<<

стр. 9
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

хронометрическая и/или структурная гипокоагу- у к а з а н и я ) . — Б а р н а у л , 1975, с. 83—87; Сятков-
ляция (замедленное свертывание и/или образо- ский В. А., Василенко Л. П., Применение ауто-
вание сгустка с недостаточно высоким электри- коагуляционного теста в клинических лабора-
ческим сопротивлением), хронометрическая и/ торных исследованиях.— Лаб. дело, 1981, № 8
или структурная гиперкоагуляция (ускоренное с. 459—462.
свертывание и/или образование сгустка с чрез-
мерно высоким электрическим сопротивлением),
а также гипофибринолиз и гиперфибринолиз
(замедленное или ускоренное уменьшение элект-
4.4.10. Тест генерации тромбопластнна
рического сопротивления образовавшегося сгуст-
ка крови после достижения максимальных зна- Тест Биггс — Дугласа (модифицированный).
чений). П р и н ц и п . Определяется активность тромбо-
пластина, образующегося в смеси ингредиентов,
Л и т е р а т у р а . Ватмахер У. А., Толстопя-
приготовленных из исследуемой крови, и кор-
това И. А., Пьянкова Т. И. Коагулограф — но-
рекция выявленных нарушений аналогичными
вый портативный прибор для исследования
ингредиентами нормальной крови. При нормаль-
системы свертывания крови.— Лаб. дело, 1969,
ном содержании в крови факторов V и X, что
№ 8, с. 496—499.
устанавливается путем дополнительного опре-
деления протромбинового времени, этот тест
позволяет выявлять и дифференцировать недо-
4.4.9. Аутокоагуляционный тест
статочность плазменных факторов V I I I , IX и
XI + ХП, а также фактора 3 тромбоцитов.
Исследуется динамика нарастания и после-
Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-
дующего снижения тромбопластин-тромбино-
рия (см. 4.1). 2. 0,025 моль/л раствор хлорида
вой активности в испытуемой плазме при ее
кальция (см. 4.4.2). 3. 0,85 % раствор хлорида
рекальцификации в присутствии гемолизата эрит-
роцитов обследуемого (рис. 7). Аномальные ре- натрия. 4. Нитратная нормальная пул-плазма,
162
ка больного + суспензия тромбоцитов здоро-
субстратная. Смесь равных количеств 5—10 об-
вого; 4-й ряд (тромбоцитарный) — адсорбиро-
разцов бестромбоцитной плазмы здоровых лю-
ванная плазма здорового + сыворотка здоро-
дей (готовят заранее и хранят небольшими
вого + суспензия тромбоцитов больного; 5-й
порциями при —20 °С). 5. Плазменный компо-
ряд (контрольный) — адсорбированная плазма
нент здорового человека. Смешивают 3 г геля
здорового + сыворотка здорового + суспензия
гидроокиси алюминия фабричного производства
тромбоцитов здорового.
с 4 мл дистиллированной воды, а затем разводят
Т е с т и р о в а н и е всех рядов проводят
буфером (см. 4.3.5) в соотношении 1 : 4 (разве-
одинаково, начиная с контрольного ряда. В 5—
дение в 5 раз). После этого к 4,5 мл цитратной
6 пробирок разливают по 0,1 мл раствора хло-
нормальной бестромбоцитной плазмы добав-
рида кальция и устанавливают пробирки в во-
ляют 0,5 мл приготовленной суспензии гидро-
дяную баню. Ставят туда же пробирку с 0,6—
окиси алюминия, ставят смесь в водяную баню
0,8 мл субстратной плазмы (пул-плазмы). В но-
при 37 °С и помешивают стеклянной палочкой
вую пробирку набирают 0,2 мл адсорбированной
в течение 3 мин. Далее смесь центрифугируют
нормальной плазмы, 0,2 мл нормальной сыво-
при 3000 об/мин в течение 5—10 мин, отсасы-
ротки и 0,2 мл нормальной суспензии тромбо-
вают адсорбированную плазму (протромбиновое
цитов. Компоненты перемешивают, ставят про-
время такой плазмы должно быть не менее
бирку в водяную баню, добавляют 0,2 мл раст-
2—2'/2 мин; если оно короче, то процедуру ад-
вора хлорида кальция и немедленно включают
сорбции повторяют), разливают небольшими
секундомер. Через 2 мин 0,1 мл смеси переносят
порциями в пластиковые или стеклянные сили-
в одну из пробирок, содержащую 0,1 мл раст-
коновые пробирки, укупоривают и заморажи-
вора хлорида кальция, и вводят туда же 0,1 мл
вают при —20 °С. В адсорбированной плазме
прогретой субстратной плазмы. В момент добав-
сохраняются факторы I, V, V I I I , XI и X I I , но
ления субстратной плазмы включают второй
отсутствуют факторы II, V I I , IX и X. Адсорби-
секундомер и отмечают время образования
рованную плазму (алюминиевую) перед работой
сгустка. Исследование повторяют через 4; 6;
размораживают и разводят 0,85 % раствором
8; 10 и 12 мин инкубации смеси (результат обыч-
хлорида натрия в соотношении 1 : 4 (разведение
но регистрируется на 4-й и 6-й минуте). Подоб-
в 5 раз). 6. Сывороточный компонент здорового
ным образом исследуют и все остальные ряды.
человека. Готовят заранее сыворотку крови здо-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Наиболее
рового человека (см. 4.1), расфасовывают ее по
короткое время варьирует в пределах 7—11 с
1—2 мл и замораживают при — 20 °С. В ней
и регистрируется на 4-й или 6-й минуте инку-
сохраняются факторы V I I , IX, X, XI и XII, но
бации.
отсутствуют факторы II, V и V I I I . Перед работой
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Возмож-
нормальную сыворотку размораживают и раз-
ные результаты теста в зависимости от недоста-
водят 0,85 % раствором хлорида натрия в соот-
точности охватываемых им факторов (включая
ношении 1 : 9 (разведение в 10 раз). 7. Тромбо-
формы, обусловленные появлением ингибиторов
цитарный компонент здорового человека. Оса-
факторов) представлены в табл. 37.
док тромбоцитов, получаемый после центрифу-
гирования 5—6 мл тромбоцитной плазмы при
4 °С в течение 15—20 мин при 3000—4000 Т а б л и ц а 37. Результаты теста генерации
тромбопластина при различных нарушениях
об/мин и отсасывания бестромбоцитной плазмы,
свертывания крови
заливают 5—6 мл охлажденного (4 °С) 0,85 %
раствора хлорида натрия, взбалтывают и цент-
Показания теста при различных наруше-
рифугируют на холоде при том же режиме. Над-
ниях свертывания крови
осадочную жидкость отбрасывают, еще дважды
повторяют процедуру отмывания тромбоцитов, дефицит факторов
сле-
а затем к осадку тромбоцитов добавляют 0,85 % ингибито-
дуе-
раствор хлорида натрия в объеме, равном объ- фактор ры факто-
мые
ему взятой тромбоцитной плазмы, и с помощью 3 тром- ров свер-
ряды IX XI + XII
VIII
стеклянной палочки готовят суспензию тромбо- боци- тывания
тов
цитов.
О б о р у д о в а н и е . 1. Водяная баня на
37 °С. 2. Секундомеры. 1-й Нару- Нор- Нор- Нор- Наруше-
Материал для исследования. ма ние
ма ма
шение
»
» »
2-й Нор- Нару-
Плазменный, сывороточный и тромбоцитарный
ма шение
компоненты обследуемого (готовят так же, как »
» »
3-й Нару- Наруше-
соответствующие компоненты здорового чело-
ние
шение
века). 4-й Нор- Нор- Норма Нару- Норма
Х о д о п р е д е л е н и я . Составляют сле- ма
ма шение
дующие 5 рядов смесей: 1-й ряд (плазмен-
ный) — адсорбированная плазма больного +
+ сыворотка здорового + суспензия тромбо-
цитов здорового; 2-й ряд (сывороточный) — П р и м е ч а н и е . Тест генерации тромбо-
адсорбированная плазма здорового + сыво- пластина чувствительнее к нарушениям
ротка больного + суспензия тромбоцитов здо- тромбопластинообразования, чем АЧТВ (см.
рового; 3-й ряд (плазменно-сывороточный) — 4.4.3) и основанные на его определении кор-
адсорбированная плазма больного + сыворот- рекционные пробы, но и он выявляет лишь
163
4.4.11. Одностадийное
значительный дефицит факторов V I I I , IX,
XI + X I I и фактора 3 тромбоцитов. П р и определение факторов V I I I , IX, XI и X I I
легких формах недостаточности факторов
свертывания крови решающее значение мо- Методы основаны на определении АЧТВ
жет иметь их количественное определение (см. 4.4.3) разведенной исследуемой плазмы при
с применением специфических «дефицитных» компенсации возможного дефицита всех фак-
плазм. Принимая во внимание частоту раз- торов, влияющих на этот показатель, кроме
л и ч н ы х форм гемофилии, количественное оп- определяемого. В качестве примера описывается
ределение факторов свертывания крови сле- определение активности фактора V I I I (антиге-
дует проводить, н а ч и н а я с фактора V I I I , мофильного глобулина, антигемофильного фак-
а затем факторов IX, XI и X I I . Вопрос о тора А ) , поскольку дефицит этого фактора (ге-
количественном определении фактора X ре- мофилия А) является наиболее частой формой
ш а е г с я в зависимости от результатов опреде- наследственной коагулопатии.
ления протромбинового и лебетокс-времени Унифицированный метод определения актив-
(стипвен-времени) (см. 4.4.4 и 4.4.5). ности фактора V I I I (1974). П р и н ц и п . Оп-
ределяется АЧТВ (см. 4.4.3) исследуемой раз-
Л и т е р а т у р а . Балуда В. П., Барка-
веденной плазмы п р и компенсации субстратной
гаи 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные
плазмой возможного дефицита всех факторов,
методы исследования системы гемостаза.—
кроме фактора V I I I .
Томск, 1980, с. 146—152.
Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-
С п е ц и ф и ч е с к и е методы иссле- р и я (см. 4 . 1 ) . 2. 0,9% (0,85%) раствор хло-
дования коагуляционного гемо- рида н а т р и я . 3. Барбиталово-солевой буфер
с т а з а . К числу специфических относят мето- рН 7,5: хлорид натрия — 7,3 г, диэтилбарбиту-
ды, характеризующие концентрацию и / и л и ак- ровая кислота — 2,76 г, диэтилбарбитуровокис-
тивность отдельных факторов свертывания кро- л ы й натрий — 2,06 г, бидистиллированная во-
ви, их ингибиторов и дериватов фибриногена. да — до 1 л. 4. 2 % раствор двузамещенного
В к л и н и ч е с к о й практике эти методы применяются цитрата натрия. Растворяют 2 г двузамещенного
реже (исключение составляют методы опреде- цитрата натрия в 100 мл дистиллированной воды.
ления фибриногена, некоторых его производ- 5. Взвесь каолина в эмульсии эритрофосфатида
н ы х и фибринстабилизирующего фактора), по- (см. 4.4.3). 6. 0,033 моль/л (0,366%) раствор хло-
скольку для этого необходимы моноспецифиче- рида к а л ь ц и я . Растворяют 366 мг высушенного
ские антисыворотки (для определения концен- до постоянной массы хлорида кальция в 100 мл
трации специфического антигена) или плазмы дистиллированной воды или разводят 5 % раст-
с изолированной недостаточностью известных вор хлорида кальция (см. 4.4.2) в 13,66 раза
факторов (для определения специфической коа- дистиллированной водой. 7. Цитратная нормаль-
гуляционной активности). ная бестромбоцитарная пул-плазма (см. 4.4.10).
В последние годы для определения актив- Отличие заключается л и ш ь в том, что нитратную
ности отдельных факторов свертывания кропи, кровь здоровых людей центрифугируют в рефри-
антикоагулянтов и компонентов фибринолити- жераторной центрифуге (4°С). 8. Субстратная
ческой системы начинают применять также плазма. Получают из крови больного тяжелой
амидолитические методы, основанные на исполь- формой гемофилии А; содержание фактора V I I I
зовании относительно специфических пептидных колеблется в пределах 1—3 %. Критерием при-
субстратов. Эти субстраты представляют собой годности плазмы является время ее свертывания
синтетические три- или тетрапептиды, и м и т и - в описываемых ниже условиях опыта. Оно долж-
рующие структуры естественных субстратов не- но быть в пределах 120—135 с. Кровь стабили-
которых факторов свертывания крови и плаз- зируют 2 % раствором двузамещенного цитрата
мина, к которым посредством амидной связи натрия в соотношении 4 : 1, центрифугируют при
присоединяется индикаторное вещество, хромо- 4 °С в течение 20 мин п р и 2500 об/мин, отсасы-
ген или флюороген. Под действием соответст- вают надосадочную жидкость и подвергают ее
вующих факторов индикаторное соединение от- повторному центрифугированию при тех же ус-
щепляется от пептида и изменяет окраску и л и ловиях. Бестромбоцитарную плазму отсасы-
флюоресценцию исследуемого образца пропор- вают, разливают по 3—4 мл в пенициллиновые
ционально активности определяемого фактора. флаконы, укупоривают их и х р а н я т при —30 °С.
Ряд иностранных фирм выпускает субстраты и Субстратная плазма пригодна для определения
целые наборы реактивов для амидолитического фактора V I I I при хранении 2—3 мес.
определения плазменных факторов свертывания О б о р у д о в а н и е . 1 . Рефрижераторная
II, V I I I , X и X I I , тромбоцитарных факторов центрифуга. 2. Водяная баня на 37 °С. 3. Се-
3 и 4, гепарина, а н т и т р о м б и н а I I I и отдельных кундомеры.
компонентов фибринолитической системы (акти- Материал для исследования.
ватора плазминогена, плазминогена, плазмина, Бестромбоцитарная плазма, которую получают
антиплазминов). путем центрифугирования цитратной крови
(см. 4 . 1 ) в рефрижераторной центрифуге п р и
4 °С. Во время работы взвесь каолина в эмуль-
Л и т е р а т у р а . Бокарев И. //., Кузне-
сии эритрофосфатида, пул-плазму, исследуемую
цов В. А., Буторов В. Н., Семушин Б. В.
и субстратную плазмы сохраняют в ледяной
Применение хромогенных пептидных субстратов
бане, а раствор хлорида кальция — в бане при
в .лабораторной диагностике.— Лаб. дело, 1981,
37 °С.
№ 8. с. 481 --485.
164
менного предшественника тромбопластина)
Х о д о п р е д е л е н и я . В пробирку вносят
и фактора X I I (фактора Хагемана, контакт-
0,1 мл взвеси каолина в эмульсии эритрофосфа-
ного фактора).
тида, 0,1 мл субстратной плазмы и 0,1 мл раз-
веденной стандартной или исследуемой плазмы Наряду с к о а г у л я ц и о н н ы м и (коагулологиче-
и ставят в водяную баню. Через 6 м и н в пробирку скими) методами в литературе описаны иммуно-
добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция, логические и амидолитические (см. введение
перемешивают содержимое и определяют время перед 4.4.11) методы определения факторов
