стр. 1
(всего 4)

СОДЕРЖАНИЕ

>>



УДК 543.545.4: 547 96
Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых
кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое
пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.
В книге детально описана современная аппаратура, изложены
практические приемы постановки экспериментов, проанализирова-
но влияние на их результаты различных физико-химических пара-
метров. Рассмотрены все варианты и модификации описываемых
методов. Даны ссылки на оригинальные экспериментальные рабо-
ты, опубликованные в ведущих журналах мира по декабрь 1980 г.
Книга рассчитана на биохимиков, медиков, фармакологов, ра-
ботников пищевой промышленности.
Табл. 4, илл. 77, библиогр. 294 назв.
Ответственный редактор
член-корреспондент АН СССР
Г. П. ГЕОРГИЕВ
21005 - 414
------ 684 - 82 Кн. 2.2001040000 (c) Издательство "Наука", 1981г.
055 (02) - 81

Часть первая
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
ВВЕДЕНИЕ
Электрофорез занимает сейчас центральное место среди мето-
дов исследования белков и нуклеиновых кислот. В современной
научной литературе редко можно встретить статью, в которой
бы на той или иной стадии фракционирования или характери-
стики этих биополимеров не был использован электрофорез. Ме-
тод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по та-
ким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная
масса), пространственная конфигурация, вторичная структура
и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать
как порознь, так и в совокупности.
Физический принцип метода заключается в следующем. На-
ходящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают неко-
торым суммарным электрическим зарядом, величина и знак ко-
торого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключен-
ный в канал из изолирующего материала, например стеклянную
трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала
установится определенный градиент напряжения, т. е. сформи-
руется электрическое поле. Его напряженность измеряется раз-
ностью потенциалов по концам рабочего канала (или его уча-
стка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля мак-
ромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом миг-
рируют в направлении катода или анода, причем их трение об
окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависи-
мости от величины заряда и размеров молекулы приобретают
разные скорости, и в этом - сущность процесса электрофореза.
Постепенно исходный препарат, состоявший из различных моле-
кул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с
одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределя-
ются по длине канала (рис. 1, справа).
На рисунке, помимо рабочего канала (трубки), показаны не-
которые необходимые компоненты системы. Во-первых, это два
электрода, представленные спиральками из платиновой прово-
локи, а во-вторых, электродные резервуары. Через находящиеся
в них буферные растворы и рабочий канал замыкается электри-
ческая цепь между электродами.
Рабочий канал не случайно заштрихован. Дело не только в
том, что, будь он просто заполнен жидкостью, изображенная

3

Схема выглядела бы нелепо, так как буфер из трубки и верхнего
резервуара должен был вылиться в нижний. Эту трудность мож-
но обойти, если придать каналу с жидкостью U-образную фор-
му. Такие приборы использовались на первых этапах развития
метода (электрофорез в свободной жидкости). Хуже другое: в
жидкости нельзя избежать конвекции, которая деформирует и
смешивает разделяющиеся зоны. Поэтому в современных при-
борах рабочий канал заполняют гелем, что на схеме изобра-
жено штриховкой. Достаточно чи-
стая и хорошо смачиваемая (гид-
рофильная) пространственная
сетка геля удерживает жидкость
от вытекания и препятствует кон-
векции. Вместе с тем используе-
мые гели содержат очень много
жидкости (80-99,5%), в которой
(т. е. в рабочем буфере) и мигри-
руют макромолекулы. Наличие
сетки геля вносит важную допол-
нительную деталь в картину элек-
трофоретической миграции. Те-
перь фракционируемые макромо-
лекулы любых размеров неизбеж-
но сталкиваются с нитями поли-
мера, образующего сетку геля,
что увеличивает эффективное
трение о среду, а следовательно,
снижает скорость движения мо-
лекул. Очевидно, что препятствия
для миграции становятся особен-
но серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек
геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом
случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность
различных макромолекул и степень разделения оказывает соот-
ношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация,
когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кис-
лот вообще не смогут "протиснуться" через поры геля и их
миграция прекратится.

Рис. 1. Схема простейшего прибо-
ра для электрофореза в геле
а - до начала фракционирования, б -
после его окончания
В настоящее время почти исключительно используются по-
лиакриламидные гели (ПААГ) и гели агарозы. Варьируя кон-
центрацию полимера, можно получать гели с очень широким
диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электри-
ческие заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их
конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих аген-
тов или детергентов. Все это придает методу электрофореза ис-
ключительную гибкость.
Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макро-
молекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их
диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серь-

4
езно, что протекание через жидкость электрического тока неиз-
бежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные моле-
кулы белков и нуклеиновых кислот диффундируют не слишком
быстро. Однако проблема теплоотвода и, главное, его равномер-
ности по всему гелю очень важна еще и потому, что скорость
миграции макромолекул в электрическом поле зависит от тем-
пературы. Неравномерность нагревания геля неизбежно приве-
дет к искажению зон и ухудшению их разделения.
В ходе электрофореза зоны растворенных макромолекул ос-
таются невидимыми. Для наблюдения за процессом в исходный
препарат добавляют краситель, молекулы которого несут элек-
трический заряд того же знака, что и фракционируемые макро-
молекулы, но не взаимодействуют с ними. Краситель тоже пере-
двигается в электрическом поле, но уже в виде окрашенной зо-
ны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость миграции
наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем
у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца
трубки, электрофорез прекращают.
Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффу-
зии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стек-
лянной формы и вымачивают в смеси кислоты со спиртом так,
что белки или нуклеиновые кислоты выпадают в осадок в том
самом месте, где закончилась их миграция в ходе электрофоре-
за. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окраши-
вание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно
связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек
красителя удаляют. На фотографии окрашенного цилиндриче-
ского ПААГ (рис. 2) хорошо видны четкие, узкие полосы раз-
делившихся компонентов исходной смеси белков.
Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких
пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами.
Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно
одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно
их вносят с одного края геля на равных расстояниях друг от
друга. Каждый препарат разделяется в электрическом поле не-
зависимо от своих соседей, образуя свой набор зон. На фото-
графии такой пластины (рис. 3) хорошо видна серия параллель-
ных "треков", исчерченных поперечными полосами окрашенных
зон, в которых располагаются (в данном случае) олигонуклео-
тиды различной длины.
Вместо окрашивания или наряду с ним часто используют ме-
тоды обнаружения разделенных зон по их радиоактивности.
К ним относятся приемы регистрации полос на фотопленке по-
средством авторадиографии или флюорографии и различные
способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных
сцинтилляционных счетчиков.
Преимущества пластин не ограничиваются экономией вре-
мени и места при обработке большого количества препаратов.
Важнее другое: поскольку гель заливают в форму для полиме-

5

Рис. 2. Трубки с ПААГ после окончания электрофореза
Горизонтальные полоски - окрашенные белковые зоны
Рис. 3. Пластина агарозного геля после разделения фрагментов ДНК
Окраска люминесцентным красителем (бромистым этидием)
ризации жидким, то его концентрация, состав буфера и содер-
жание добавок строго одинаковы по всему сечению геля. Следо-
вательно, плотность тока и напряженность электрического поля
также одинаковы. Это обеспечивает строго идентичные условия
фракционирования разных препаратов и дает возможность до-
стоверного сопоставления их состава путем сравнения положе-
ния полос в параллельных треках. Если добавить к этому зна-
чительно более выгодные условия теплоотвода от тонкой пла-
стинки геля по сравнению с цилиндром, то станет понятной ис-
ключительная популярность этой системы электрофореза в по-
следние годы.
Фракционированием в ПААГ и агарозе не исчерпываются
современные методы электрофореза. В качестве "носителей"
жидкой фазы широко используют также пленки из ацетата цел-
люлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, цел-
люлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для
разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют
свои преимущества, однако для фракционирования белков, ну-
клеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время исполь-
зуют почти исключительно гель-электрофорез, поэтому только
он и будет подробно описан.
Рассмотрение начинается с характеристики исходных мате-
риалов и процессов их полимеризации. Затем, чтобы освобо-
дить дальнейшее изложение от повторений, будет описана тех-
ника приготовления гелей и соответствующая аппаратура. Гла-

