Ю. Е. Лаб. дело, 1964, № 12,
Разведение пунктата и подсчет гигантских кле- с. 729—733; Ярустовская Л. Э. Пробл. гематол.
ток костного мозга в счетной камере в опреде- и перелив, крови, 1966, № 11, с. 41—46.
ленном количестве квадратов с последующим
пересчетом на 1 мкл пунктата.
Р е а к т и в ы . 3—5 % раствор уксусной кис-
3.7.4. Морфологическое исследование
лоты.
форменных элементов с подсчетом
С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . Счет-
миелограммы
ная камера Фукса — Розенталя. 2. Микроскоп.
Х о д о п р е д е л е н и я . Разводят пунктат
костного мозга в 20 раз, для этого предвари- Проведению морфологического исследова-
ния пунктата костного мозга должны предше-
тельно вносят в пробирку 0,4 мл раствора ук-
ствовать подготовка предметных стекол, при-
сусной кислоты и затем 0,02 мл пунктата (в та-
готовление и окраска препаратов аналогично
ком виде пробирку доставляют в лабораторию).
приготовлению и окраске препаратов перифери-
Подсчет мегакариоцитов (гигантских клеток)
ческой крови ( у н и ф и ц и р о в а н ы — см. 3.3.2).
производят во всей сетке; при окончательном
В табл. 28—31 приведены характеристики
расчете на 1 мкл пунктата умножают на разве-
и основные морфологические признаки эритро-
дение пунктата (20) и делят на объем камеры
кариоцитов, незрелых миеломоноцитарных эле-
(3,2).
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . У здоровых ментов и их предшественников, незрелых лим-
взрослых людей количество мегакариоцитов со- фоидных элементов и их предшественников и
ставляет 63 ± 10 или 83 ± 13,86 в 1 мкл пункта- мегакариоцитарных элементов. Зрелые грануло-
циты, лимфоциты, моноциты в мазках пунктата
та. У детей в возрасте 5 мес — З'/2 года коли-
костного мозга не отличаются от таковых пери-
чество мегакариоцитов выше, чем у взрослых
(116 ± 10,8 в 1 мкл пунктата). ферической крови (см. табл. 25).
Метод Аринкина. П р и н ц и п . Дифферен-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Увеличе-
цировка форменных элементов в окрашенных
ние количества мегакариоцитов является ран-

Т а б л и ц а 28. Характеристика эритрокариоцитов костного мозга
Нормобласт
Признаки Эритробласт Пронормобласт полихромато-
базофильный оксифильный
фильный

8—12
12—20 10—20 9—18 8-11
Размер, мкм

Ядро:
Крупные нити с Колесовидная Пикнотичная
Сетчатая или Комковатая
структура
тенденцией к
зернистая с
хроматина без нуклеол
колесовидной
нуклеолами
Темно-фиолето-
Светло-фиоле- Фиолетовая Темно-фиоле-
окраска Светло-фиоле-
товая вая
товая товая
Центральное, Центральное Эксцентричное
расположение Центральное Центральное
иногда эксцен- или эксцент-
ричное
тричное
Цитоплазма:
Широкая Широкая
Узкая Узкая Относительно
размер
широкая
Серовато-голу- Бледно-розо-
Синяя с более Светло-синяя
Интенсивно
окраска
бая или серо- вая, розовая
синяя со свет- светлой пери-
вато-розовая
лой перинукле- нуклеарной
арной зоной зоной


141
Т а б л и ц а 29. Характеристика незрелых миеломоноцитарных элементов и их предшественников
Миелобласт
Признаки Промиелоцит Миелоцит Метамиелоцит Монобласт Промоноцит
15—20 10—18 15—20
Размер, мкм 18—25 10—16 16—25