образования сгустка. Опыт повторяют еще свертывания, участвующих во внутреннем пути
дважды и вычисляют средний результат. образования протромбиназы.
Расчет концентрации (активности) фактора
ведетсятю таблице или графику, которые состав-
ляются на основании данных, получаемых при
4.4.12. Одностадийное определение
исследовании р а з л и ч н ы х разведений нормаль-
фактора X (фактора Стюарта—Прауэра)
ной плазмы с известным содержанием ( а к т и в -
ностью) фактора V I I I .
Начинают с исследования нормальной плаз- Метод Денсона. П р и н ц и п . Определяется
м ы . Для этого ее разводят барбиталовым буфе лебетокс-эритрофосфатидное (лебетокс-кефали-
ром в соотношениях 1 : 4 , 1 : 9 , 1 : 1 9 , 1 : 39, новое, стипвен-кефалиновое) время свертыва-
1 : 79, 1 : 159 и 1 : 319 (т. е. последовательно в 5; ния исследуемой п л а з м ы при компенсации воз-
10; 20; 40; 80; 160 и 320 раз) и, как описано вы- можного дефицита всех факторов, участвующих
ше, определяют время с в е р т ы в а н и я п л а з м ы , раз- в р е а к ц и и , кроме фактора X.
веденной в 10 раз. Если оно отличается от 65 с, Р е а к т и в ы т е же, которые применяют
то путем уменьшения или увеличения концентра- для определения лебетокс-эритрофосфатидного
ции эмульсии эритрофосфатида добиваются то- времени (см. 4.4.5), и дополнительно субстрат-
го, чтобы оно стало равно 65 с. После этого опре- н а я плазма — цитратная бестромбоцитарная
деляют время свертывания во всех остальных раз- плазма больного с тяжелой недостаточностью
ведениях плазмы и на основании полученных фактора свертывания X. Субстратная плазма
данных строят в билогарифмическом масштабе может быть приготовлена и искусственно. Для
кривую разведения, откладывая на вертикаль- этого венозную бычью кровь смешивают с реак-
ной оси время свертывания исследуемых образ- тивом Винтроба (получают растворением 1,2 г
цов, а на горизонтальной оси — процент актив- оксалата аммония и 0,8 г оксалата калия в
ногти фактора V I I I (за 100 % п р и н и м а ю т актив- 100 мл дистиллированной воды) или 1,34 %
ность фактора V I I I в стандартной плазме, раз- раствором оксалата н а т р и я в соотношении 9 : 1 .
веденной в 10 раз). Стабилизированную кровь центрифугируют 7 мин
п р и 1500 о б / м и н и 4 °С, собирают тромбоцитар-
Затем определяют время свертывания иссле-
ную плазму и центрифугируют ее 30 мин при
дуемой плазмы, разведенной в 10 раз барбита-
ловым буфером, и находят по кривой разведения 4500 об/мин и 4 "С. Полученную бедную тромбо-
соответствующую ему активность фактора V I I I . цитами плазму с помощью воронки фильтруют
Содержание фактора V I I I можно рассчитать через два асбестовых фильтра: верхний, содер-
не только в процентах, но и в единицах актив- ж а щ и й 20 % асбеста, и н и ж н и й , содержащий
ности. Для этого п р и м е н я ю т формулу: 30 % асбеста (диаметр фильтров должен быть
около 14 с м ) . Фильтрацию ведут при комнат-
ной температуре со скоростью 1 капля в 1 с.
Одномоментно фильтруют 1 —1,5 л бычьей
плазмы. Первые 200 мл профильтрованной плаз-
мы выбрасывают, остальной фильтрат собирают
п о р ц и я м и по 50 мл. В каждой порции опреде-
ляют протромбиновое и лебетокс-эритрофосфа-
V I I I в процентах; V— объем исследуемой тидное время. Те порции, в которых протромби-
плазмы.
новое время равно 120 с и более, а лебетокс-
За единицу активности фактора V I I I при- эритрофосфатидное — 80 с и более, пригодны
нимают количество фактора V I I I в плазме, со- для употребления. В этой плазме отсутствуют
держащей 100% активности фактора V I I I . факторы V I I и X. Отобранную профильтрован-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Уменьше- ную плазму расфасовывают по 3 мл, укупори-
ние активности фактора V I I I наблюдается при вают и х р а н я т п р и —20—30 °С.
его врожденном дефиците или дефекте (гемо- О б о р у д о в а н и е . I . Водяная баня н а
филия А ) , диссеминированном внутрисосуди- 37 "С. 2. Секундомеры.
стом свертывании крови (вследствие «потреб- Материал для исследования.
ления») и остром фибринолизе (вследствие рас- Бестромбоцитарная плазма обследуемого и нор-
щ е п л е н и я ) . Повышение активности фактора м а л ь н а я пул-плазма (см. 4.4.10).
V I I I описано при предтромботических состоя- Х о д о п р е д е л е н и я . Исследование про-
ниях и эндотелиопатиях. водят так же, как при определении лебетокс-
эритрофосфатидного времени (см. 4.4.5). Отличие
П р и м е ч а н и е . Подобным образом с при-
заключается только в том, что нормальную пул-
менением соответствующих «дефицитных»
п л а з м у и исследуемую плазму перед работой
плазм может быть определена активность
разводят буфером, а перед добавлением эритро-
фактора свертывания IX (антнгемофильного
фосфатида смешивают с субстратной плазмой
глобулина В, фактора Кристмаса), XI (плаз-
165
в соотношении ! : 1 (0,1 мл плазмы обследуе- фактор V, но отсутствуют факторы I I , V I I и X,
разливают небольшими (1—3 мл) порциями
мого или пул-плазмы +0,1 мл субстратной
п л а з м ы ) . Испытуемую плазму перед исследо- в пенициллиновые флаконы, укупоривают их
ванием разводят буфером Михаэлиса в соотно- и хранят при —20 °С. 5. Нормальная челове-
шении 1 : 9, а нормальную пул-плазму — в со- ческая сыворотка. В пробирки, предварительно
отношениях от 1 : 9 до 1 : 999 (в 10; 20; 40; 80; промытые смесью 4 объемов изотонического
раствора хлорида и 1 объема буфера Михаэлиса
100; 200 и 1000 раз). По данным исследования
(рН 7,35), набирают по 3 мл венозной крови
различных разведений нормальной пул-плазмы
строят в билогарифмическом масштабе кривую здорового человека. Добавляют в каждую про-
зависимости лебетокс-эритрофосфатидного вре- бирку по 1 капле суспензии тканевого тромбо-
пластина (см. 4.4.4), разведенной в 10 раз буфе-
мени свертывания нормальной пул-плазмы от
ром Михаэлиса. После свертывания крови про-
активности фактора X (за 100 % принимают
бирки ставят на 4—6 ч при 37 °С, а затем остав-
активность пул-плазмы, разведенной буфером в
10 раз). По этой кривой находят активность ляют при комнатной температуре на 18—24 ч.
Далее кровь центрифугируют при 3500 об/мин
фактора X в исследуемой плазме, соответствую-
щую ее лебетокс-эритрофосфатидному времени. в течение 20 мин, отсасывают сыворотку и сме-
шивают ее с раствором Винтроба в соотношении
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Уменьше-
5 : 1 . Смесь инкубируют 48 ч при 4 °С, а затем
ние активности фактора X наблюдается при его
разливают небольшими порциями в пеницилли-
врожденной недостаточности (болезнь Стюар-
новые флаконы, укупоривают их и хранят при
та— Прауэра), тяжелых поражениях паренхимы
— 20°С. В приготовленной таким образом сы-
печени, механической желтухе, нарушениях вса-
сывания в кишечнике, лечении антивитамина- воротке сохраняются факторы V I I и X, но от-
сутствуют факторы II и V. 6. Буфер Михаэлиса
ми К, внутрисосудистом свертывании и фибри-
рН 7,35 (см. 4.3.5).
нолизе.
О б о р у д о в а н и е . 1. Водяная баня на
П р и м е ч а н и е . Для определения содер- 37 °С. 2. Секундомеры.
жания (активности) фактора X разработаны
Материал для исследования.
т а к ж е иммунологические и простые амидоли- Тромбоцитарная плазма.
тические методы (см. введение перед 4.4.11).
Ход определения. Исследуемую
Л и т е р а т у р а . Баркаган 3. С. Исследо- плазму разводят буфером Михаэлиса в соотно-
шении 1 : 9; 0,1 мл разведенной плазмы перено-
вание системы гемостаза в клинике (методи-
сят в другую пробирку, добавляют в нее 0,1 мл
ческие указания) — Барнаул, 1975, с. 134—136;
субстратного реактива, состоящего из смеси ад-
Caen I. Larrieu M. J., Samama M. L'hemostase.
сорбированной бычьей плазмы и нормальной
Methodes d'exploration et diagnostic pratique.—
сыворотки в соотношении 2 : 1 , и ставят про-
Paris, 1968, p. 127-129.
бирку в водяную баню. Через 1 мин в эту про-
бирку вносят 0,2 мл тромбопластин-кальциевой
4.4.13. Одностадийное определение смеси и отмечают время образования сгустка.
Исследование повторяют и вычисляют средний
фактора II
результат. Точно так же определяют время свер-
тывания нормальной пул-плазмы, разведенной
Метод Сулье—Ларье. П р и н ц и п . Опре-
буфером Михаэлиса в 10; 20; 40; 80; 100; 200
деляется протромбиновое время свертывания
и 1000 раз. Строят кривую разведения на било-
разведенной исследуемой плазмы при компенса-
гарифмической бумаге, откладывая на верти-
ции возможного дефицита всех факторов про-
кальной оси время свертывания пробы, а на
тромбинового комплекса, кроме фактора II.
горизонтальной — содержание фактора II в раз-
Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-
веденной нормальной пул-плазме (содержание
рия (см. 4 . 1 ) . 2. 0,025 моль/л раствор хлорида
фактора II в пул-плазме, разведенной в 10 раз,
кальция (см. 4.4.2). 3. Тромбопластин-кальцие-
п р и н и м а ю т за 100 %). Зная время образования
вая смесь (см. 4.4.4). 4. Адсорбированная бычья
сгустка в исследуемой разведенной плазме,уста-
плазма. Венозную бычью кровь смешивают с
навливают по кривой содержание (активность)
реактивом Винтроба (см. 4.4.12) в соотношении
в ней фактора II (в процентах).
9 : 1 и центрифугируют при 4500—6000 об/мин
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Уменьше-
в течение 30 мин. Супернатант собирают и под-
ние активности фактора II отмечается при его
вергают повторному центрифугированию при
врожденной недостаточности и тех же патологи-
6000 об/мин в течение 30 мин. Полученную бед-
ческих состояниях, при которых наблюдается
ную тромбоцитами плазму переносят в другую
приобретенный дефицит фактора X (см. 4.4.12).
пробирку и добавляют к ней чистый сульфат
бария из расчета 10 г на 100 мл плазмы. Смесь П р и м е ч а н и е . Активность фактора I I
постоянно взбалтывают при комнатной тем- может быть оценена также хромогенными ме-
пературе в течение 20 мин, а затем центри- тодами (см. введение перед 4.4.11).
фугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин.
Л и т е р а т у р а . Баркаган Э. С. Исследо-
Собирают надосадочный слой плазмы и опреде-
вание системы гемостаза в клинике (методи-
ляют в нем протромбиновое время. Если оно
ческие указания).— Барнаул, 1975, с. 125—127;
составляет менее 3 мин, процедуру адсорбции
повторяют, добиваясь того, чтобы протромбино- Саеп 1., Larrieu M. J., Samama M. L hemostase.
Methodes d'exploration et diagnostic pratique.—
вое время адсорбированной плазмы превышало
3 мин. Готовую плазму, в которой сохраняется Paris, 1968, p. 127—129.
166
4.4.14. Одностадийное определение Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-
р и я (см. 4 . 1 ) . 2. 0,025 моль/л раствор хлорида
фактора V
кальция (см. 4.4.2). 3. Буфер Михаэлиса рН 7,35
Метод Оврена. П р и н ц и п . Определяется (см. 4.3.5). 4. Тромбопластин и тромбопластин-
протромбиновое время свертывания разведен- кальциевая смесь (см. 4.4.4). 5. Субстратная
ной исследуемой плазмы при компенсации воз- плазма (цитратная бестромбоцитарная плазма
можного дефицита всех факторов протромбино- больного с тяжелой недостаточностью фак-
вого комплекса, кроме фактора V. тора V I I ) .
Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат- О б о р у д о в а н и е . 1. Водяная баня на
рия (см. 4.1). 2. 0,025 моль/л раствор хлорида 37 °С. 2. Секундомеры.
кальция (см. 4.4.2). 3. Тромбопластин-кальцие- Материал для исследования.
вая смесь (см. 4.4.4). 4. Буфер Михаэлиса Тромбоцитарная плазма.
рН 7,35 (см. 4.3.5). 5. Субстратная плазма: Х о д о п р е д е л е н и я . Исследование про-
цитратная бестромбоцитарная плазма больного водят так же, как при определении активности
с тяжелой недостаточностью фактора свертыва- фактора V.
ния V. Плазма, л и ш е н н а я фактора V, может К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Уменьше-
быть приготовлена также искусственно. Для ние содержания (активности) фактора V I I на-
этого венозную кровь здорового человека сме- блюдается при врожденном дефиците или моле-
шивают с реактивом Винтроба (см. 4.4.12) в кулярном дефекте фактора VII, приеме непря-
соотношении 9 : 1 , после чего центрифугируют мых антикоагулянтов, паренхиматозных пора-
20 мин при 4500—6000 об/мин. Супернатант от- жениях печени и К-витаминной недостаточности
сасывают, разливают в пробирки по 3—5 мл, (механическая желтуха, кишечный дисбакте-
герметично закрывают последние и инкубируют риоз).
при 37 °С в течение 18—36 ч, периодически
П р и м е ч а н и е . В качестве субстратной
проверяя протромбиновое время плазмы. Инку-
плазмы можно использовать также профиль-
бацию прекращают, когда оно станет равным
трованную через фильтр Зейтца нормальную
60 с и более. В такой плазме сохраняются фак-
плазму (см. 4.4.12). В ней отсутствуют фак-
торы II, V I I и X, но отсутствует фактор V. При-
торы V I I и X, поэтому с применением описан-
готовленную субстратную плазму разливают по ного принципа можно оценить суммарную ак-
1—3 мл в пенициллиновые флаконы, укупори-
тивность факторов V I I и X. После этого сле-
вают их и хранят при —20 °С. дует определить лебетокс-время испытуемой
Оборудование. 1 . Водяная баня
плазмы и таким образом отдифференциро-
на 37 °С. 2. Секундомеры.
вать недостаточность фактора V I I (лебетокс-
Материал для исследования.
время нормальное) от недостаточности фак-
Тромбоцитная плазма. тора X (лебетокс-время удлиненное).
Х о д о п р е д е л е н и я . Исследование про-
водят так же, как при одностадийном определе- Л и т е р а т у р а . Баркаган 3. С. Исследо-
нии фактора II (см. 4.4.13), но вместо субстрат- вание системы гемостаза в клинике (методи-
ческие указания).— Барнаул, 1975, с. 130—132,