6

ва 3 посвящена электрофорезу белков. После замечаний общего
характера будут подробно рассмотрены различные современные
приемы и варианты электрофореза. В отдельные разделы выне-
сены способы окрашивания, элюции из геля и регистрации ра-
диоактивности фракционированных белков, поскольку эти при-
емы в большинстве своем одинаковы для всех вариантов элек-
трофореза. Главу заключает описание способов препаративного
разделения белков. Такая же структура изложения принята для
рассмотрения электрофореза нуклеиновых кислот (глава 4). За-
мечания общего характера, изложенные в предыдущей главе, во
многом относятся к фракционированию обоих типов биополи-
меров, поэтому здесь будут рассмотрены только специфические
особенности электрофореза нуклеиновых кислот. В обеих по-
следних главах для иллюстрации различных эксперименталь-
ных приемов электрофоретического разделения биополимеров
разбираются многие новейшие работы. Разумеется, при этом
приводятся только наиболее существенные данные. Более де-
тальное описание следует искать в оригинальных публикациях,
на которые будут даны ссылки.
Глава 1
ГЕЛИ ДЛЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ПОЛИАКРИЛАМИДНЫИ ГЕЛЬ (ПААГ)
Исходные материалы
Акриламид (СН2 = СН - CONH2) представляет собой белый
кристаллический порошок. Хорошо очищенный продажный пре-
парат содержит не более 0,05% акриловой кислоты. Его 5%-ный
водный раствор должен иметь рН не ниже 5, а оптическая плот-
ность 1%-ного раствора при 290 нм (А290) не должна превышать
0,15. Такой препарат можно использовать без дополнительной
очистки или перекристаллизации. Акриламид следует хранить
сухим, в темной посуде, предпочтительно на холоду. В этих ус-
ловиях он может храниться до года. Акриламид токсичен (воз-
действует на кожу и нервную систему), поэтому отвешивать и
растворять его следует в перчатках и под тягой.
Недостаточно чистый препарат можно перекристаллизовать.
Для этого 70 г акриламида растворяют в 1 л хлороформа при
50°, фильтруют при этой же температуре, затем охлаждают до
- 20°, быстро промывают кристаллы холодным хлороформом и
высушивают в вакуум-эксикаторе. Для освобождения от УФ-по-
глощающих примесей акриламид можно обработать активиро-
ванным углем. Для этого в маточный 30 - 40%-ный водный рас-
твор акриламида в смеси с метиленбисакриламидом добавляют

7

активированный уголь (примерно 50 г/л), суспензию перемеши-
вают в течение 30 мин и фильтруют сначала через бумажный, а
затем через стекловолокнистый фильтр.
NN'-Метиленбисакриламид ("Бис") - (CH2 = CH - CONH)2 -
СН2 - используют в качестве "сшивки" линейных полимеров ак-
риламида. Продажные препараты, содержащие не более 0,02%
акриловой кислоты, не нуждаются в дополнительной очистке.
В случае необходимости Бис можно перекристаллизовать из
ацетона (12 г/л) в тех же условиях, что и акриламид. Условия
хранения и токсичность - такие же, как у акриламида.
В качестве "сшивки" иногда используют этилендиакрилат -
СН2 = СН - СО - O - СН2 - СН2 - О - СО - СН = СН2, а также
NN'-диаллилтартардиамид (ДАТД) - CH2 = CH - CH2 - NH -
CO - CH(OH) - CH(OH) - CO - NH - CH2 - CH = CH2. С их по-
мощью получают "растворимые" гели. В первом случае эфирную
связь можно разорвать обработкой геля щелочью или водным
раствором пиперидина. Гели, сшитые ДАТД, растворяются за
20 - 30 мин при комнатной температуре в 2%-ной йодной кисло-
те. Использование растворимых гелей на основе акриламида
будет рассмотрено ниже.
Персульфат аммония производится в виде белого кристалли-
ческого порошка или гранул. Его используют в качестве инициа-
тора процесса полимеризации. Гомолитический разрыв связи
между атомами кислорода в молекуле персульфата аммония

приводит к образованию двух достаточно долго живущих сво-
бодных радикалов с одним неспаренным электроном у атома
кислорода:

Такой радикал стимулирует разрыв двойной связи в молекуле
акриламида и присоединяется к ней таким образом, что снова
образуется радикал с неспаренным электроном, но уже у атома
углерода:

Этот радикал, в свою очередь, вызывает разрыв двойной связи
и присоединение следующей молекулы акриламида с образова-

8

нием нового радикала и т. д. Цепная реакция полимеризации
идет до тех пор, пока два радикала, встретившись между собой,
не образуют обычную ковалентную связь. По тому же механизму
в растущую цепочку линейного полимера может одной из своих
концевых винильных групп встроиться и метиленбисакриламид.
Второй его конец может точно так же оказаться в составе дру-
гой линейной полимерной цепочки, и образуется "сшивка".
Персульфат аммония в водном растворе постепенно разлага-
ется, поэтому следует использовать только свежеприготовлен-
ные растворы. Сухой препарат хранится лучше, хотя и он мед-
ленно разлагается с выделением кислорода. Продажные препа-
раты для электрофореза обычно достаточно хорошо очищены,
но их следует проверять. Если 1%-ный раствор персульфата
аммония в воде имеет рН < 2, то он непригоден. Отметим попут-
но, что катион не играет роли в процессе инициации. Можно с
успехом использовать, например, персульфат калия.
Рибофлавин представляет собой кристаллы в виде желто-
оранжевых игл. Он малорастворим в воде, но хорошо растворя-
ется в слабощелочных водных буферах; растворы имеют желто-
зеленую окраску.
Рибофлавин также может служить инициатором полимериза-
ции. При освещении его водного раствора видимым светом
(445 нм) он присоединяет водород и восстанавливается до лей-
корибофлавина. Последний снова легко окисляется растворен-
ным в воде кислородом, образуя перекись водорода. За счет раз-
ложения перекиси продуцируются свободные радикалы (НО?),
инициирующие цепную реакцию полимеризации акриламида.
К чистоте рибофлавина можно предъявлять не слишком
строгие требования, так как он, являясь очень эффективным ини-
циатором, используется в гораздо меньших концентрациях
(˜ 0,005%), чем персульфат аммония.
Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) - (СН3)2N - CH2 - CH2 -
- N(СН3)2 - представляет собой бесцветную жидкость с плот-
ностью 0,78 г/см3. Концентрация неразбавленного ТЕМЕД -
около 6,7 М.
ТЕМЕД не является, собственно говоря, инициатором поли-
меризации акриламида, но служит катализатором этого процес-
са, заметно ускоряя его протекание. Он эффективен только в
своей неионизированной форме, поэтому при полимеризации ак-
риламида в кислой среде содержание ТЕМЕД следует значи-
тельно увеличить. В нейтральной или щелочной средах ТЕМЕД
можно вносить в количестве, эквимолярном по отношению к пер-
сульфату.
В качестве катализатора в последнее время нередко исполь-
зуют диметиламинопропионитрил - (CH3)2N - СН2 - CH2 - CN
(M = 102). Он более эффективен, чем ТЕМЕД, поэтому его вно-
сят в три-четыре раза меньше, чем персульфата аммония.

9

Процесс полимеризации ПААГ
При подготовке определенной серии опытов удобно заранее
приготовить концентрированный (30 - 40%) водный раствор ак-
риламида и метиленбисакриламида с определенным соотноше-
нием обоих мономеров. Такой раствор можно хранить в холо-
дильнике в течение нескольких недель. Так же хранят и маточ-
ный раствор буфера, например 10-кратной концентрации.
ТЕМЕД хранится хорошо, а персульфат аммония растворяют в
воде непосредственно перед началом опыта.
Для приготовления геля маточные растворы мономеров и бу-
фера смешивают в такой пропорции, чтобы получить нужную ко-
нечную концентрацию акриламида и буфера, дополняют до рас-
четного объема водой и вносят ТЕМЕД. После этого раствор
деаэрируют в колбе Бунзена, присоединенной к водоструйному
насосу, добавляют расчетный объем раствора персульфата и за-
ливают в трубку или между стеклами для формирования пла-
стин. При правильном выборе концентраций персульфата и
ТЕМЕД полимеризация занимает 30 - 40 мин. Ее следует вести
вдали от яркого источника света.
Рассмотрим некоторые факторы, влияющие на этот процесс.
Наибольшую опасность для нормального протекания полимери-
зации акриламида представляет растворенный в воде кислород,
молекула которого является определенного рода бирадикалом
и потому способна оборвать цепную реакцию свободнорадикаль-
ной полимеризации акриламида. Деаэрация смеси растворов
необходима именно для удаления из нее растворенного кислоро-
да. Ее можно вести достаточно энергично и с перемешиванием -
так, чтобы жидкость при пониженном давлении закипела, но
как только интенсивное выделение пузырей газа закончится,
деаэрацию следует прекратить, не допуская заметного испаре-
ния воды. Обычно эта процедура занимает несколько минут при
комнатной температуре.
Кислород воздуха в контакте с раствором мономеров может
помешать полимеризации, поэтому на поверхность раствора ос-
торожно наслаивают до высоты 3 - 5 мм деаэрированную кипя-
чением воду или изобутанол. Наслаивать следует по стенке фор-
мы через иглу от шприца с помощью перистальтического насо-
са. Им же удобно отсосать воду после окончания полимеризации
геля. Вначале граница между гелем и водой исчезает, но затем
вновь появляется, что указывает на окончание процесса полиме-
ризации.
Если в качестве инициатора используют рибофлавин, то фор-
му с раствором мономеров освещают люминесцентной лампой
"дневного света" с расстояния около 5 см в течение 30 - 45 мин.
Уже указывалось, что рибофлавин является более эффективным
инициатором, чем персульфат. Кроме того, продукты его распа-
да не опасны для белков и нуклеиновых кислот, в то время как
ион персульфата может вступать в реакцию с белками, созда-