Круглое Круглое или Круглое, Бобовидное, Круглое, Круглое с
Ядро:
крупное овальное овальное волнистыми
подковообраз- бобовидное
форма
или с вдав- ное с волнисты- контурами,
лением ми контура- иногда поли-
ми морфное
Нежная, Мелкосет- Глыбчатая Неравномер- Мелко сет-
структура Крупно-зер-
мелкосетча- чатая, иног- ная, глыбчатая чатая нистая
тая да с утол-
щенными
нитями
2 — 5, отчет- 1 — 3, отчет- Не видны
нуклеолы Не видны 2—3, отчет- Не видны
ливые ливая
ливые
Светло- Фиолетовая Светло-
окраска Светло- Фиолетовая Светло-
фиолетовая фиолетовая фиолетовая фиолетовая
Цитоплазма:
Узкая Узкая, иног- Относи- Относитель- Узкая Умеренно
зона
да широкая тельно ши- но широкая широкая
рокая
Голубая, Голубая, Светло-ро- Светло-розовая Синяя, свет- С в е т л о - с и -
окраска
светло-си- сероватая зовая, свет- ло-синяя няя, серова-
няя тая
ло-фиолето-
вая
Нейтрофи- Нейтрофи- Нейтрофиль- Непостоян- Непостоян-
зернистость Непостоян-
ные — мелкая но, иногда но, иногда
но, одиноч- льные —
льные —
бледно-фи- бледно-фиоле- одиночные, мелкая пы-
обильная,
ные мелкие
олетовая, товая; эозино- мелкие левидная,
гранулы крупная,
фиолетовая; мелкая с гранулы светло-фио-
фильные —
эозинофиль- более круп- крупная; розо- летовая
ными грану- вая, обильная;
ные —
лами; эози- базофильные —
обильная,
нофильные — крупная, не-
крупная,
фиолетовая, крупная ро- равномерная,
с эозинофи- зовая, жел- необильная,
льными гра- товатая с от- фиолетовая
нулами; ба- дельными
зофильные базофиль-
с темно-фи- ными грану-
лами; базо-
олетовыми
фильные —
гранулами
неравномер-
ная, круп-
ная, нео-
бильная,
фиолетовая



мазках пунктата с выведением миелограммы, ческие клетки, клетки Березовского — Штерн-
т. е. процентного содержания различных миело- берга, клетки Гоше и др.). В случае выявления
кариоцитов. таких (или других) патологических элементов
Р е а к т и в ы . 1. Иммерсионное масло. 2. Ди- необходимо нанести каплю масла на препарат,
этиловый эфир. перевести на иммерсионный объектив и рас-
С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е . 1. смотреть морфологию этих элементов.
Микроскоп. 2. 11-Клавишный счетчик для под- После просмотра мазков под малым увели-
счета лейкоцитарной формулы. чением наносят каплю иммерсионного масла
Ход определения. Просматривают на мазок, погружают в него иммерсионный
препараты под малым увеличением для ориенти- объектив и приступают к дифференцированию
ровочного представления о клеточности костного форменных элементов. Для подсчета миелограм-
мозга, н а л и ч и и и числе мегакариоцитов, для мы необходимо дифференцировать не менее 500
исключения патологических элементов (компле- миелокариоцитов в разных участках препарата.
ксы атипических клеток или одиночные атипи- Подсчитывают все встречающиеся в поле зрения

142
Т а б л и ц а 30. Характеристика незрелых лимфоидных элементов и их предшественников
Признаки Лимфобласт Пролимфоцит Проплазмоцит
Плазмобласт
Размер, мкм 12—20 16—25 10—20
10—15

Ядро:
форма Круглое, овальное Круглое, овальное Круглое Круглое, эксцент-
рично расположено
Нежная, мелко-
структура Крупноглыбчатая Мелкосетчатая Крупноглыбчатая,
комковатая иногда колесовид-
ная
нуклеолы 1 — 2, отчетливы Непостоянны 1 — 2, отчетливы Непостоянны
окраска Светло-фиолето- Светло-фиолето- Светло-фиолето- Фиолетовая
вая вая
вая, фиолетовая
Цитоплазма:
зона: Узкая Узкая
Относительно Широкая
широкая
окраска Синяя, светло- Светло-синяя Интенсивно синяя Интенсивно синяя,
синяя с более свет- с перинуклеарным сероватая, иногда
лой перинуклеар- просветлением с перинуклеарным
ной зоной просветлением


Т а б л и ц а 31. Характеристика мегакариоцитарных элементов
Мегакариоцит
Мегакарио- Промега-
Признак полихромато-
бласт кариоцит оксифильный
базофильный фильный
40—50 60—70
18—20 20—25 30—40
Размер, мкм

Ядро:
с Многолопаст- Многолопаст-
С бухтообраз- Лопастное,
форма Округлое
ными вдавле- бухтообразны- ное, гиперсег- ное, гиперсег-
ми вдавления- ментированное ментированное
ниями
ми
В виде клубка В виде клубка Плотная, пикно-
Мелкосетчатая, В виде клубка
структура
или шаров типичная
в виде клубка
с видимыми ну-
клеолами
окраска Бледно-фиоле- Фиолетовая Фиолетовая Темно-фиоле- Темно-фиоле-
товая товая
товая
Узкая, иногда
Цитоплазма:
Широкая
с отростками Неширокая Широкая
Узкая, иногда
зона
с отростками
Голубая, свет- Светло-голубая Розоватая
Синяя, светло- Синяя
окраска
ло-синяя
синяя
Азурофильная, Обильная, не- Мелкая, обиль-
Обычно отсут- Обычно отсут-
зернистость

<<

стр. 7
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>