ного реактива используют субстратную плазму,
лишенную фактора V. Построение калибровоч- 135; Caen J., Larrieu М. 1., Samama M. L'hemo-
ной кривой и определение по ней содержания stase. Methodes d'exploration et diagnostic pra-
фактора V в исследуемой плазме проводят так tique.—Paris, 1968, p. 125—127, 129.
же, как при определении фактора I I .
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Снижение
уровня фактора V наблюдается при наследст- 4.4.16. Методы,
венном дефиците фактора V, а также при ряде характеризующие концентрацию
заболеваний, сопровождающихся нарушением (активность) антикоагулянтов
его синтеза (болезни печени), повышенным по-
треблением (внутрисосудистое свертывание кро- Наибольшее значение имеют методы опреде-
ви) или расщеплением (активация системы фиб- ления циркулирующих антикоагулянтов (см.
ринолиза). примечание 4.4.3) и антитромбинов. Из числа
быстродействующих антитромбинов наиболее
Л и т е р а т у р а . Баркаган 3. С. Исследо-
известными являются гепарин (точнее образую-
вание системы гемостаза в клинике (методи-
щийся при его введении комплекс гепарин — ан-
ческие указания).— Барнаул, 1975, с. 127—130;
титромбин I I I ) и продукты деградации фибрин-
Саеп 1., Larrieu М. 1., Samama M. L'hemostase.
(оген)а, а из медленно действующих — анти-
Methodes d'exploration et diagnostic pratique.—
тромбин I I I . Методы определения продуктов де-
Paris, 1968, p. 120—122, 129.
градации фибрина рассмотрены в подразделе
4.5, а методы определения антитромбина I I I
4.4.15. Одностадийное определение не приводятся, так как они очень трудоемкие
фактора V I I (коагулологические) или требуют применения
иностранных реактивов (амидолитические,
Метод Оврена. П р и н ц и п . Определяется иммунологические).
протромбиновое время разведенной исследуемой Определение концентрации гепарина в плаз-
плазмы при компенсации возможного дефицита ме. П р и н ц и п . Определяют м и н и м а л ь н у ю
всех факторов протромбинового комплекса, концентрацию протамина сульфата, необходи-
кроме фактора V I I . мую для нейтрализации гепарина в исследуемой
167
практике нередко применяются и иммунологи-
плазме. Найденную концентрацию переводят в
единицы нейтрализованного гепарина. ческие методы, в частности при подозрении на
дисфибриногенемию. С практической точки зре-
Р е а к т и в ы. I. 3,8 % раствор цитрата нат-
рия или 1,34 % раствор оксалата натрия (см. н и я зачастую важно определить не только кон-
4.1). 2. I % раствор протамина сульфата. центрацию свертываемого тромбином фибрино-
3. Раствор т р о м б и н а с активностью 15 с (см. гена, но и концентрацию ряда высокомолекуляр-
4.4.6). 4. И м и д а з о л о в ы й буфер рН 7,4; раство- ных производных фибриногена (растворимого
ряют 1,36 г имидазола в 100 мл бидистиллиро- фибрина, растворимых комплексов фибрин-
ванной воды. В другую колбу вместимостью мономера), которые не трансформируются в
100 мл н а б и р а ю т 25 мл приготовленного раст- фибрин п р и добавлении тромбина. Для их обна-
вора и м и д а з о л а , добавляют 13,6 мл 0,1 н. НС1 ружения и определения предложены «парако-
и доводят дистиллированной водой общий объем агуляционные пробы», а также методы, осно-
до 100 мл. ванные на применении п р и н ц и п о в гель-фильтра-
О б о р у д о в а н и е . 1 . Водяная баня н а ции и гель-электрофореза. В к л и н и к е чаще
37 °С. 2. Секундомеры. всего используются «паракоагуляционные про-
Материал для исследования. бы», в частности этаноловая и протаминсуль-
фатная.
Бестромбоцитная плазма.
Х о д о п р е д е л е н и я . И з 1 % раствора Унифицированный гравиметрический метод
протамина сульфата готовят растворы с кон- определения фибриногена (1974). Рекомендуе-
мый в настоящее время вариант с использова-
ц е н т р а ц и я м и протамина сульфата 100; 10; 5; 2,5
и 1,25 мкг/мл (путем соответствующего разве- нием тромбина. II р и н ц и п. Высушивается
и взвешивается сгусток, образующийся при до-
дения буфером). Набирают в 5 пустых пробирок
бавлении к определенному объему плазмы раст-
по 0,1 мл плазмы. В первую пробирку добавляют
вора тромбина стандартной активности.
0,1 мл 100 м к г / м л раствора протамина сульфата,
во вторую 0,1 мл 10 мкг/мл раствора про-
Р е а к т и в ы . 1 . 1,34% раствор оксалата
т а м и н а сульфата и т. д. Последовательно поме-
н а т р и я или 3,8% раствор цитрата натрия (см.
щают пробирки в водяную баню на 1 мин и оп-
4.1). 2. 0,85 % раствор хлорида н а т р и я . 3. Раст-
ределяют время образования сгустков при до-
вор т р о м б и н а в 0,85 % растворе хлорида натрия
бавлении 0,1 мл раствора тромбина. Устанавли-
с активностью 10 с (см. 4.4.6).
вают наиболее низкую концентрацию протамина
Оборудование. 1. Водяная баня
сульфата, которая полностью нормализует тром-
на 37 °С. 2. Секундомеры.
биновое время. Активность г е п а р и н а в п л а з м е
Материал для исследования.
рассчитывают, исходя из того, что 1 мг прота-
Бестромбоцитарная плазма.
мина сульфата нейтрализует 85 ЕД г е п а р и н ; ]
Х о д о п р е д е л е н и я . Набирают в про-
(международного стандарта).
б и р к у 1 мл плазмы, добавляют в нее 0,2 мл
Нормальные величины. Прини-
раствора тромбина и немедленно опускают в
мается, что в крови здоровых людей гепарина
пробирку стеклянную палочку. Включают секун-
нет.
домер и ставят пробирку на водяную баню.
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Устанав-
Образующийся фибрин наматывают на стеклян-
ливается уровень гепарина в крови при его вве-
ную палочку, которую вынимают через 10 м и н
дении в больших (лечебных) дозах.
и н к у б а ц и и (если сгусток не извлекается, то со-
П р и м е ч а н и е. С применением протамина держимое пробирки вытряхивают в чашку Пет-
сульфата может быть определена концентра- р и ) . Сгусток переносят на беззольный фильтр,
ция гепарина и в цельной крови. высушивают и взвешивают на торсионных весах.
Л и т р а т у р а . Howie Е. ]. W., Thomp- Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 9—15 мг.
son 1. II., nidialicim P., Owen C. A. Mayo clinic При умножении массы сухого фибрина на пере-
laboratory m a n u a l of hemostasis.— W. B. Saun- водной коэффициент 25 получают значение кон-
i l e r s company, 1971, p. 123—125; Caen 1., Lur- центрации фибриногена в мг% (г/л). Норма
rieit M. 1., Samama M. L'hemostase. Methodes 200—400 мг% (2—4 г / л ) .
< I V \ p l o r ; i l i o i i el diagnostic pratique. Paris, К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Уменьше-
1968, p. 202-203. ние концентрации фибриногена наблюдается
при его врожденной недостаточности (афибри-
4.4.17. Методы, характеризующие ногенемия, гипофибриногенемия, некоторые дис-
конечный этап свертывания крови фибриногенемии), тяжелых заболеваниях пе-
(фибриноген и его производные, чени, диссемипированном внутрисосудистом
активность фактора X I I I ) свертывании крови, остром фибринолизе. Увели-
чение концентрации фибриногена отмечается
Определение фибриногена и его производ-
при инфекционных заболеваниях, хронических
ных в плазме. Распространенные методы опре-
воспалительных процессах, злокачественных но-
деления фибриногена основаны на превраще-
вообразованиях, тромбозах и тромбоэмболиях,
нии фибриногена плазмы в фибрин (посредством
во время беременности, после травм, родов и
рекальцификации, добавления тромбопластина
операций.
и т. п . ) с его последующим подсушива-
нием и н а в е ш и в а н и е м или растворением, окра- Л и т е р а т у р а . Балуда В. П., Барка-
ш и в а н и е м и колориметрированием, а также на ган 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные
осаждении фибриногена (путем в ы с а л и в а н и я методы исследования системы гемостаза.—
или тепловой денатурации). В к л и н и ч е с к о й Томск, 1980, с. 192.
168
Р е а к т и в ы. 1. 3,8 % раствор цитрата нат-
Унифицированный колориметрический метод
рия (см. 4 . 1 ) . 2. 50% раствор этанола.
определения фибриногена (1974). П р и н ц и п .
О б о р у д о в а н и е . Н е требуется.
Путем добавления раствора тромбина ф и б р и н о -
М а т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.
ген п л а з м ы превращают в фибрин, затем его
Бестромбоцитарная плазма.
подвергают гидролизу и в гидролизате опреде-.
ляют концентрацию белка по биуретовой реак- Х о д о п р е д е л е н и я . В пробирку вводят
0,15 мл 50 % раствора этанола и 0,5 мл плазмы,
ции.
Р е а к т и в ы . 1. 1,34% раствор оксалата пробирку встряхивают и помещают в штатив при
натрия или 3,8 % раствор цитрата натрия (см. комнатной температуре. Если через 1 —10 м и н в
4 . 1 ) . 2. 0,85% раствор хлорида н а т р и я . пробирке образуется гель, то проба считается
3. Раствор тромбина в 0,85 % растворе хлорида положительной («1»).
Н о р м а л ь н ы е п о к а з а т е л и . Помут-
н а т р и я с активностью 7—10 с (см. 4.4.6).
нение или появление небольшой зернистости
4. 1 н. раствор NaOH. 5. Биуретовый р е а к т и в :
(отрицательный результат— «О»).
к 1,5 г сульфата меди добавляют 6 г сегнетовой
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Положи-
соли (КNaС 4 Н 4 О 6 -4Н 2 О) и 500 мл дистиллиро-
тельная проба указывает на присутствие в плаз-
ванной воды. К этому раствору при постоянном
помешивании добавляют 300 мл 10 % раствора ме комплексов фибрин-мономера с продуктами
расщепления ф и б р и н о г е н а / ф и б р и н а и фибрино-
NaOH и доводят дистиллированной водой общий
геном, что рассматривается как в а ж н ы й лабо-
объем до 1 л. 6. Фибриноген бычий или челове-
раторный критерий диссеминированного внутри-
ческий с известной концентрацией свертывае-
сосудистого с в е р т ы в а н и я крови или массивного
мого белка.
тромбоза, сопровождающихся а к т и в а ц и е й си-
Оборудование. 1 . Водяная баня
стемы фибринолиза. По сравнению с протамин-
на 37 "С. 2. Фотоэлектроколориметр. 3. Секундо-
метр. сульфатным тестом (см. далее) этот тест чувст-
Материал для исследования. вительнее к растворимым комплексам ф и б р и н -
Бестромбоцитарная плазма. мономера.
Х о д о п р е д е л е н и я . В 2 пробирки (для
параллельных определений) вводят по 0,2 мл Л и т е р а т у р а . Breen F. A., Tullis J. L.
п л а з м ы , добавляют по 0,1 мл раствора тром- E t h a n o l g e l a t i o n : a r a p i d s c r e e n i n g lest f o r i n -
бина и ставят пробирки в водяную баню. Через t r a v a s c u l a r coagulation.— A n n . i n t e r n nied..
1 ч сгустки извлекают, трижды промывают ох- v o l . 69, № 6, p. 1197—1206; Ingram G. I. C..
л а ж д е н н ы м 0,85 % раствором хлорида натрия и Brozovic M., Staler N. (i. P. B l e e d i n g d i s o r d e r s
высушивают на фильтровальной бумаге. Каж- i n v e s t i g a t i o n a n d management.- B l a c k w e l l
дый из сгустков помещают в пробирку с 1 мл s c i e n t i f i c p u b l i c a t i o n , 1982, p. 304.
раствора NaOH и ставят пробирки на 5 м и н в
кипящую воду. Пробы охлаждают до комнатной Протаминсульфатный тест. П р и н ц и п .
температуры и добавляют в каждую пробирку Наблюдают за образованием геля в плазме
по 1 мл биуретового реактива. Через 30 м и н после добавления слабых растворов п р о т а м и н а
пробы колориметрируют в кювете с длиной оп- сульфата. Подобно 50 % раствору этанола они
тического пути 10 мм при длине волны 500— вызывают высвобождение фибрин-мономера из
560 нм (зеленый светофильтр) против дистил- его растворимых комплексов с последующей по
лированной воды. Для определения количества лимеризацией, а также осаждение р а н н и х про-
фибриногена в мг% ( г / л ) предварительно дуктов расщепления ф и б р и н о г е н а / ф и б р и н а .
строят график соотношения между п о к а з а н и я м и Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-
ФЭКа и концентрациями фибриногена в раст- рия (см. 4.1). 2. 0,85 % раствор хлорида нат-
иире. Для этого используют стандартные разве- рия. 3. 1 % раствор п р о т а м и н а сульфата в 0,85 %
дения чистого фибриногена (коагулируемого растворе хлорида натрия рН 6,0.
белка) в пределах от 50 до 1000 мг% (от 0,5 О б о р у д о в а н и е . Н е требуется.
до 10 г / л ) . М а т е р и а л для и с с л е д о в а н и я .
Нормальные величины. 200 Бестромбоцитарная плазма, полученная путем
350 мг% (2—3,5 г / л ) . центрифугирования нитратной крови или бога-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . См. г р а в и - той тромбоцитами п л а з м ы п р и 2000 о б / м и н в
метрический метод. течение 30 м и н .
Х о д о п р е д е л е н и я . 1 % раствор про-
Л и т е р а т у р а . Детинкина Г. Н., //ын-
т а м и н а сульфата разводят последовательно
кина И. М., Торик Ж- Н. Предложения по у н и -
0,85 % раствором хлорида натрия в 5; 10; 20; 40;
фикации методов исследования системы гемо-
и 80 раз; 0,2 мл каждого из приготовленных
стаза.—Лаб. дело, 1984, № 4, с. 227 и № 5,
растворов переносят в соответствующим обра-
с. 272—273.
зом помеченные 5 пробирок (в одну пробирку
Этаноловый тест. П р и н ц и п . Наблюдают один раствор) и добавляют в каждую пробирку
за образованием геля в плазме после добавле- по 0,2 мл исследуемой плазмы. Пробирки остав-
н и я 50 % раствора этанола. При н а л и ч и и в п л а з - ляют на 30 м и н при комнатной температуре, а
затем исследуют их в прямом свете на темном
ме комплексов фибрин-мономера с продуктами
расщепления фибриногена/фибрина и фибрино- фоне. Образование геля и фибриновых нитей
у ч и т ы в а ю т как положительный результат
геном происходит высвобождение ф и б р и н - м о н о -
мера, который затем полимеризуется с образова- ( « 1 » ) , а образование зерен или помутнение —
как отрицательный результат («О»).
нием геля.