10

вая артефакты при их фракционировании. В тех случаях, когда
это существенно, персульфат удаляют путем предварительного
электрофореза ("преэлектрофореза") геля до внесения в него
препарата, однако полностью это сделать не удается. Тем не ме-
нее в последние годы в качестве инициатора предпочтение отда-
ют персульфату, поскольку при работе с рибофлавином доволь-
но трудно подобрать оптимальную степень деаэрирования рас-
творов. С одной стороны, растворенный кислород препятствует
полимеризации, а с другой - он необходим, хотя и в небольшом
количестве, для самого процесса инициации с участием рибо-
флавина.
Полимеризация - экзотермический процесс, поэтому в слу-
чае высокой концентрации акриламида во избежание образова-
ния пузырей газа и нарушения однородности геля необходимо
обеспечить отвод тепла. Вместе с тем скорость полимеризации
увеличивается с ростом температуры за счет ускорения образо-
вания свободных радикалов. Этим можно воспользоваться для
замедления полимеризации: при охлаждении геля на 1° ее про-
должительность увеличивается примерно на 2 мин. Полимери-
зацию гелей, содержащих более 15% акриламида, лучше вести
на холоду.
Гель получается наиболее однородным, если время полиме-
ризации составляет 30 - 40 мин. Обычно этого добиваются эм-
пирически, подбирая оптимальную концентрацию персульфата.
Она может варьировать в пределах от 0,02 до 0,2% в зависимо-
сти от концентрации акриламида и качества самого персульфа-
та. С увеличением содержания акриламида концентрацию пер-
сульфата приходится уменьшать. Имеет смысл предварительно
внести различные количества данного препарата персульфата
в ряд пробирок с рабочим раствором мономеров акриламида,
наблюдая продолжительность полимеризации в них.
Количество ТЕМЕД в объемных процентах можно брать
примерно вдвое меньшим, чем персульфата. С учетом различия
молекулярных масс и плотности ТЕМЕД это обеспечит их при-
близительную эквимолярность. Напомним, что при использова-
нии кислых буферов количество ТЕМЕД следует увеличивать
вплоть до 10-кратного по сравнению с персульфатом. Впрочем,
нередко вносят избыток ТЕМЕД и в нейтральные буферы. Су-
щественной роли это не играет, если только гель не обнаружи-
вает склонности к растрескиванию при высушивании (для ав-
торадиографии). В этом случае содержание ТЕМЕД надо сни-
зить.
Состав буферов, используемых для электрофореза белков и
нуклеиновых кислот, не влияет на процесс полимеризации ак-
риламида. Природа, концентрация и рН буфера определяются
особенностями самого процесса электрофореза, которые будут
рассмотрены ниже. Полимеризации ПААГ не мешает также при-
сутствие мочевины (даже в высоких концентрациях), гуанидин-
хлорида, формамида, сахарозы или таких детергентов, как до-

11

децилсульфат натрия, Тритон Х-100, цетавлон и др. Сахароза
даже способствует полимеризации и улучшает механические
свойства геля. Разумеется, все эти добавки не должны содер-
жать посторонних примесей.
Весьма существенно обеспечить чистоту поверхности стеклян-
ных форм для геля. Их тщательно моют лабораторными детер-
гентами и обильно споласкивают водой. Трубки можно мыть ще-..
точкой для курительной трубки. Неплохо дополнительно погру-
зить пластины или трубки на 1 - 2 ч в хромпик. Иногда их моют
горячей азотной кислотой. По хорошо промытой стеклянной
поверхности вода должна стекать, не оставляя капель.
ПААГ хорошо прилипает к стеклу даже при малой концент-
рации акриламида (менее 5%). Это существенно для поддержа-
ния геля в устройствах с вертикальным расположением трубок
или пластин. Кроме того, хорошее прилипание улучшает тепло-
передачу от геля к стеклу и уменьшает опасность образования
шунтирующей ток пленки жидкости у поверхности стекла. Такой
шунт, а иногда и канал, по которому вытекает буфер из верхне-
го электродного резервуара, может образоваться между боко-
выми торцами пластины геля и прокладками, определяющими
его толщину, в случае загрязнения прокладок или неудачного
выбора их материала. Прокладки из тефлона, плексигласа или
чистой силиконовой резины не мешают полимеризации геля
вблизи их поверхности. Однако некоторые сорта резины с на-
полнителями, а также смазки, которыми нередко герметизиру-
ют прокладки, могут препятствовать полимеризации. Смазку
(лучше всего силиконовую) следует наносить тонким валиком
из шприца со снятой иглой на таком расстоянии от внутреннего
края прокладки, чтобы она не выдавливалась внутрь формы
при ее сжатии пружинными зажимами (см. ниже). Для доста-
точно ровных стекол тефлоновые прокладки можно использо-
вать без смазки.
Гели с высоким содержанием акриламида могут настолько
прочно связываться со стеклом, что их последующее извлечение
из трубок или снятие стеклянных пластин с геля становится за-
труднительным. В этом случае можно силиконировать стекло
или использовать формы, изготовленные из плексигласа, к ко-
торому ПААГ прилипает хуже, чем к стеклу, но при высокой
концентрации акриламида - вполне надежно. Полимеризацию
геля между тонким стеклом и толстой (для жесткости) пласти-
ной плексигласа удобно проводить для последующего горизон-
тального электрофореза. После окончания полимеризации плек-
сиглас можно легко снять, а гель на стекле перенести на ох-
лаждающий столик прибора. Полимеризацию ПААГ для гори-
зонтального электрофореза можно вести просто в тонком слое,
налитом на строго горизонтальное стекло, если его поместить в
камеру, заполненную азотом.
Особого внимания требует полимеризация "градиентных" ге-
лей с меняющейся по высоте концентрацией акриламида. Тепло-

12

выделение при полимеризации такого геля будет заметно боль-
ше в его нижней части, где содержание акриламида выше, а это
может привести к тепловой конвекции в жидкости и нарушению
градиента. Во избежание такого явления вместе с концентраци-
ей акриламида по высоте геля варьируют и содержание в нем
инициирующих добавок с таким расчетом, чтобы, полимеризация
начиналась с верхнего края пластины или трубки и постепенно
распространялась вниз.
Выбор концентраций мономеров
Для удобства изложения используются следующие обозна-
чения: Т - процентное отношение суммарной массы обоих мо-
номеров к объему их раствора, С - процентное отношение мас-
сы метиленбисакриламида к общей массе обоих мономеров. Ве-
личина Т практически варьирует в пределах 3 - 30%, а С, как
правило, составляет 1-5%, что соответствует отношению акри-
ламид/Бис в пределах от 99 : 1 по 19 : 1. Однако в некоторых
особых случаях, рассмотренных ниже, имеет смысл увеличивать
С до 20% и более. При указании значений Т и С значок "%" да-
лее будет опущен.
Чем же диктуется выбор значений T и С? Прежде всего, на
этот выбор накладывают ограничения механические и адсорб-
ционные свойства геля. Например, гели с T ? 5 и С = 1 оказыва-
ются слишком мягкими и липкими - их невозможно извлечь
из стеклянной формы. Для крупнопористых гелей надо увели-
чивать степень сшивки (повышать величину С до 3 - 5), т. е. от-
ношение акриламид/Бис брать в пределах от 35 : 1 до 20 : 1. При
этом происходит одновременное повышение прочности геля и
ухудшение его способности прилипать к стеклу - гель как бы
"замыкается". Мелкопористые гели (T около 20) при высоком
содержании "сшивки" оказываются хрупкими и мутными, по-
этому для них величина С не должна превышать 1 - 2.
На первый взгляд кажется очевидным, что поры ПААГ тем
мельче, чем больше содержание в нем мономеров, т. е. величи-
на Т. Но это не всегда так; имеет смысл разобраться в этом
глубже.
Неправильно было бы считать ПААГ регулярной простран-
ственной решеткой с жесткими ячейками определенного средне-
го размера. При малых значениях С он представляет собой ско-
рее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь в отдельных
точках случайным образом сшитые между собой. Расстояние
между этими точками вдоль нити (при C ? 2) в среднем равно
50 - 100 мономерных единиц. Такая система не может быть
внутренне жесткой. Мигрирующие в геле макромолекулы, по-
видимому, могут раздвигать гибкие длинные участки линейных
полимеров акриламида. Разумеется, на это расходуется энер-
гия, миграция молекул замедляется и происходит своеобразное
"трение" их о гель. Однако жестких ограничений на размер

13

мигрирующих молекул такая система не накладывает, и это
очень существенно.
Чем больше содержание акриламида (а величина Т, в основ-
ном, определяется им), тем гуще нити полимера, меньше проме-
жутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания
"сшивки" (С) сначала повышает жесткость геля так как сред-
няя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при
этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедля-
ется, - именно этого и можно было ожидать. Однако далее кар-
тина меняется. Эксперимент обнаруживает, что с увеличением
С выше 10 тормозящий эффект геля (при одних и тех же значе-
ниях Т) ослабляется. При С > 15 гель ведет себя как крупнопо-
ристый даже при высоких значениях Т. Дело в том, что внутрен-
няя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому,
совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам, располо-
женным теперь на расстоянии всего лишь нескольких мономер-
ных единиц друг от друга, оказывается энергетически выгодным
и вероятным многократное связывание нескольких параллельно
идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют
хаотически сшитую пространственную сетку. Однако эта сетка
оказывается действительно жесткой - нити в пучках раздвинуть
невозможно. Зато между пучками полимерных нитей образу-
ются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой
геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биопо-
лимеров.
Между прочим, такая же ситуация возникает и при затверде-
вании агара или агарозы, однако нити линейных полисахаридов
связываются в пучки не ковалентными, а водородными связями.
Такая структура и обеспечивает удивительное сочетание круп-
нопористости и прочности, характерное для этих гелей.
Возвращаясь к ПААГ, следует указать, что гели с очень вы-
соким содержанием метиленбисакриламида (С > 15) хрупки,
легко отстают от стенок, непрозрачны и сильно окрашиваются.
Этих недостатков лишены гели, сшитые NN/-диaллилтapтapдиa-
мидом. Например, гель с T = 5 и С = 15, сшитый ДАТД, оказы-
вается настолько крупнопористым, что не тормозит миграцию
биополимеров с молекулярной массой 0,5 млн. дальтон; при
этом он механически прочен, хорошо сцепляется со стеклом и
прозрачен [Baumann, Chrambach, 1976]. Вспомним, что такой
гель к тому же растворим в йодной кислоте. Недавно описано
успешное использование для электрофореза белков еще сильнее
сшитого геля этого типа. В нем величина С достигала 27, т. е.
отношение акриламид/ДАТД не превышало 4 : 1 [Spath, Koblet,
1979].
Рассмотрим теперь подробнее влияние выбора значений Т и
С для обычного ПААГ на скорость миграции в нем биополиме-
ров. Тормозящий эффект трения о гель проявляется в снижении
электрофоретической подвижности заряженных макромолекул в
геле (и') по сравнению с их подвижностью в свободной жидко-

14

сти с такими же, как у буфера геля, значениями рН и ионной си-
лы раствора (u0). Электрофоретическую подвижность определя-
ют как величину скорости миграции заряженных молекул (см/ч)
при напряженности поля 1 В/см. Величина и0 зависит от соотно-
шения суммарного электрического заряда макромолекулы (при
данном рН) и ее массы. Сила, действующая на молекулу в элек-
трическом поле, пропорциональна заряду, а противодействую-
щая миграции вдоль силовых линий поля сила трения о жид-
кость пропорциональна линейному размеру молекулы, а следо-
вательно, кубическому корню из ее массы. Для ориентировки
заметим, что электрофоретическая подвижность большинства
кислых белков в свободной жидкости при рН 8,8 лежит в пре-
делах 0,1 - 0,5 см/ч на 1 В/см. Прямой корреляции между мас-
сой молекулы и величиной и0, очевидно, быть не должно.
В геле трение существенно возрастает, причем тем сильнее,
чем больше масса молекул и меньше средний размер пор, т. е.
чем больше величина Т (для малых значений С). Показано, что
имеет место соотношение: ln(и'/и0) = - kRT. Величина коэффи-
циента торможения kR (порядка 0,1- 0,4) зависит от среднего
радиуса молекулы R и степени сшивки геля С, слабо увеличи-
ваясь с ростом последней в пределах от 1 до 7. Для глобуляр-
ных белков R лежит в диапазоне от 1,57 нм для лактальбумина
(M = 12400) до 3,61 нм для церулоплазмина (M = 151 000).
Для эффективного разделения белков при электрофорезе в
ПААГ соотношение u'/u0 должно составлять 0,1 - 0,2. Отсюда
следует, что оптимальная электрофоретическая подвижность
белков в ПААГ лежит в пределах 0,01- 0,1 см/ч на 1 В/см. При
напряженности поля 10 - 20 В/см этому соответствуют скорости
миграции белков в диапазоне 0,1 - 2 см/ч. Таким образом, при
рабочей длине геля 10 см за 5 ч электрофореза наиболее быст-
рые белки могут достигнуть конца геля, в то время как наименее
подвижные продвинутся лишь на 0,5 см. Цифры эти - сугубо
приближенные и приведены здесь лишь для общей ориентиров-
ки. В конкретных случаях возможны существенные отклонения
от них. Например, если заранее известно, что разделяемые бел-
ки сильно различаются между собой по заряду или размерам, то
можно вести электрофорез в условиях более высоких подвижно-
стей (и'), т. е. в более крупнопористых гелях, и тем сократить
время фракционирования в 2 - 3 раза.
Выбор значения Т зависит от природы различия электрофо-
ретических подвижностей белков в геле. Если сильно различа-
ются размеры молекул, а отношение заряда к массе у них более
или менее одинаково, то имеет смысл выбрать Т максимальным.
Разделение в этом случае будет происходить только за счет
трения о гель, причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при
этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза
усилится диффузия белков. Если же компоненты анализируемой
смеси имеют различные отношения заряда к массе, то может
оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле

15

при малых значениях Т), т. е. как бы в свободной жидкости,
почти не используя эффект трения молекул о гель. По крайней
мере, это обеспечит выигрыш во времени фракционирования.
Ориентировочно о характере различия электрофоретических
подвижностей двух белков в данных условиях разделения мож-
но судить в том случае, когда известны их молекулярные мас-
сы и изоэлектрические точки, а также содержание в них ионо-
генных аминокислот. Чаще всего бывают, хотя бы приблизитель-
но, известны молекулярные массы. Если они различаются не-
значительно, то имеет смысл ориентироваться сначала на круп-
нопористый гель и попробовать поварьировать рН буфера.
Пожалуй, самый существенный вывод из проведенного каче-
ственного рассмотрения - заключение об определенной свобо-
де выбора концентрации ПААГ и, особенно, содержания в нем
"сшивки" (С в пределах 2 - 5). В любом случае выбор значений
Т должен быть сделан на основе ряда пробных опытов, в кото-
рых, в частности, следует варьировать рН буфера и продолжи-
тельность электрофореза (электрофорез белков в присутствии
додецилсульфата натрия пока не рассматривается).
В качестве сугубо ориентировочной можно рекомендовать
следующую полученную на практике таблицу соответствия мо-
лекулярных масс разделяемых белков (М) и концентраций
ПААГ (Т):
М, тыс.
Дальтон
Т, %
М, тыс.
Дальтон
Т, %
10-40
15-20
100-300
5-10
40-100
10-15
>300
5

Приступая к электрофоретическому фракционированию био-
полимеров, необязательно в точности воспроизводить значения
Т и С, приведенные в литературе для сходного типа эксперимен-
тов, но выбранные однажды условия следует, разумеется, точно
воспроизводить в собственной серии опытов для надежной иден-
тификации и сопоставления положения соответствующих полос.
АГАРОЗА
Сочетание прочности и крупнопористости делает гели агаро-
зы незаменимыми при электрофорезе особенно крупных макро-
молекул, в частности нуклеиновых кислот. Агароза - это особо
чистая фракция природного линейного полисахарида агара, ко-
торый извлекают из некоторых видов морских водорослей. В по-
лимерной цепи агарозы чередуются ?-D-галактопираноза и 3,6-
ангидро-?-L-галактопираноза. Молекулярная масса ее состав-
ляет 104 - 105. Гелеобразование идет, как уже указывалось, пу-
тем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет
водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы обра-
зуют прочные гели уже при концентрации 0,3%.