169
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Отрица- Х о д о п р е д е л е н и я . К 0,2 мл исследуе-
тельный результат во всех разведениях прота- мой плазмы добавляют 0,1 мл раствора моно-
м и н а сульфата. йодуксусной кислоты и 0,4 мл раствора хлорида
Клиническое значение. Образо- кальция. Перемешивают содержимое пробирки
вание геля или нитей фибрина хотя бы в одном встряхиванием и оставляют на 20 м и н при ком-
из разведений протамина сульфата рассматри- натной температуре. К образовавшемуся сгустку
вается как указание на повышение уровня раст- добавляют 2 мл раствора кислой щавелево-
воримых комплексов фибрин-мономера и / и л и кислой мочевины и определяют с помощью се-
р а н н и х продуктов деградации фибрина. Это на- кундомера время полного растворения фибри-
блюдается при остром внутрисосудистом сверты- нового сгустка при постоянном встряхивании.
вании крови и массивных тромбозах. Выпадение Исследование проводят дважды и вычисляют
средний результат. Точно так же определяют
положительного результата только в первых
время растворения фибриновых сгустков здоро-
1—2 пробирках более характерно для увеличе-
ния концентрации растворимых комплексов фиб- вого человека.
Активность фактора X I I I в исследуемой
рин-мономеров, а положительный результат в
пробирках всего ряда более характерен для по- плазме определяют по формуле: активность фак-
вышения уровня ранних продуктов расщепления тора X I I I =А/В-100 %, где А — время лизиса
сгустка исследуемой плазмы; В — время лизиса
фибриногена/фибрина.
сгустка нормальной плазмы.
Л и т е р а т у р а . Niewiarowski S., Gu-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 70±15 с ,
rewich V. L a b a r a t o r y i d e n t i f i c a t i o n of i n t r a v a -
что принимается за 100 %.
s c u l a r coagulation: the SDPS test for the detec-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Уменьше-
tion of f i b r i n monomer and f i b r i n degradation
ние активности фибринстабилизирующего фак-
products.— J. Lab. clin med., 1971, vol. 77, тора наблюдается при его врожденной недо-
p. 665—676. статочности или в связи «с потреблением» при
массивном внутрисосудистом свертывании
крови.
Унифицированный ускоренный метод опреде-
ления фактора X I I I (1974). П р и н ц и п . Опре- П р и м е ч а н и я . При н а р у ш е н и и первой
деляется время растворения сгустка плазмы в фазы свертывания крови (гемофилия) для
растворе мочевины после инкубации п л а з м ы с образования сгустка необходимо добавить,
монойодуксусной кислотой, блокирующей актив- кроме хлористого к а л ь ц и я , 0,1 мл раствора
ность фактора X I I I , и рекальцификации. тромбина с активностью 10—20 с. 2. Тяже-
Р е а к т и в ы . 1 . 1,34% раствор оксалата лая недостаточность фактора X I I I (менее
натрия или 3,8 % раствор цитрата натрия 1 % от нормы) может быть распознана по
(см. 4.1). 2. 0,5% раствор монойодуксусной растворению сгустка исследуемой плазмы
кислоты: растворяют 0,5 г монойодуксусной кис- в 1 % растворе монохлоруксусной кислоты
лоты (СH 2 IСООН) в 100 мл бидистиллирован- или 30 % растворе мочевины в течение 1 ч
ной воды. При работе с реактивом необходимо (сгустки нормальной плазмы при этом не
соблюдать осторожность, так как это летучее, растворяются).
раздражающее и аллергизирующее вещество.
3. 0,025 моль/л раствор хлорида кальция. Л и т е р а т у р а . Балуда В. П., Барка-
4. 0,12 % раствор кислой щавелевокислой мо- гаи 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные
чевины. методы исследования системы гемостаза.—
Оборудование. Секундомер. Томск, 1980, с. 196—198; Caen J . , Larrieu M. J . .
Материал для исследования. Samama M. L'hemostase. Mehodes d ' e x p l o r a t i o n
Тромбоцитарная плазма. et diagnostic pratique.— Paris, 1968, p. 192—193.