16

При температурах 84 - 96° (а у специальных типов - уже
при 70°) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость -
"плавится". Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агаро-
зы составляет 10 - 15 сП, что примерно соответствует вязкости
50%-ного раствора сахарозы при комнатной температуре. Рас-
творы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерези-
сом: они затвердевают, образуя гель, при значительно более низ-
ких температурах (36 - 42°). У легкоплавких типов агарозы эта
температура снижается до 30°. Такая особенность облегчает
манипуляции с расплавленной агарозой - можно не опасаться
преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплав-
ленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают
до 50 - 55° и уже при этой температуре дозируют и заливают в
формы; это удобно и не связано с возникновением значительных
тепловых деформаций.
Гели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено
не наличием примесей, а своего рода "кристаллизацией" геля и
свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель
представляет собой не вполне равновесную систему: со време-
нем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жидкость.
Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом - очень
медленно. Тем не менее гели агарозы перед опытом следует вы-
держивать в течение, по крайней мере, 12 ч (открытые пластины
для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной
камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных
гелей агарозы.
Температуры плавления и гелеобразования зависят от содер-
жания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать
3 - 4%. Наличие этих групп затрудняет гелеобразование. В ага-
розе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Их при-
сутствие существенно влияет не только на температуры плавле-
ния и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза.
В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают силь-
но выраженное при электрофорезе в гелях агарозы явление эн-
досмоса, сущность которого сводится к следующему.
Отрицательно заряженные остатки серной кислоты непо-
движно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствую-
щие им положительные ионы, напротив, находятся в водной фа-
зе и под действием электрического поля мигрируют в направле-
нии катода. Их место занимают катионы, поступающие из анод-
ного буфера. Возникает дополнительный ток сильно гидратиро-
ванных катионов, которые увлекают за собой всю массу жидко-
сти, находящейся внутри геля, и вместе с ней - растворенные в
водной фазе геля макромолекулы. Они "дрейфуют" вместе с
жидкостью, и это движение накладывается на их миграцию под
действием электрического поля.
В большинстве случаев электрофорезом в агарозе разделя-
ют отрицательно заряженные макромолекулы, мигрирующие к
аноду. Эндосмос направлен в противоположную сторону и ухуд-

17

Рис. 4. Влияние эндосмоса в агарозном геле на характер
фракционирования двунитевых ДНК одинакового разме-
ра [Johnson et al., 1980]

1 - сверхскрученная ДНК; 2 - линейная; 3 - кольцевая; сте-
пень эндосмоса увеличивается слева направо
шает разделение. Ввиду этого агарозу под-
вергают специальной очистке, и содержание
иона сульфата в продажных препаратах не
превышает 0,5%. Типы агарозы, отличающие-
ся слабо выраженным эндосмосом, содержат
менее 0,3% сульфата. В случае необходимо-
сти можно провести дополнительную очистку
агарозы от сульфата обработкой 1 М NaOH
в 0,05%-ном боргидриде натрия и переосаж-
дением 50%-ным этанолом [Lonnerdal, Laas, 1976].
Насколько существенно эндосмос может влиять на резуль-
таты электрофореза, видно из данных Джонсона и др. [John-
son et al., 1980]. Авторы использовали три типа агаро-
зы с различной способностью к эндосмосу (значения -mr со-
ставляли соответственно 0,081, 0,175 и 0,441; см. ниже). В одном
и том же опыте на параллельных полосках 1%-ной агарозы
этих типов они разделяли смесь трех форм репликативной ДНК
фага ФХ 174-сверхскрученной, кольцевой и линейной. С усиле-
нием эндосмоса не только происходило сильное замедление ско-
рости миграции всех ДНК (более чем втрое), но и (что хуже)
менялось взаимное расположение полос (рис. 4). По-видимому,
различные формы ДНК увлекаются потоком эндосмоса по-раз-
ному.
Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает
еще и неспецифическую сорбцию белков на агарозе, в результа-
те чего полосы расплываются с образованием "хвостов".
Степень эндосмоса количественно оценивают с помощью ко-
эффициента относительной миграции (-mr). Знак "минус" здесь
только напоминает о том, что за счет эндосмоса нуклеиновые
кислоты "сносит" в сторону, противоположную направлению их
миграции. Коэффициент представляет собой отношение скоро-
стей миграции незаряженного полимера (за счет только эндос-
моса) и сходного с ним по структуре полианиона при электро-
форезе в агарозе данного типа. Для обозначения типов агарозы
ниже будет использована номенклатура фирмы "Miles". По дан-
ным каталогов, в частности по значениям -mr ее нетрудно сопо-
ставить с обозначениями других фирм, тем более что большин-
ство из них получает свои препараты от одного и того же произ-
водителя - фирмы "Marine Colloids Inc.".
Для агарозы с малой степенью эндосмоса (тип LE) -mr=
= 0,1 - 0,15. Для агарозы типа НЕ характерен сильно выражен-
ный эндосмос (-mr = 0,23 - 0,26). Агароза типа ME занимает
промежуточное положение (-mr = 0,15 - 0,2). Чем меньше в ага-

18

розе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электростати-
ческого отталкивания между молекулами полимера и выше их
способность к связыванию водородными связями. Агароза с по-
вышенными температурами плавления и гелеобразования (тип
НGТ) имеет -mr < 0,1; именно она чаще всего используется
для обычного электрофореза. Вместе с тем специальная техно-
логическая обработка (введение оксиэтильных групп) позволя-
ет получать агарозу с малой степенью эндосмоса и пониженны-
ми температурами плавления и затвердевания - тип LGT ("Sea
plaque" по номенклатуре фирмы "Marine Colloids"). Такая ага-
роза может быть полезна тем, что ее 1%-ный раствор остается
жидким при физиологической температуре (37°); кроме того,
плавление геля можно осуществить при температуре более низ-
кой, чем температура денатурации ДНК. Наконец, для иммуно-
электрофореза, при котором иммуноглобулины мигрируют к ка-
тоду и эндосмос способствует, а не препятствует их разделению,
была разработана специальная агароза типа НЕЕО с сильно вы-
раженным эндосмосом (-mr > 0,3). Этого удалось добиться не
за счет увеличения числа сульфатов, содержание которых по-
прежнему не превышает 0,3%, поэтому неспецифическая сорб-
ция белков на агарозе этого типа почти не происходит.
Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лио-
филизированного порошка. Для приготовления геля выбранной
концентрации навеску порошка растворяют в соответствующем
буфере и выдерживают на кипящей водяной бане или в термо-
стате при 90-95° около 2 ч для образования истинного раство-
ра полимера. Иногда раствор агарозы просто кипятят с обрат-
ным холодильником.
Разнообразные буферы, детергенты и другие добавки смеши-
вают с раствором агарозы в горячем виде (при 50 - 60°). Они
не препятствуют ее застыванию. Впрочем, надо иметь в виду,
что высокая концентрация агентов, диссоциирующих водород-
ные связи, несколько затрудняет образование геля. Например,
гели обычной агарозы с 6 М мочевиной плавятся за 1,5 мин при
75°, но не застывают за 1 ч. при 20° [Langridge et al., 1980].
Контакт с кислородом воздуха не мешает застыванию ага-
розы, поэтому плоские гели для горизонтального электрофореза
готовят путем заливки дозированного объема расплавленной
агарозы на строго горизонтальную стеклянную пластинку нуж-
ного размера. Тем не менее горячую смесь агарозы с буфером
имеет смысл кратковременно деаэрировать под вакуумом.
Выбор концентрации агарозы, т. е. пористости ее геля, дик-
туется размерами фракционируемых макромолекул. Средний
размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответству-
ет диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с
массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием
агарозы используют для гель-фильтрации. При электрофорезе
поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биопо-
лимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом

19

поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют ага-
розные гели с концентрацией 0,4 - 2%. Ниже для ориентировки
представлены примерные концентрации гелей агарозы (в %)
для некоторых распространенных объектов фракционирования:
Высокомолекулярная ДНК вирусов и плазмид 0,4
Рестрикты ДНК (5 - 20 тыс. пар оснований) 0,7
мРНК, денатурированная обработкой метилртутью 1,0
Реовирусная двунитевая РНК (500 - 5000 пар оснований) 1,5
Рибосомная РНК 1,75
Нативные мРНК; рестрикты ДНК (100 - 1000 пар оснований) 2,0
Перед заливкой в форму или на пластину раствор горячей
агарозы охлаждают до 50° и выдерживают не менее 1 ч в тер-
мостате при данной температуре. Это необходимо для полного
выравнивания температуры раствора по всему его объему, чем
обеспечивается одновременное застывание всего геля и одно-
родность его структуры.
СМЕШАННЫЙ ГЕЛЬ (АГАРОЗА+ПААГ)
Электрофорез крупных белков иногда бывает целесообразно
вести в крупнопористом ПААГ, содержащем 1,5 - 2,5% акрила-
мида. Для придания прочности такому гелю его полимеризуют
совместно с 0,5 - 0,6% агарозы. Имеет место своеобразный "сим-
биоз": чистая 0,5%-ная агароза, застывая, дает очень мягкий
гель, 2%-ный ПААГ не удается даже заполимеризовать, а их
комбинация образует гели с отличными механическими характе-
ристиками.
Пространственная сетка агарозы в силу указанных выше
причин имеет гораздо более крупные поры, чем полимеризую-
щийся внутри этой сетки ПААГ, и мало влияет на электрофоре-
тическую подвижность белков, зато образует жесткий каркас,
придающий необходимую прочность гелю в целом. Для образо-
вания такой структуры надо обеспечить условия, при которых
агароза затвердевает раньше, чем полимеризуется ПААГ. Ис-
ходя из этого, подбирают концентрацию персульфата аммония
и ТЕМЕД.
Агарозу растворяют в буфере с учетом последующего раз-
бавления, прогревают, как описано выше, и выдерживают в те-
чение часа при 50°. При этой же температуре добавляют соот-
ветствующий раствор мономеров акриламида, быстро деаэри-
руют смесь, вносят инициирующие добавки и немедленно зали-
вают между подогретыми до 37° стеклами. Сначала застывает
агароза; полимеризация акриламида обнаруживает себя появ-
лением границы, лежащей на 2 - 5 мм ниже края геля агарозы.
Для обеспечения формирования узкой начальной полосы пре-
парата при вступлении его в гель имеет смысл спустя час после
окончания полимеризации ПААГ снять одну стеклянную пла-
стину и обрезать гель ниже границы полимеризации акрилами-
да. Затем можно снова наложить пластину, зажать гель и за-

20

лить поверх него 0,3%-ную чистую агарозу, в которой и форми-
ровать "карманы" для внесения препаратов [Schwinghamer,
Shepherd, 1980].
В качестве примера можно назвать успешное разделение пу-
тем электрофореза в смешанном геле (1,7% ПААГ + 0,5 агаро-
зы) полисом печени мыши от мономеров до пентамеров [Nishi-
naga, Yamamoto, 1980].
АЦЕТАТЦЕЛЛЮЛОЗНАЯ ПЛЕНКА,
ИМПРЕГНИРОВАННАЯ ПААГ
Вместо агарозы можно использовать жесткую, крупнопори-
стую пространственную сетку ацетатцеллюлозы. Полоску этого
полимера сначала помещают на поверхность раствора, где она
смачивается, а затем погружают в раствор мономеров акрила-
мида с инициирующими добавками. ПААГ полимеризуется во
всем объеме раствора, а также полоски целлюлозы. По оконча-
нии полимеризации гель с поверхности полоски можно отслоить
и отмыть. Таким способом нетрудно получить "пластинку" тол-
щиной 0,1 мм. Конец полоски следует оставить свободным от ге-
ля (не погружать). На него удобно наносить исходный белковый
препарат, который легко впитывается в ацетатцеллюлозу [Fren-
kel, Blagrove, 1978].
Глава 2
ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГЕЛЕЙ
И АППАРАТУРА
Рассмотрим основные технические приемы приготовления
и использования гелей для электрофореза. Это рассмотрение
целесообразно провести отдельно для трех вариантов аналити-
ческого электрофореза: вертикального в трубках, вертикально-
го в пластинах и горизонтального в пластинах. Приемы препа-
ративного электрофореза будут рассмотрены отдельно. Методы
подготовки препаратов, выбора буферов и различных добавок к
ним, а также условий протекания самого процесса электрофоре-
за будут детально исследованы далее, в главах 3 и 4, посвящен-
ных описанию различных вариантов электрофоретического
фракционирования белков и нуклеиновых кислот.
ВЕРТИКАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ТРУБКИ
Вертикальное расположение трубок и пластин имеет то пре-
имущество, что препарат, наносимый на гель сверху, при любом
его объеме равномерно покрывает всю рабочую поверхность ге-
ля. Затруднения при вертикальном расположении могут возни-

21


Рис. 5. Прибор для электрофореза
в вертикальных трубках (в разре-
зе)
1 - верхний электродный резервуар;
2 - центральный цилиндр; 3 - верхний
платиновый электрод; 4 - резиновая
прокладка; 5 - трубочка с гелем; 6 -
нижний электродный резервуар; 7 -
нижний платиновый электрод

кать для гелей, недостаточно прочно сцепленных со стеклом (см.
выше). Под действием собственного веса они могут постепенно
сползать вниз. Реальные трудности такого рода возникают,
главным образом, в случае препаративного электрофореза, ког-
да соотношение поверхности и объема колонок геля способству-
ет его сползанию.
Все приборы с вертикальным расположением гелей конструк-
тивно сложнее, чем аппараты с горизонтальным расположени-
ем, так как верхний электродный резервуар должен быть под-
нят над гелем. Приходится заботиться об уплотнениях в местах
сочленения его с трубками или пластинами. В приборах с труб-
ками для уплотнения обычно служат резиновые кольцевые про-
кладки, укрепленные в отверстиях на дне верхнего резервуара.
Схема такого прибора показана на рис. 5.
Трубки (12 - 18 штук) с уже заполимеризованным в них ге-
лем вставляют снизу в резиновые прокладки так, чтобы их верх-
ние концы выступали над дном резервуара. Если используют не
все трубки, то на их место ставят заглушки. Собранный вместе
с трубками верхний электродный резервуар устанавливают на
нижний так, чтобы концы трубок оказались на некотором рас-
стоянии от дна последнего и заполняют нижний резервуар элек-
тродным буфером, нередко до такого уровня, что трубки оказы-
ваются почти полностью погруженными в буфер. Это делается
для улучшения теплоотвода в процессе электрофореза С этой
же целью нижний буфер перемешивают магнитной мешалкой
или вводят дополнительную систему с циркуляцией охлаждаю-
щей воды. Оба резервуара цилиндрической или прямоугольной
формы изготавливают из плексигласа, что позволяет следить за
продвижением фронта красителя в процессе электрофореза.
В резервуарах должны быть закреплены электроды из платино-
вой проволоки. Нижний электрод при этом должен располагать-

22

ся так, чтобы поднимающиеся от него пузырьки газа не попада-
ли на нижние торцы трубок, что создавало бы помехи протека-
нию через них тока. Объемы электродных резервуаров доста-
точно велики, чтобы рН находящегося в них буфера не изменял-
ся под влиянием продуктов электролиза.
Стеклянные тонкостенные трубки, в которых ведут электро-
форез, чаще всего имеют внутренний диаметр 5 - 6 мм и длину
около 10 см. Фирма "Bio-Rad" в своем приборе модели 155 пред-
лагает широкий набор трубок с внутренним диаметром от 2 до
14,6 мм и длиной от 7,5 до 30 см. Их можно монтировать в пяти
сменных верхних резервуарах. Торцы трубок отшлифованы. При
изготовлении трубок в лаборатории не следует оплавлять их в
пламени горелки во избежание образования незаметного на
глаз сужения, которое будет мешать извлечению геля после
окончания электрофореза.
Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок за-
клеивают парафильмом или лейкопластырем и устанавливают
их строго вертикально в штатив. Деаэрированный раствор моно-
меров сразу после добавления и надежного смешивания с ним
раствора персульфата аммония заливают по стенке трубки из
пипетки с полиэтиленовым наконечником так, чтобы верхний
участок трубки, предназначенный для внесения препарата, ос-
тавался сухим. Затем осторожно по стенке наслаивают воду или
изобутанол и ведут полимеризацию, как описано в предыдущем
разделе. Если готовят гель для ступенчатого электрофореза
(см. ниже), то после окончания полимеризации нижнего (рабо-
чего) геля воду стряхивают, споласкивают поверхности буфером
верхнего (формирующего) геля и точно так же заливают слой
раствора мономеров верхнего геля, а затем наслаивают на него
воду или изобутанол. Перед установкой готовой трубки с гелем
в прибор парафильм снимают, а ее свободный конец промывают
верхним электродным буфером.
Собрав прибор, заливают буфер в верхний электродный ре-
зервуар. При полимеризации геля часть трубки с верхнего ее
конца оставляют свободной, и туда при заливке попадает элек-
тродный буфер. Затем под него, на поверхность геля, пипеткой
с оттянутым полиэтиленовым наконечником наслаивают препа-
рат, в который добавляют предварительно 5 - 10% сахарозы.
Наконечник пипетки не следует подносить вплотную к поверхно-
сти геля; препарат должен выливаться с высоты 2 - 3 мм над
гелем и свободно растекаться по его поверхности за счет своей
повышенной плотности. При любом варианте электрофореза на-
до быть уверенным в том, что исходный препарат свободен от
взвешенных частиц (пыли или осадков), которые будут соби-
раться на торце геля и нарушать однородность тока по его сече-
нию, что повлечет за собой деформацию разделяющихся зон.
В этом случае препарат следует отфильтровать или очистить
центрифугированием.