4.5. МЕТОДЫ И С С Л Е Д О В А Н И Я Ф И Б Р И Н О Л И Т И Ч Е С К О Й
СИСТЕМЫ КРОВИ
( Ф И Б Р И Н О Л И Т И Ч Е С К О Г О ЗВЕНА И Л И К О М П О Н Е Н Т А
СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА)
Известны общеоценочные методы и методы ворения) сгустков исследуемой крови (цельной,
определения отдельных компонентов фибрино- разведенной) или эуглобулиновой фракции
литической системы: плазмина — фермента, плазмы, на оценке степени лизиса сгустков ис-
расщепляющего фибрин, а при некоторых усло- следуемой разведенной плазмы за стандартное
виях также фибриноген и другие факторы свер- время или на исследовании интенсивности ли-
тывания крови, плазминогена — неактивного зиса стандартных сгустков (пленок, пластин)
предшественника плазмина, активаторов плаз- фибрина под действием исследуемой плазмы или
миногена, ингибиторов активации плазминогена ее эуглобулиновой фракции. Отдельные компо-
и ингибиторов плазмина. Общеоценочные методы ненты системы фибринолиза могут быть изу-
чены с применением тех же подходов, но после
основаны на измерении времени лизиса (раст-

170
предварительной обработки исследуемого мате- осуществляется путем наложения манжеты
риала (инкубации с плазмином, стрептокина- сфигмоманометра на плечо и поддержания
зой, проактиватором) или стандартных п л а с т и н в ней минимального артериального давления
(обычно 80 мм рт. ст.) в течение 10—20 м и н .
фибрина (прогревания), тромбоэластографиче-
скими, казеинолитическими. амидолитическими Вторую пробу крови берут из локтевой вены
(см. введение перед 4.4.11), иммунологически- руки, на которую наложена манжета, не-
ми, иммунохимическими и некоторыми другими посредственно перед ее снятием. Время ли-
методами. зиса эуглобулиновых сгустков после веноз-
О фибринолитической активности крови ного стаза укорачивается в норме в 1,5—2
можно судить также по содержанию в ней про- раза в зависимости от длительности стаза.
дуктов деградации фибриногена/фибрина
Л и т е р а т у р а . Андреенко Г. В., Кара-
(ПДФ). Повышение уровня ПДФ рассматри-
басова М. А., Лютова Л. В. и др. Методы иссле-
вается как один из основных лабораторных
дования фибринолитической системы крови.—
признаков гиперфибринолиза. Наибольшее кли-
М.: Изд-во Московск. ун-та, 1981, с. 40—42.
ническое значение имеют общеоценочные ме-
тоды, методы фибриновых пластин и методы
определения в крови ПДФ. 4.5.2. Методы, основанные
на применении фибриновых пластин
4.5.1. Время лизиса Эти методы используются для исследования
эуглобулиновых сгустков активности отдельных компонентов системы
фибринолиза. Наибольшее их число может быть
Унифицированный метод (1974). П р и н - определено путем одновременного изучения ли-
ц и п . Измеряется время спонтанного лизиса зиса стандартных непрогретых и прогретых
сгустка, получаемого из эуглобулиновой фрак- фибриновых пластин под действием плазмы и ее
ции бестромбоцитной п л а з м ы п р и добавлении эуглобулиновой фракции, подвергавшихся и не
к ней раствора х л о р и д а к а л ь ц и я . подвергавшихся обработке стрептокиназой.
Р е а к т и в ы . 1 . 1,34% раствор оксалата Определение активности плазмина и актива-
натрия или 3,8 % раствор цитрата натрия тора плазминогена но Аструпу и соавт. П р и н-
(см. 4 . 1 . ) . 2. 1 % раствор уксусной кислоты. ц и п. Измеряется зона (площадь) лизиса стан-
3. Боратный буфер рН 9,0; растворяют 1 г буры дартного слоя фибрина (фибриновой пластины)
(Na 2 B 4 O 7 - 10Н2О) и 9 г NaCI в 1 л дистиллиро- на месте нанесения плазмы и / и л и ее эуглобу-
ванной воды. 4. 0,025 моль/л раствор хлорида линовой фракции.
кальция (см. 4.4.2). 5. Дистиллированная вода. Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-
О б о р у д о в а н и е . Водяная баня на 37°С. рия (см. 4.1). 2. 0,85 % раствор хлорида натрия.
Материал для исследования. 3. 0,3 % раствор бычьего фибриногена в 0,85 %
Бестромбоцитная плазма. растворе хлорида натрия (см. 4.4.6). 4. Раствор
Х о д о п р е д е л е н и я . В пробирку нали- тромбина в 0,85 % растворе хлорида н а т р и я с
вают 8 мл дистиллированной воды, 0,15 мл активностью 8—10 с (см. 4.4.6).
уксусной кислоты и 0,5 мл исследуемой плазмы. О б о р у д о в а н и е . 1. Столик с уровнем.
Перемешивают содержимое и ставят в холодиль- 2. Чашки Петри.
ник (4 °С) на 30 мин. Смесь центрифугируют Материал для исследования.
в течение 5 мин при 1500 об/мин, сливают над- Бестромбоцитная плазма и/или ее эуглобули-
осадочную жидкость и удаляют остатки жид- новая ф р а к ц и я (см. 4.5.1).
кости опрокидыванием пробирки на фильтро- Приготовление фибриновой
вальную бумагу. Вводят в пробирку 0,5 мл п л а с т и н ы . Наливают в пробирку или кол-
боратного буфера и, осторожно помешивая бочку 9 мл 0,85 % раствора хлорида натрия,
палочкой, растворяют осадок эуглобулинов. Две взвешивают нужное количество фибриногена,
пробы по 0,2 мл переносят в 2 другие пробирки, высыпают его в пробирку (колбочку) с 0,85 %
ставят их в водяную баню и добавляют в каж- раствором хлорида натрия и ставят пробирку
дую пробирку по 0,2 мл раствора хлорида каль- на 1 ч в термостат при 37 °С. Периодически про-
ция. Через несколько минут в пробирках обра- бирку достают из термостата и осторожно вст-
зуются сгустки, и с этого момента начинают от- р я х и в а ю т , добиваясь полного растворения фиб-
счет времени растворения сгустков. В ответе риногена. После этого в пробирку с раствором
приводят средний результат. фибриногена добавляют 0,2 мл раствора тром-
бина и быстро выливают содержимое в ч а ш к у
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 3—5 ч .
Петри, установленную на ровной горизонталь-
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Укороче-
ной поверхности. Под действием тромбина фиб-
ние времени растворения сгустков указывает на
риноген превращается в фибрин и застывает
повышение фибринолитической активности, уд-
тонким слоем. Через 1 —1'/2 ч после образова-
линение — на снижение.
ния фибрина пластины пригодны для работы.
Их можно хранить в течение 7—10 дней при
П р и м е ч а н и е . Метод может применять-
4—6 °С на ровной поверхности, проложив меж-
ся в качестве общеоценочного и для изуче-
ду чашкой и крышкой увлажненную водой
ния способности фибринолитической системы
фильтровальную бумагу.
к активации. В последнем случае опреде-
А. Ход о п р е д е л е н и я с у м м а р н о й
ляют время лизиса эуглобулиновых сгустков
активности плазмина и актива-
до и после венозного стаза. Венозный стаз

171
т о р а п л а з м и н о г с н а. На фибриновую Проба с протамина сульфатом для обна-
пластину наносят 0,03 мл плазмы (эуглобули- ружения ПДФ в крови. П р и н ц и п. Наблю-
ноиой ф р а к ц и и ) , з а к р ы в а ю т ч а ш к у Петри крыш- д а ю т зa образованием осадка в сыворотке крови
кой, выстланной и з н у т р и увлажненной фильтро- после добавления к ней 1 % раствора п р о т а м и н а
в а л ь н о й бумагой, и помещают чашку на 18— сульфата, обладающего способностью осаждать
р а н н и е ПДФ.
24 ч в термостат при 37 °С. После чтого изме-
Р е а к т и в ы . 1 % раствор протамина суль-
ряют площадь лизиса, которая и отражает ак-
фата.
тивность п л а з м и н а и активатора плазминогена.
Площадь лизиса обычно характеризуется произ- О б о р у д о в а н и е . 1 . Водяная баня н а
37 "С. 2. Секундомер.
ведением двух п е р п е н д и к у л я р н ы х диаметров и
выражается в квадратных миллиметрах.
Б. Ход р а з д е л ь н о г о определе- Материал для исследования.
ния активности п л а з м и н а и акти- Свежая сыворотка крови (см. 4 . 1 ) .
в а т о р а п л а з м и н о г е н а . Готовят одно- Х о д о п р е д е л е н и я. В пробирку наби-
временно две фибриновые пластины, после чего рают 0,4 мл сыворотки и добавляют 0,1 мл рас-
одну из пластин прогревают в течение 30 м и н твора п р о т а м и н а сульфата. Перемешивают со-
при 85 "С, что приводит к р а з р у ш е н и ю п л а ч - л с р ж и м о е и ставят пробирку в водяную баню.
м и н о г е н а , содержащегося в этой п л а с т и н е . Через 5 мин пробирку в ы н и м а ю т и читают ре-
Таким образом, одна из пластин лишается суб- зультат. Образование геля, нитей или хлопьев
страта для действия активатора плазминогена, у ч и т ы в а ю т как положительный результат («1»),
имеющегося в исследуемом материале. Затем а помутнение или зернистость — как отрица-
на обе пластины наносят по 0,03 мл плазмы тельный результат («О»).
( э у г л о б у л и н о в о й ф р а к ц и и ) и, как описано ранее, Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Помутне-
определяют фибринолитическую активность ис- ние или зернистость (отрицательный резуль-
с л е д у е м ы х образцов на обеих пластинах. За ак- тат - «О»).
т и в н о с т ь п л а з м и н а п р и н и м а е т с я площадь лизиса К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . 11оложи-
на прогретой пластине, а за активность актива- тельный результат («1») указывает на увеличе-
тора плазминогена — разность между площа- ние содержания ПДФ в сыворотке, что явля-
дями лизиса на непрогретой и прогретой пла- ется одним из лабораторных критериев патоло-
стинах. гического внутрисосудистого свертывания кро-
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . Актив- ви. Проба становится положительной при кон-
ность активатора плазминогена в крови состав- ц е н г р а ц и и ПДФ 0,015 г/л (15 м к г / м л ) и более.
2
ляет 25—35 м м , а а к т и в н о с т ь п л а з м и н а - 8-
Л и т е р а г \ р а. ГиПитов С. 3., Ворони-
2.
15 м м
на И. Е., Литвинов Р. И. Два простых способа
К л и н п ч с с к •.) е з и а ч с н и с. Уменьше-
о б н а р у ж е н и я п р о д у к т о в деградации ф и б р и н а
ние зон лизиса у к а з ы в а е т на с н и ж е н и е актив-
в к р о в и ю - Лаб. дело, 1982. ,№6 с. .454 - 356.
ности определяемых компонентов, а увеличе-
на повышение.
ние Иммунодиффузионный метод определения
ПДФ. П р и н ц и н. Наблюдают за образовани-
Л и т е р а т у р а . Андреепко Г. В., Карабч ем дуг п р е ц и п и т а ц и и в агаровой пластине, на
сова М. А., Лютооа Л. В. и др. Методы иссле- которую наносят на определенном расстоянии
дования фибринолитической системы к р о в и . друг от друга исследуемую и антифибриногено-
М.: Из-во Московск. ун-та, 1981, с. 43—45; вую сыворотки.
Коваленко А. Н. Дополнительные возможности Р е а к т и в ы . I . Агар-агар волокнистый. 2 .
метода с т а н д а р т н ы х фибриновых пластин.— Веронал-ацетатный буфер рН 8,6, и о н н а я сила
Лаб. дело, 1980, № 10, с. 615—618. 0,5 ц. В небольшом количестве доведенной до
к и п е н и я дистиллированной воды растворяют
9,25 г диэтилбарбитуровой кислоты, охлаждают
4.5.3. Продукты деградации раствор, добавляют 6,5 г ацетата н а т р и я и 1,88 г
фибрина ( П Д Ф ) NaOH и доводят дистиллированной водой общий
объем до 1 л. Если рН отличается от 8,6, путем
Описаны неиммунологические и иммуноло- добавления слабых (0,1 моль/л) растворов HCI
г и ч е с к и е методы определения содержания ПДФ или NaOH доводят его до этой величины. 3. А н -
в сыворотке крови. Первые основаны на осаж- тифибриногеновая сыворотка. 4. Фибриноген че-
дении ПДФ ( н а г р е в а н и е м , охлаждением, прота- ловека или бестромбоцитарная плазма с извест-
м и п а сульфатом), на способности ПДФ инду- ной концентрацией а н т и г е н а фибриногена.
цировать с к л е и в а н и е стафилококков или на О б о р у д о в а н и е . Ч а ш к и Петри и трубча-
а н т и п о л и м е р и з а ц и о н н о м и антитромбиновом тые резцы, позволяющие сделать в агаровой
д е й с т в и и ПДФ. Иммунологические методы осно- пластине одно центральное отверстие диаметром
ваны на применении антифибриногеновой сы- 8 мм и 6 периферических отверстий диаметром
воротки или сыворотки, содержащей антитела 4 мм, расположенных на одинаковом расстоянии
к отдельным ф р а г м е н т а м ф и б р и н а . Пред- от центрального отверстия и друг от друга.
ложены иммунодиффузионные, иммуноэлектро- Расстояние между центральным и периферичсг
форетические, радиоиммунные и т. п. методы, а ким отверстием должно составлять не менее
также методы, основанные на исследовании аг- 7 мм.
глютинации частиц латекса, г е м а г г л ю т и н а п и и и Материал для исследования.
торможении гемагглютинации. Свежая сыворотка крови (см. 4 . 1 ) .

172
ция антигена фибриногена, которая может быть
П р и г о т о в л е н и е а г а р о в о й пла-
определена с п р и м е н е н и е м имеющейся антифиб-
ст и н ы. В пробирке или колбочке готовят 1,5 %
риногеновой сыворотки); К - предельное разве-
раствор агара на веронал-ацетатном буфере
дение исследуемой сыворотки, при котором еще
с добавлением мертиолата в концентрации
образуется дуга п р е ц и п и т а ц и и с антифибрино-
1:10000, разогревают его в бане с к и п я щ е й
геновой сывороткой; С — концентрация ПДФ
водой до гомогенного состояния, после чего
в исследуемой сыворотке.
10 мл расплавленного агара выливают в чашку
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы . У здоровых
Петри, установленную на ровной горизонталь-
людей ПДФ этим методом не обнаруживаются,
ной поверхности. Когда агар станет твердым,
так как их концентрация находится за предела-
в нем делают т р у б ч а т ы м и резцами отверстия
ми чувствительности метода (менее 8 м к г / м л ) .
( о б ы ч н о в чашке Петри делают 14 отверстий:
К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Увеличе-
2 центральных и вокруг каждого из н и х по 6 пе-
н и е к о н ц е н т р а ц и и ПДФ наблюдается при мас-
риферических).
Определение чувствительно- с и в н ы х тромбозах или диссеминированном внут-
рисосудистом свертывании крови с вторичным
сти антифибриногеновой сыво-
гиперфибринолизом и при лечении фибриноли-
р о т к и . Готовят 0,2 % (2 г/л) раствор очищен-
тическими препаратами.
ного фибриногена человека в веронал-ацетатном
буфере. Разводят его веронал-ацетатным буфе- П р и м е ч а н и я . Чувствительность стан-
ром, готовят растворы с к о н ц е н т р а ц и я м и фибри- дартных антифибриногеновых сывороток, произ-
ногена 1; 0,5; 0,25; 0,125 и т . д . до 0,008 г/л водимых в ГДР и ЧССР, составляет не менее
(8 м к г / м л ) . В центральные отверстия вносят 0,016 г/л (16 м к г / м л ) , что обеспечивает надеж-
по 0,1 мл антифибриногеновой сыворотки, а в пе-
ное в ы я в л е н и е клинически значимого повыше-
риферические — по 0,05 мл приготовленных рас- ния уровня ПДФ (>=20 мкг/мл). При отсут-
творов фибриногена. Агаровые пластины остав-
ствии стандартной антифибриногеновой сыво-
ляют на сутки при комнатной температуре во
ротки ее можно приготовить в лаборатории,
влажной камере, а затем определяют наимень- пользуясь известными методическими рекомен-
шую концентрацию фибриногена, образующую дациями.
дугу преципитации с антифибрин9геновой сыво-
роткой. Эта концентрация и характеризует чув- Л и т е р а т у р а . Елизарова А. И., Федоро-
ствительность антифибриногеновой сыворотки. ва 3. Д. Получение а н т и ф и б р и н о г е н о в ы х сыво-
Х о д о п р е д е л е н и я . Исследуемую сыво- роток, применяемых для определения продуктов
ротку разводят в 2; 4; 8; 16 и 32 раза. Вносят распада фибриногена и фибрина.— Лаб. дело,
в центральные отверстия агаровой пластины по 1971, № 12, с. 722- 724; Парадесва И. К..
0,1 мл антифибриногеновой сыворотки, а в пери- Жукова И. В. Количественное определение
ферические — исследуемую сыворотку и ее раз- продуктов деградации фибриногена и фибрина
личные разведения. Через сутки и н к у б а ц и и ч а ш - методом иммунодиффузии.— Лаб. дело, 1979,
ки Петри при комнатной температуре опреде- № 10, с. 590—592; Якунин Г. А., Смоляниц-
ляют наибольшее разведение сыворотки, кото- кий А. Я . , Кургузое О. П., Грабский М. А.
рое еще образует дугу п р е ц и п и т а ц и и . Рассчи- Определение содержания антигена фибриноге-
тывают концентрацию ПДФ по формуле: н а / ф и б р и н а в плазме и сыворотке крови методом
С = А • В, где А — чувствительность антифибри- радиальной иммунодиффузии.— Лаб. дело,
ногеновой сыворотки ( м и н и м а л ь н а я концентра- 1982, № 7, с. 24—26.
Раздел 5
МЕТОДЫ К Л И Н И Ч Е С К О Й Б И О Х И М И И




5.1. Б Е Л К И

определении на рефрактометре коэффициентов
5.1.1. Общий белок
рефракции или преломления света.
Наиболее распространены рефрактометри-
ческие и фотометрические биуретовые методы.
Белки относятся к высокомолекулярным Биуретовый реактив был предложен в 1848 г.
соединениям; в их состав входит более 20 видов Однако эта реакция для определения общего
а-аминокислот, соединенных между собой пеп- белка в сыворотке крови стала широко приме-
тидной связью (СО — N H ) . Различают простые няться значительно позже. В биуретовой реак-
и сложные белки. Простые белки состоят только ции атом меди связывает атомы азота белка
из аминокислот, в сложные входят и другие с образованием цветных соединений. Первые
вещества: в липопротеиды — липиды, в глико- биуретовые реактивы состояли из медного купо-
протеиды — углеводы, в нуклеопротеиды — нук- роса и едкого натра. Концентрация щелочи
леиновые основания, в хромопротеиды — раз- может быть различной. Наибольшее распростра-
личные окрашенные соединения. Плазма крови нение получил биуретовый реактив Вейксель-
человека в норме содержит более 100 видов баума с концентрацией щелочи 0,2 моль/л.
белков. Примерно 90 % общего белка составля- Включение тартрата калия и натрия в биурето-
ют альбумин, иммуноглобулины, липопротеиды, вый реактив повысило его стабильность. Замена
фибриноген, трансферрин; другие белки присут- тартрата калия и н а т р и я на динатриевую соль
ствуют в плазме в небольших количествах. ЭДТА не дает особых преимуществ по сравне-
Большинство специфических свойств белков нию с реактивом Вейксельбаума, так же как и
зависит от химического строения и пространст- использование предложенного K i n g s l e y трифос-
венной конфигурации макромолекул. Белки об- фатбиуретового реактива с заменой едкого нат-
ладают гидрофильными свойствами, т. е. имеют ра трифосфатом натрия. Увеличение концентра-
большое сродство к воде, образуя с водой кол- ции сульфата меди незначительно влияет на ре-
лоидные растворы, отличающиеся неустойчиво- зультаты определения белка. Биуретовая реак-
стью. Под влиянием разнообразных воздействий ция чувствительна к температуре. Повышение
белки легко выпадают в осадок. На этом свой- температуры увеличивает скорость развития ок-
стве белковых растворов основаны различные раски, которая достигает максимума через
осадочные пробы. Белки относятся к веществам, 5 мин. На данном принципе основано определе-
обладающим амфотерными свойствами, т. е. ние общего белка в сыворотке крови в поточных,
содержат кислые гидроксильные группы и основ- дискретных и центрифужных автоанализаторах.
ные аминогруппы, поэтому заряд их зависит от В биуретовом методе Лоури чувствитель-
рН раствора, что важно учитывать при электро- ность выше за счет сочетания биуретовой реак-
форетическом разделении белков. В состав бел- ции с реакцией Фолина с применением реактива
ков в среднем входит 16 % азота. В биологи- Фолина — Чиокольтео. В фотометрических биу-
ческих жидкостях определяют общий белок, ретовых методах для получения правильных
группы ( ф р а к ц и и ) белков, близкие по физичес- результатов в а ж н ы м является выбор калибро-
ким и х и м и ч е с к и м свойствам, и индивидуаль- вочного материала, учитывая, что общий белок
ные белки. Для определения индивидуальных состоит из индивидуальных белков различного
белков наиболее чувствительны и специфичны состава. Некоторые естественные белки, н а п р и -
иммунологические методы, основанные на при- мер альбумин человеческой и бычьей сывороток,
менении специфических антисывороток. могут быть использованы в качестве калибро-
Методы определения общего белка в сыво- вочных материалов. Белки для калибровочного
ротке крови основаны на различных п р и н ц и п а х . материала должны быть хорошо охарактеризо-
Азотометрические — на определении содержа- ваны и иметь концентрацию не менее 70 г/л.
щегося в нем азота (первый такой метод пред- Унификация методов. Биуретовый метод оп-
ложен J. K j c l d c i h l в 1883 г . ) , весовые (гравимет- ределения общего белка в сыворотке крови был
рические) на высушивании белков до постоян- утвержден в качестве унифицированного в
ной массы и последующем взвешивании на а н а - 1972 г. В СССР выпускается «Набор химических
литических весах; спектрофотометрические — реактивов для определения общего белка в сыво-
на определении поглощения при 280 нм; фото- ротке крови по биуретовой реакции». Набор со-
метрические — на измерении окрашенных про- здан для у н и ф и ц и р о в а н н о г о метода; в качестве
дуктов реакции; рефрактометрические — на калибровочного материала использован ампули-