23

Рис. 6. Система для обра-
зования линейного градиен-
та концентрации ПААГ в
трубках
1 - пачка трубок; 2 - перисталь-
тический насос; 3 - смеситель
градиента


Выше уже упоминалось о возможности использования гра-
диента пористости геля с изменяющимся по его длине, т. е. по
высоте трубки, содержанием акриламида. Были также приведе-
ны соображения, касающиеся подбора концентраций иниции-
рующих добавок в этом случае. Преимущества таких "градиент-
ных" гелей будут рассмотрены ниже. Для получения градиент-
ных гелей используют такие же смесительные устройства, как
при создании градиентов плотности сахарозы для ультрацент-
рифугирования. В этом случае также можно получать линейные
и нелинейные градиенты, "выпуклые" и "вогнутые", в том чис-
ле экспоненциальные.
В смеситель можно поместить раствор мономеров с макси-
мальным содержанием акриламида, а в резервуар смесительно-
го устройства - соответственно разбавленный раствор. Затем
можно заливать закрытую снизу трубку по стенке подобно цен-
трифужной пробирке, однако это довольно неудобно ввиду ма-
лого объема трубки (2 - 4 мл). Кроме того, почти всегда жела-
тельно иметь несколько трубок с заведомо одинаковой формой
градиента, поэтому лучше заливать одновременно целую пачку
параллельно расположенных трубок. Всю пачку, скрепив ее ре-
зинками, закрепляют вертикально в стакане таким образом, что-
бы нижние торцы трубок были слегка приподняты над его дном,
Через отросток, припаянный у дна стакана (или через одну из
трубок), насосом подают градиент смеси мономеров (рис. 6)
Заполнение трубок идет снизу вверх, поэтому в смесителе гради-
ентного устройства должен находиться раствор мономеров ма-
лой концентрации, а в резервуаре - концентрированный рас-
твор. В него следует добавить до 10% сахарозы, чтобы по мере
поступления в стакан с трубками плотность жидкости заметно
увеличивалась одновременно с повышением содержания акри-
ламида. Это обеспечит равномерное оттеснение менее концент-
рированных слоев вверх по трубкам. По окончании заполнения
в каждую трубку следует наслоить одинаковое (и минимально
необходимое) количество воды или изобутанола. Еще лучше на-
чинать заполнение трубок с воды, а в раствор мономеров, нахо-
дящийся в смесителе, добавить 2% сахарозы.

24

Следует помнить о необходимости промывки смесительного
устройства и системы подачи растворов в стакан сразу после
окончания их использования, до того как в них произойдет по-
лимеризация акриламида. Разумеется, для этого всю систему
нужно отсоединить от стакана, зажав предварительно подво-
дящую к нему трубку.
По окончании полимеризации всю пачку трубок следует из-
влечь из стакана, разнять, с каждой удалить гель (снаружи) и
обрезать его излишек у нижнего конца. Возможно, хотя техни-
чески и более сложно, создание линейного градиента ПААГ за
счет перемешивания двух одинаковых по высоте слоев раствора
мономеров разной концентрации в наклонном положении [Lo-
rentz, 1976].
В описанном приборе для вертикального электрофореза элек-
трическая цепь надежно замыкается непосредственными кон-
тактами обоих концов трубок с электродными буферами. Одна-
ко надо следить за тем, чтобы на нижних торцах гелей не было
пузырьков воздуха, оставшихся там с момента погружения тру-
бок в нижний резервуар. Пузырьки можно удалить струёй жид-
кости, направленной из шприца с согнутой иглой.
По окончании электрофореза гель из трубки извлекают.
В большинстве случаев это легко сделать с помощью длинной и
затупленной иглы шприца, которую вводят с одного из концов
трубки, круговыми движениями постепенно отслаивая гель от
ее стенок. Если необходимо, такую операцию повторяют и с дру-
гого конца. Через иглу при этом поступает вода из закрепленно-
го несколько выше иглы резервуара (или от насоса). Если гель
отслаивается с трудом, в воду можно добавить 0,5 - 1% какого-
нибудь детергента. Во избежание поломки следует дать гелю
возможность выскользнуть из трубки в сосуд с водой, над кото-
рым проделывают описанную манипуляцию. Иногда для удале-
ния геля из очень длинных трубок по его периферии с концов
трубки впрыскивают глицерин, а сам гель выталкивают водой
из присоединяемого к трубке шприца. Если гель высокой кон-
центрации вынуть не удается, его приходится замораживать, а
трубку разбивать молотком. Иногда можно решить проблему
путем вымачивания трубки с гелем в метаноле: гель постепенно
съеживается и отстает от стенки.
Основным недостатком электрофореза в трубках является
затрудненный отвод тепла даже при диаметре 5 мм. На оси ге-
ля температура оказывается выше, чем у его прилегающей к
стеклу поверхности. Это приводит к изгибу зон и соответствен-
но окрашенных полос, поскольку электрофоретическая подвиж-
ность зависит от температуры. В условиях хорошего теплоотво-
да можно вести микроэлектрофорез в стеклянных капиллярах
диаметром 0,7 - 1,5 мм [Condeelis, 1977].

25
ВЕРТИКАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ПЛАСТИНЫ
Для электрофореза белков обычно используют пластины
шириной 8 - 14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8 -
28 см. Электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов, на-
пример при секвенировании, нередко ведут в больших пласти-
нах размером 33 ? 43 см, что диктуется максимальным размером
рентгеновской пленки для авторадиографии. Для разделения гид-
ролизатов тРНК Пиртл и др. недавно использовали пластины
ПААГ длиной 90 см [Pirtle et al., 1980].
Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а за-
тем и сам электрофорез ведут в форме, образованной двумя
пластинами зеркального стекла толщиной 5 - 6 мм. Расстояние
между пластинами задается толщиной прокладок из тефлона
или плексигласа ("спейсеров") и определяет толщину геля.
Прокладки шириной 10 - 15 мм устанавливают вдоль боковых
краев стекол. Для аналитических целей, как правило, исполь-
зуют пластины геля (и соответственно прокладки) толщиной от
0,4 до 1,5 мм. Эти же прокладки можно использовать и для уп-
лотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердев-
шего геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно
такой же толщины (фрезеровать совместно!) по нижнему краю
стекол и плотно прижимают ее к фрезерованным торцам боко-
вых прокладок.
Хорошо подогнанные тефлоновые прокладки в силу гидро-
фобности материала можно не смазывать. Прокладки из плек-
сиглаза смазывают силиконовой смазкой. Тонкий валик смазки
из шприца без иглы наносят сначала с одной стороны трех хоро-
шо промытых детергентом прокладок (примерно посередине), а
также на нижние торцы двух из них (боковых). Боковые про-
кладки накладывают на одно из стекол формы смазкой вниз и
к ним вплотную придвигают так же уложенную нижнюю про-
кладку. Руками (в перчатках) прижимают прокладки к стеклу,
следя за тем, чтобы смазка не выдавливалась из-под них в по-
лость формы. На образовавшуюся таким образом П-образную
прокладку снова так же наносят сплошной валик смазки по все-
му периметру и накладывают второе стекло. Всю систему зажи-
мают по трем сторонам пружинными зажимами для бумаг.
При заливке агарозы уплотнение формы можно осуществить
проще - заклеить торцы стекол липкой лентой (лейкопласты-
рем). Нижнюю прокладку при этом можно не устанавливать.
Уплотнение не будет совершенным, но агароза в контакте с про-
кладками и лентой быстро застынет и заметного ее вытекания
не произойдет. Для надежности можно сначала залить неболь-
шой слой агарозы и дать ей застыть в нижней части формы, а
потом залить остальной ее объем.
Описано применение в качестве прокладки П-образной по-
лоски силиконовой резины с разрезом, позволяющим отнимать
ее нижнюю часть после полимеризации геля. Такая прокладка

26

не нуждается в смазке [Stein, Varricchio, 1974]. Можно вместо
нижней прокладки сделать в нижней части формы "пробку" из
ПААГ повышенной концентрации. Для этого собранные с боко-
выми прокладками пластины (или пачку пластин) устанавлива-
ют в корытце, заполненное раствором мономеров с инициирую-
щими добавками, так, чтобы заполнить нижнюю часть формы
на высоту 1 см и захватить при этом концы боковых прокладок.
Для успешной полимеризации на раствор мономеров наслаива-
ют воду. После полимеризации геля во всем объеме корытца и
внутри формы пластины вынимают и лишний ПААГ обрезают.
Перед заливкой рабочего геля следует отсосать воду над проб-
кой и промыть поверхность буфером геля. Фирма "Bio-Rad"
предлагает для заливки пластин геля простое устройство, по-
зволяющее с помощью винтов прижать собранные с боковыми
прокладками стекла нижними торцами к полоске мягкой рези-
ны. Иногда, особенно для гелей толщиной менее 1 мм, нижнее
уплотнение осуществляют просто пластилином.
Собранную и уплотненную одним из описанных способов
форму устанавливают вертикально и заливают в нее раствор
мономеров ПААГ или расплавленную агарозу. Впрочем, ПААГ
толщиной 0,4 мм можно заливать в наклонном, а полимеризо-
вать - в горизонтальном положении пластин. Это значительно
упрощает задачу герметизации формы: достаточно оклеить ее
по торцам пластин водостойкой липкой лентой.
В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут
электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно за-
тем сопоставить при идентичных условиях разделения. Как бы-
ло показано на фотографии (см. рис. 3), сопоставляемые препа-
раты фракционируют в параллельных друг другу "треках".
В ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд
одинаковых углублений прямоугольной формы - "карманов",
куда затем и вносят различные препараты. Для этого в еще не
заполимеризовавшийся гель или горячую агарозу вставляют
"гребенку" из тефлона или плексигласа такой же или чуть мень-
шей толщины, чем прокладки между стеклами. Прямоугольные
зубцы гребенки и формируют карманы для препаратов. На рис.
7 изображена собранная форма с вставленной в гель гребенкой.
На боковом сечении можно видеть, что верхняя часть гребенки
немного толще, чем нижняя (с зубцами). Это удобно, так как
гребенка ставится каждый раз одинаково и ровно - до упора
выступа о торец стеклянной пластины. Кстати, на рис. 7 показа-
ны и прокладки (пунктир). Можно заметить, что нижнюю про-
кладку делают чуть длиннее ширины стекол, так что ее концы
выступают наружу. За эти концы нижнюю прокладку и выни-
мают из формы после застывания геля. Для ясности на чертеже
показаны только три зажима (с правой стороны пластин).
Гель или агарозу заливают между пластинами с таким рас-
четом, чтобы при опускании гребенки до упора жидкий гель за-
полнил промежутки между ее зубцами. Гребенку начинают