174
Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабо-
рованный раствор плацентарного а л ь б у м и н а
чего раствора и прибавляют по 5 мл рабочего
с концентрацией 100 г/л.
биуретового реактива; через 30—60 мин изме-
У н и ф и ц и р о в а н н ы й метод по биуретовой ре-
ряют на фотометре, как в опыте, против холостой
акции. П р и н ц и п . Белки реагируют в щелоч-
пробы. По полученным д а н н ы м строят калибро-
ной среде с сульфатом меди, при этом образу-
вочный график. Калибровочная кривая линей-
ются соединения, окрашенные в фиолетовый
на до 100 г/л альбумина.
цвет (биуретовая р е а к ц и я ) .
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 65—85 г/л
Р е а к т и в ы. 1. Натрия хлорид, ч. д. а. или
(6,5—8,5 г/100 м л ) .
х. ч., 154 ммоль/л (изотонический раствор):
Оценка а н а л и т и ч е с к о й надеж-
9 г хлорида н а т р и я помещают в мерную колбу
н о с т и м е т о д а . Метод специфичен, отлича-
вместимостью 1 л, растворяют в воде и доводят
ется хорошей воспроизводимостью. Воспроизво-
до метки водой. 2. Натр едкий, ч. д. а. или х. ч.,
димость (V) составляет 1,5—3,5 %. На п р а -
0,2 моль/л: 8 г едкого натра помещают в м е р н у ю
вильность метода влияет качество калибровоч-
колбу вместимостью 1 л, осторожно растворяют
ного материала и к о р р и г и р о в а н и е результатов
в воде и доводят до метки водой. 3. К а л и я йодид
со з н а ч е н и е м холостой пробы на реактивы и сы-
ч. д. а. или х. ч., 30 ммоль/л раствор йодида
воротку. Небольшое число веществ оказывает
к а л и я в 0,2 моль/л растворе едкого натра; 0,5 г
интерферирующее действие в данной реакции:
йодида к а л и я помещают в мерную колбу вмести-
билирубин при концентрации больше 85 мкмоль/л,
мостью 100 мл, доводят 0,2 моль/л раствором
триглицериды — больше 11,4 ммоль/л. Для уст-
едкого натра до метки и растворяют. Реактив
ранения интерференции, вызванной липемией
стабилен в течение 2 нед при хранении в посуде
(присутствием хиломикронов), применяют
из темного стекла. 4. К а л и й - н а т р и й в и н н о к и с л ы й
экстракцию диэтиловым эфиром. Большинство
4-водный (сегнетова соль) ч. д. а. 5. Меди
лекарств не вызывает интерференцию.
сульфат 5-водный ч. д. а. или х. ч. 6. Биуретовый
Л и т е р а т у р а . Методические указания по
реактив: 4,5 г сегнетовой соли растворяют в
применению у н и ф и ц и р о в а н н ы х клинических ла-
40 мл 0,2 моль/л растворе едкого натра, прибав-
бораторных методов исследований. Под ред.
ляют 1,5 г сульфата меди и 0,5 г йодида к а л и я
В. В. Меньшикова.—М., 1973, с. 45—47;
и растворяют. Доливают до 100 мл 0,2 моль/л
Weichselbaum Т. Amer. J. C l i n . Pathol., 1946,
раствором едкого натра. Реактив стабилен при
v o l . 16, p. 40.
х р а н е н и и в посуде из темного стекла. 7. Р а б о ч и й
раствор биуретового реактива: 20 мл биурето- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Изменение
вого реактива смешивают с 80 мл 0,5 % раствора содержания общего белка в сыворотке крови
происходит при уменьшении процессов синтеза
йодида к а л и я . Раствор стабилен. 8. Калибровоч-
белка, нарушении водного баланса, усиленном
ный раствор альбумина (из человеческой сыво-
распаде и потере белка. Гипопротеинемия наб-
ротки): 100 г/л раствор альбумина в 154ммоль/л
людается при нефротическом синдроме, синд-
растворе хлорида натрия.
роме мальабсорбции (энтерит, х р о н и ч е с к и й
Материал для исследования.
панкреатит), экссудативной энтеропатии, забо-
Сыворотка крови.
Х о д о п р е д е л е н и я . Опытная проба: леваниях кожи (ожоги, экзема), массивных кро-
вотечениях, задержке солей и воды (хронические
к 0,1 мл сыворотки прибавляют 5 мл рабочего
почечные заболевания), а г а м м а г л о б у л и н е м и и ,
раствора биуретового реактива и смешивают
гипогаммаглобулинемии, неправильном пита-
избегая образования пены. Через 30 м и н (и не
н и и , голодании. У м е н ь ш е н и е содержания белка
позднее чем через 1 ч) измеряют на фотометре
в плазме крови может наступить также в резуль-
в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны
500—560 им (зеленый светофильтр) против хо- тате задержки воды при сердечной декомпенса-
ции, заболеваниях, сопровождающихся отеками
лостой пробы. Холостая проба: к 5 мл рабочего
или большими потерями белка с мочой, напри-
биуретового реактива прибавляют 0,1 мл
мер при нефритах. Нарушением синтеза белка
154 ммоль/л раствора хлорида натрия, далее об-
и уменьшением его вследствие этого в сыворотке
рабатывают как опытную пробу.
крови сопровождаются раковая кахексия, дли-
Р а с ч е т ведут по калибровочному гра-
тельные воспалительные процессы.
фику.
Гиперпротеинемия наблюдается п р и плазмо-
Построение калибровочного
цитоме, макроглобулинемии Вальденстрема,
г р а ф и к а : и з калибровочного раствора гото-
хронических воспалительных заболеваниях
вят рабочие растворы как указано ниже.
(ревматоидный артрит, диффузные болезни сое-
динительной ткани — коллагенозы, бронхоэк-
тазы, цирроз п е ч е н и ) , состояниях и болезнях,
Калибро- 154 ммоль/л
Концентра-
вочный ра- раствор сопровождающихся дегидратацией (понос, рво-
№ про- ция альбу-
створ аль- хлорида
бирки та, с а х а р н ы й диабет).
м и н а , г/л
бумина, мл натрия, мл При тяжелых травмах увеличение содержа-
н и я общего белка в плазме крови может насту-
пить за счет потери части внутрисосудистой
0,2 0,8 20
1
жидкости. При острых инфекционных заболева-
0,4 0,6 40
2
н и я х к гиперпротеинемии приводит усиленный
0,6 0,4 60
3
синтез белков острой фазы, при хронических
0,8 0,2 80
4
инфекционных заболеваниях — повышение син-
1,0 100

5
теза иммуноглобулинов.

175
Стабилен п р и хранении в холодильнике в посуде
5.1.2. Альбумин
из темного стекла. 6. Рабочий раствор БКЗ
в ацетатном буфере: в мерную колбу вместимо-
А л ь б у м и н — простой белок, синтезиру-
стью 1 л помешают 85 мл 1,2 м м о л ь / л раствора
ю щ и й с я и п е ч е н и ; в плазме крови поддержи-
БКЗ, доводят объем до метки ацетатным буфе-
вает коллоидно-осмотическое давление, и г р а е т
ром с детергентом. Стабилен п р и хранении
важную роль в транспорте м н о г и х веществ
в холодильнике в посуде из темного стекла.
экзогенного и эндогенного происхождения.
7. Основной калибровочный раствор альбумина,
Методы определения альбумина — фотомет-
10 г/100 мл. Можно использовать а м п у л и р о в а н -
рические, электрофоретические, иммунологичес-
ный 10 % раствор альбумина плацентарного.
кие. Фотометрические методы основаны г л а в н ы м
М а т е [) и а л д л я и с с л е д о в а н и я .
образом на взаимодействии а л ь б у м и н а с кра-
Сыворотка крови, свободная от гемолиза.
сителями. С этой целью п р и м е н я ю т бромкрезо-
Х о д о п р е д е л е н и я. О п ы т н а я проба:
ловый зеленый (БКЗ), бромкрезоловый крас-
10 мкл сыворотки крови (или 0,1 мл сыворотки,
н ы й , метиловый о р а н ж е в ы й , н а т р и е в у ю соль
разведенной в 10 раз 154 ммоль/л раствора
2-(4-оксиазобекзол)-бензойной кислоты (ОБК);
N a C l ) тщательно перемешивают, избегая обра-
бромфеноловый голубой и др. Наиболее распро-
зования пены, с 4 мл рабочего раствора БКЗ
странены методы с использованием в качестве
в ацетатном буфере. Через 5—10 м и н и з м е р я ю т
красителей БКЗ и ОБК. Наиболее с п е ц и ф и ч н ы м
на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при
является метод с БКЗ; п р и рН 7,0 а л ь б у м и н
длине волны 630—690 нм (красный свето-
обладает высокой степенью сродства к БКЗ.
фильтр) п р о т и в холостой п р о б ы н а р е а к т и в ы
При п р и м е н е н и и ацетатного буфера о к р а с к а
или на спектрофотометре п р и д л и н е волны 625 нм
развивается быстро и остается стабильной в те-
в кювете с т о л щ и н о й слоя 1 см. О к р а с к а с т а б и л ь -
чение 2 ч. Интенсивность образования окра-
на в течение 8 ч. Холостую пробу ставят так же,
шенного соединения зависит от вида буфера.
как опытную, но вместо сыворотки добавляют
При применении ацетатного и лактатного буфе-
0,1 мл воды.
ра достигается наибольшая чувствительность
Расчет ведут по калибровочной к р и в о й .
метода (соотношение объемов пробы и реак-
Построение калибровочной
тивов может составлять 1 :500). Оптимум рП
к р и в о и: готовят ряд разведений основного ка-
ацетатного буфера равен 4,1 —4,2. Метод с БКЗ
либровочного раствора, как указано ниже. Ка-
требует введения в реакцию детергентов для
либровочные растворы обрабатывают, как опыт-
п р е д о т в р а щ е н и я п р е ц и п и т а ц и и комплекса аль-
ные, но вместо сыворотки добавляют 10 мкл
бумина с БКЗ. С этой целью используют к а т и
калибровочного раствора. Калибровочная кри-
онные, анионные детергенты, чаще применяют
вая л и н е й н а до концентрации а л ь б у м и н а 60 г/л.
неионные детергенты — твин 20, твин 80, бридж
35, тритон Х-100 и др. Метод, основанный на
реакции а л ь б у м и н а с 2- (4-оксиазобензо. i)
Содержание
Основной ка-
бензойной кислотой, отличается низкой чувстви- Дистилли-
№ про- либровочный альбумина в
тельностью и специфичностью, а также неста рованная
бирки раствор аль- сыворотке
бильностыо окраски конечного продукта реак- вода, мл
бумина, мл крови, г/л
ции.
У н и ф и к а ц и я методов. Метод определения
1 20
4,0
1,0
альбумина по реакции с бромкрезоловым зеле
2 30
3,5
1,5
ным утвержден в качестве у н и ф и ц и р о в а н н о г о
3 40
2,0 3,0
в 1979 г.
4 50
2,5 2,5
Унифицированный метод по реакции с бром-
5 60
3,0 2,0
крезоловым зеленым. П р и н ц и п. При в з а и м о -
действии альбумина с БКЗ в с л а б о к и с л о й среде
в присутствии детергента образуется окрашен-
н ы й комплекс синего цвета.
Р е а к т и в ы . 1. Уксусная кислота, 1 моль/л:
Н о р м а л |ь н ы е в е л и ч и н ы: 35—50 г/л
в мерную колбу вместимостью 1 л помещают
(3.5-5,0 г / 1 0 0 м л ) .
60 мл л е д я н о й уксусной кислоты и доводят
В о с п р о и з в о д и м о с т ь . V 2—5 %.
объем водой до метки. 2. Натр едкий ч. д. а.,
х. ч. 1 моль/л. 3. Полиоксиэтиленлауриловый Л и т е р а т у р а . Лукичеоа Т. И., Сентебо-
эфир (бридж 35). 4. Ацетатный буфер, 0,05 моль/л, на Н. А. Лаб. дело. 1977, № 1 1 , с. 675—
рН 4,2 с добавлением детергента: 0,85 г б р и д ж а 677; 1978, № 4, с. 227—233; Slurardin V., Ney J
35 растворяют в 200 мл воды, добавляют 50 мл /.. k l i n . C l i e i n . k l i n . Biochem., 1972, Bd 10,
I моль/л раствора уксусной кислоты, 13,2-мл S. 338- 344.
I моль/л раствора едкого натра и доводят объем
К л п н и ч е с к о е з н а ч е п и е. Гипераль-
водой до 1 л. Перемешивают, проверяют рН.
б у м и н е м и я наблюдается при тех же состояниях,
Реактив стабилен п р и х р а н е н и и в холодильнике.
что и г и п е р п р о т е и н е м и я . Гипоальбуминемия на-
5. Бромкрезоловый зеленый (БКЗ) водораство-
ступает при больших потерях белка, с в я з а н -
р и м ы й , индикатор, ч. д. а. 1,2 м м о л ь / л : 0,4292 г
ных с кровотечением при н а р у ш е н и и ситеза
БКЗ растворяют в 200—-300 мл воды в мерной
альбумина и увеличении процессов распада.
колбе емкостью 500 мл и доводят объем до метки.



176
5.1.3. Белковые фракции в сыворотке крови получают более 20 фракций
белков.
Состав ф р а к ц и й белков, выделяемых в био- Методом в ы с а л и в а н и я н е й т р а л ь н ы м и солями
логических жидкостях, в значительной степени (сульфат аммония, сульфат и фосфат натрия)
зависит от применяемого метода. выделяют только 3 фракции белков плазмы:
Основные методы фракционирования белков альбумины, глобулины, фибриноген.
сыворотки крови: высаливание н е й т р а л ь н ы м и Унифицированный метод электрофоретичес-
солями, электрофоретическое фракционирова- кого разделения на пленках из ацетата цел-
ние, иммунологические методы, седиментацион- люлозы. П р и н ц и п . Коллоидные частицы бел-
ный способ, хроматография, гель-фильтрация, ка перемещаются в электрическом поле по-
осаждение этиловым спиртом при низкой темпе- стоянного тока: в щелочной среде — к аноду,
ратуре. Наиболее п р и е м л е м ы м и и информатив- в кислой — к катоду. В щелочной среде в элект-
н ы м и являются электрофоретические методы рическом поле наиболее быстро перемещаются
разделения. Другие методы не получили широ- альбумины, затем щ-, «2- и у-глобулины.
кого распространения. Р е а к т и в ы . 1 . 5,5-Диэтилбарбитуровой
При электрофоретическом разделении через кислоты натриевая соль (мединал), фарм. 2. Ли-
исследуемую сыворотку, помещенную в камеру монная кислота ч. д. а., х. ч. 3. Барбитал-цит-
с буферным раствором, пропускают электричес- ратный (мединал-цитратный) буфер рН 8,6:
кий ток определенной силы и напряжения. В за- 7,36 г 5,5-диэтилбарбитурата натрия (медина-
висимости от электрического заряда и других ла), 0,3 г лимонной кислоты растворяют в 700 мл
физических и х и м и ч е с к и х свойств белковые воды в мерной колбе вместимостью 1 л, проверя-
ф р а к ц и и передвигаются к одному из полюсов ют рН и доводят водой до метки. 4. Бромфено-
(в нейтральной среде—к аноду). Количество ловый синий водорастворимый, индикатор
выделенных белковых фракций зависит от п р и - ч. д. а. 5. Ртуть двухлористая (сулема, хлорная
меняемой поддерживающей среды. В качестве ртуть) ч. д. а. 6. Уксусная кислота ледяная х. ч.
поддерживающей среды при электрофорезе при- 7. Пунцовый С. 8. Кислотный красный 2Ж.
меняют бумагу, пленки ацетат целлюлозы, гели 9. Трихлоруксусная кислота ч., 50 г/л раствор.
крахмала, полиакриламида, агара и комбиниро- 10. Растворы для окрашивания, а) Раствор
ванные среды. бромфенолового синего, 0,5 г/л: 10 г двухлори-
Электрофорез на бумаге был введен в 50-х стой ртути и 20 мл ледяной уксусной кислоты
годах. Оценка результатов производится фото- растворяют в небольшом количестве воды при
метрически после элюирования отдельных фрак- нагревании на водяной бане, непрерывно поме-
ций белков или на денситометре. Недостатки ш и в а я до полного растворения сулемы. Отдель-
метода: вследствие химической неоднородности но растворяют 0,5 г бромфенолового синего
бумаги получается недостаточно четкое разделе- в воде. Оба раствора помещают в мерную колбу
ние фракций; большая длительность процессов вместимостью 1 л и доводят водой до метки,
разделения, о к р а ш и в а н и я , отмывания. б) раствор пунцового С: 0,3 г краски растворя-
ют в 100 мл 50 г/л раствора трихлоруксусной
Электрофорез на пленках из ацетата целлю-
кислоты, в) Раствор кислого красного 2Ж:
лозы по сравнению с б у м а ж н ы м электрофорезом
0,3 г краски растворяют в 100 мл 50 г/л раствора
обладает рядом преимуществ: химическая одно-
трихлоруксусной кислоты. 1 1 . Отмывающий рас-
родность ацетата и одинаковый размер пор по-
твор — уксусная кислота, 50 г/л раствор. 12.
зволяют увеличить четкость разделения; время,
Просветляющие растворы, а) Вазелиновое мас-
необходимое для разделения, значительно мень-
ло, б) Смесь: ледяная уксусная кислота и ацетон
ше, чем при электрофорезе на бумаге; для по-
(1:1).
лучения четкой электрофореграммы достаточно
Специальное оборудование.
0,1—0,3 мкл образца; фон, получаемый после
1. Прибор для электрофореза на пленках из
окрашивания, легко отмывается; абсорбция бел-
ацетата целлюлозы. 2. Пленка из ацетата цел-
ка пленкой м и н и м а л ь н а я . Для исследования
люлозы. 3. Денситометр.
применяют веронал-мединаловый буфер рН 8,6,
Х о д о п р е д е л е н и я . Подготовка прибо-
веронал-ацетатный буфер рН 8,6, мединал-цит-
ра: прежде чем приступить к работе, необходимо
р а т н ы й буфер рН 8,6, трис-буфер.
ознакомиться с инструкцией по эксплуатации
Для окраски электрофореграммы приме-
прибора. В соответствии с инструкцией запол-
няют: пунцовый С, нигрозин, амидо черный,
няют камеры прибора буферным раствором.
а з о к а р м и н , бромфеноловый с и н и й . Чаще других
Следят, чтобы уровень буфера был одинаковым
используют пунцовый С-индикатор: при рН 10,0
в обеих камерах.
красный, при рН 12,5— п у р п у р н ы й . При элек-
трофорезе на бумаге и пленках ацетата цел- Подготовка пленок из ацетата целлюлозы:
люлозы в сыворотке крови получают 5 фракций: смачивают пленки буферным раствором (поме-
альбумин — самая большая и наиболее быстро щают в буферный раствор на 5 м и н ) . Удаляют
движущаяся к аноду фракция, далее а 1 -глобу- избыток влаги фильтровальной бумагой. За-
лины, а 2 -глобулины, в-глобулины и у-глобули- крепляют пленку матовой стороной кверху
ны — наиболее медленно движущаяся к аноду (пленки должны располагаться параллельно
фракция. Метод электрофореза на пленках из друг другу и строго параллельно стенкам при-
ацетата целлюлозы утвержден в качестве уни- бора, не должны провисать). Закрывают каме-
фицированного в 1979 г. Электрофорез в гелях ру крышкой и пропускают ток напряжением
(агаровом, крахмальном и др.) применяют реже. 150 В в течение 5 мин, после чего выключают
При электрофорезе в п о л и а к р и л а м и д н о м геле ток.

177
Нанесение сыворотки: на катодный к р а й водой, б) Трис-буфер рН 8,9: трис-(оксиметил)-
п л е н к и наносят 1—4 мкл сыворотки в виде узкой аминометан 60,5 г, этилендиаминтетрауксусная
полоски, так, чтобы полоски не доходили до края кислота (ЭДТА) 6 г, борная кислота 4,6 г, вода
пленки. до 1 л. 2. Раствор красителя. Используют раз-
Проведение электрофореза: включают ток л и ч н ы е красители — бромфеноловый синий,
и проводят электрофоретическое разделение в амидо черный, азокармин Б и др.: 1 г бромфено-
лового синего и 20 г двухлористой ртути (суле-
течение 20 м и н при н а п р я ж е н и и 150 В и силе
тока I мА на 1 см поперечного сечения полоски. м ы ) растворяют в воде, добавляют 40 г ледяной
Обработка пленок из ацетата целлюлозы: уксусной кислоты и доводят водой до 2 л. Хранят
выключают ток, в ы н и м а ю т п л е н к и , высушивают в посуде из темного стекла. 3. Раствор для элю-
их вначале на воздухе в течение 5—10 м и н , и р о в а н и я — натр едкий, 0,03 моль/л.
затем (для фиксации) в сушильном шкафу п р и Специальное оборудование.
100 'С в течение 10 мин. Окрашивают в течение 1. Прибор для электрофореза на бумаге. 2. Хро-
15 м и н одним из у к а з а н н ы х красителей, после матографическая фильтровальная бумага марки
чего п л е н к и несколько раз отмывают от избытка «Б» (качество фильтровальной б у м а г и имеет
красителя 50 г/л раствором уксусной кислоты до большое значение: она должна быть однородной
исчезновения фона (3—4 р а з а ) . После отмывки и плотной).
п л е н к и промокают фильтровальной бумагой и Х о д о п р е д е л е н и я . Подготовка прибо-
высушивают на воздухе. Затем пленки просвет- ра: в камере необходимо поддерживать опреде-
ляют в одном из просветляющих растворов. ленную влажность воздуха, чтобы предохранить
Р а с ч е т . Измерение проводят на денсито- фильтровальную бумагу от высыхания. Для это-
го прибор закрывают крышкой. Буферный рас-
метре. Результаты в ы р а ж а ю т в процентах.
Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы зависят о т твор в разных отделах камеры должен иметь
вида красителя (табл. 38). одинаковый уровень, чтобы избежать перелива-
ния жидкости через ленту.
Подготовка бумаги: полосы фильтровальной
Т а б л и ц а 38. Нормальные величины белковых
бумаги смачивают раствором свежего буфера.
фракций (в процентах)
Избыток буфера удаляют, отжимая полосы ме-
жду лентами фильтровальной бумаги, и помеща-
ют их в электрофоретическую камеру. Бумажная
лента может быть расположена горизонтально
(горизонтальный электрофорез) или под углом
(вертикальный электрофорез). При горизон-
тальном электрофорезе б у м а ж н а я лента должна
быть хорошо натянута.
Нанесение сыворотки: на край ленты наносят
по 5—10 мкл негемолизированной сыворотки в
виде поперечной полосы, отступя на 0,5 см от
краев.
Проведение электрофореза: камеру закрыва-
ют к р ы ш к о й и проводят электрофорез сыворотки
в течение 6—24 ч при н а п р я ж е н и и от 3 до 8 В
Воспроизводимость по каждой
на 1 см пути тока. Продолжительность электро-
и з ф р а к ц и и. В серии V ˜ 1,5—5 %, изо дня фореза устанавливают в зависимости от силы
в день V˜3- 8%. и н а п р я ж е н и я тока, вида буферного раствора,
рН, длины, ш и р и н ы и толщины б у м а ж н ы х
П р и м е ч а н и я . 1 . Можно использовать
полос.
б а р б и т а л о в ы й (мединал-вероналовый) бу-
Обработка бумажных полос: выключают ток,
фер такого же состава, как и для электро-
в ы н и м а ю т ленты, сушат в сушильном шкафу
фореза на бумаге. 2. После проведения элек-
в течение 10 мин при 105°С и красят, погружая
трофореза буфер из катодной и а н о д н о й
в раствор красителя на 20 мин. Краситель сли-
камер смешивают, что дает возможность ис-
вают и ленты несколько раз промывают 20 г/л
пользовать его несколько раз.
раствором уксусной кислоты до устранения
Л и т е р а т у р а . Сентебова Н. А., Медве- фона (окрашенные участки бумаги, свободные
дева Л. А., Александровская Т. Н. В кн.: Унифи- от белка). Ленты вновь просушивают на воз-
к а ц и я лабораторных методов исследования/Под духе.
ред. В. В. Меньшикова. М., 1978, вып. V I I I ,
Расчет: измерение проводят на денситометре
с. 39—49; Kohn J. In: L a b o r a t o r y m e d i c i n e .
или на фотометре после элюирования. Резуль-
V. 1— Hagerstown e. a., 1975, C h a p . 12B. таты выражают в процентах.

<<

стр. 9
(всего 20)

СОДЕРЖАНИЕ

>>