27


вставлять с некоторым переко-
сом, чтобы под ее зубцами не за-
держивались пузырьки воздуха.
Для этой цели торцы зубцов
предварительно смачивают, по-
терев их о стекло с налитым на
него раствором акриламида.
В тех случаях, когда готовят
двухслойный гель, по окончании
полимеризации нижнего геля во-
ду отсасывают, поверхности про-
мывают буфером верхнего геля,
заливают этот последний и уже
в него устанавливают гребенку.
Рис. 7. Форма для полимеризации
вертикальной пластины геля
1 - стеклянные пластины; 2 - прокладки;
3 - гребенка; 4 - зажим
Когда гель готов, вынимают
нижнюю прокладку или снимают
липкую ленту и осторожно вы-
таскивают гребенку. При работе
с концентрированным ПААГ гель может прилипать к зубцам
гребенки и нижние плоскости карманов могут оказаться не-
ровными. Это ухудшает условия формирования исходных полос
в геле.
В таком случае имеет смысл ввести еще один слой геля
пониженной концентрации и гребенку устанавливать в него. На
границе между двумя слоями разной пористости полоса ис-
ходного препарата будет выгодным образом сужаться.
Перегородки между близко расположенными карманами в
агарозе малой концентрации могут оказаться непрочными. Опи-
сан вариант формы, в которой одну из пластин изготавливают из
плексигласа с рядом фрезерованных узких перегородок в ее
верхней части, выступающих на всю толщину зазора между пла-
стинами. Гребенку вставляют между этими перегородками, но
не на всю их длину. Зубцы гребенки хорошо подогнаны по ши-
рине интервалов между перегородками, так что форма оказыва-
ется уплотненной с ее будущего верхнего края. Перевернув фор-
му, заливают агарозу с противоположной стороны. После за-
стывания агарозы и удаления гребенки карманы для препаратов
оказываются разделенными перегородками из плексигласа, кон-
цы которых погружены в гель [Sugden et al., 1975].
Для получения пластин с градиентом пористости геля по вы-
соте используют те же приемы, что описаны выше. Для одной
пластины смесь подают на дно формы через тонкую стеклянную
трубку, прижатую к боковой прокладке. Разумеется, в этом слу-
чае смеситель градиентного устройства должен содержать смесь
мономеров малой концентрации, а резервуар - более концент-
рированную смесь с добавкой сахарозы. Чтобы не нарушить гра-
диента при вынимании трубки, ее можно оставить в полимери-
зующемся геле.

28

Возможно одновременное заполнение целой стопки открытых
снизу форм для геля (без нижних прокладок), которое проводят
в сосуде прямоугольной формы, как описано выше для пучка
трубок. Фирма "Pharmacia" (Швеция) предлагает для этой це-
ли специальный сосуд прямоугольного сечения, где два любых
набора могут быть зажаты с помощью клиньев, скользящих по
двум наклонным плоскостям. Градиент концентрации акрила-
мида подают на дно каждого из двух отделений сосуда через
отдельные штуцеры. На фотографии (рис. 8) в сосуд установле-
на только одна пачка пластин. Бесполезный расход акриламида
и загрязнение им пластин снаружи при использовании такого
сосуда сведены до минимума. Подобного рода устройство из
плексигласа для пластин любого размера легко изготовить в ла-
боратории. Кстати, в нем удобно заливать и обычные, не гра-
диентные гели. Еще проще стопку пластин с боковыми проклад-
ками безо всякой герметизации поместить в полиэтиленовый
мешок, плотно обернуть его вокруг пластин, зажать всю стопку
и залить обычный гель прямо в мешок. После полимеризации
мешок снимают, а излишки геля с нижних концов пластин обре-
зают [Kerckaert, 1978].
Линейный градиент пористости геля в пластине или трубках
можно создать смешиванием двух слоев растворов мономеров
разной концентрации путем многократного переворачивания
пластины или трубок в наклонном положении.
В литературе описано много конструкций приборов для
электрофореза в вертикальных пластинах. Ряд моделей предла-
гают различные фирмы. Наибольшее распространение получила
конструкция прибора из плексигласа, предложенная Стадиером
(рис. 9) [Studier, 1973]. Ее легко реализовать и в лабораторных
условиях. Верхний и нижний электродные резервуары прямо-
угольной формы соединены вертикальной стенкой, в которой
имеется вырез, ведущий в полость верхнего резервуара. Такой
же вырез имеет одна из двух стеклянных пластин, между кото-
рыми полимеризуется гель. Пластины прижимают пружинными
зажимами к вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпа-
ли. Буфер в верхний резервуар заливают до такого уровня, что-
бы он через вырез покрывал верхний торец геля. При этом вто-
рая, не вырезанная, стеклянная пластина выступает в роли пе-
редней стенки резервуара. В месте совмещения двух вырезов,
между стеклянной пластиной и стенкой, должно быть осущест-
влено уплотнение, препятствующее вытеканию верхнего буфера.
Стадиер использовал для этой цели заливку агаром. Фирма
"Bio-Rad" в своих моделях 220 и 221 использует ту же конструк-
цию, но обеспечивает уплотнение с помощью резиновой про-
кладки.
В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой
проволоки. При установке в прибор форму с гелем частично по-
гружают в буфер нижнего резервуара, так что она опирается
там на разнесенные по сторонам выступы и ее нижний торец

29


Рис. 8. Сосуд для формирования градиента концентрации ПААГ в пластинах
(фирмы. "Pharmacia")

Рис. 9. Прибор Стадиера для электрофореза в вертикальных пластинах [Stu-
dier, 1973]

30
оказывается приподнятым над дном резервуара. После погру-
жения надо внимательно проверить, не осталось ли между пла-
стинами и на торце геля пузырьков воздуха. Их можно удалить
струёй жидкости из согнутой иглы шприца.
Препараты с добавленной в них сахарозой или глицерином
вносят в карманы геля после окончательной сборки прибора
так же, как и в трубки, т. е. подслаивают их под электродный
буфер на дно каждого из карманов. Их можно заполнять пре-
паратом (постепенно поднимая кончик пипетки) почти на пол-
ную высоту. Приемы заполнения были описаны выше.
Недавно был предложен очень простой, целиком (включая
пластины для геля) изготовленный из плексигласа прибор для
вертикального электрофореза в пластинах [Broadmeadow, Wil-
се, 1979]. В нем используется схема Стадиера, но пластины по
всей высоте омываются и охлаждаются с обеих сторон элект-
родным буфером. Верхний и нижний буферы непрерывно пере-
мешиваются и охлаждаются, проходя через находящийся вне
прибора змеевик. Этим компенсируется худшая, чем у стекла,
теплопередача через плексиглас. Для гелей малой концентрации
этот прибор, по-видимому, непригоден ввиду относительно сла-
бого сцепления ПААГ с плексигласом.
Некоторые фирмы используют для пластин такой же способ
установки в прибор, что и для трубок. Пластины вставляют
снизу через прорези в дне верхнего электродного резервуара.
Уплотнение осуществляют при помощи резиновых прокладок
прямоугольного сечения. Собранные формы с гелем закрепляют
за счет трения в прорезях прокладок ("Bio-Rad", "Pharmacia")
либо прижимают к ним шлифованными торцами ("Desaga").
В любом случае пластины должны быть изготовлены точно, по-
этому приходится ограничиваться использованием фирменных
пластин и гелей определенной толщины.
Необходимость интенсивного теплоотвода от большой по-
верхности пластин заставляет некоторые фирмы вводить в при-
бор для электрофореза змеевик с охлаждающей жидкостью и
насос, обеспечивающий циркуляцию электродных буферов.
Впрочем, в случае тонких гелей воздушное охлаждение оказы-
вается вполне достаточным. Протекающий ток нагревает гель до
некоторой равновесной температуры, но в тонком слое геля эта
температура оказывается практически одинаковой по всему его
сечению. Именно это обстоятельство является решающим для
обеспечения хорошего качества разделения.
В приборе Стадиера можно обойтись и без вырезов в стенке
и пластине, а также без уплотнения, если электрическую цепь
между верхним буфером и гелем замкнуть через смоченные тем
же буфером фитили из фильтровальной бумаги [De Wachter, Fi-
ers, 1971]. Конструкция прибора становится совсем простой, и
отпадает необходимость делать вырезы в стеклянных пластинах.
Тем не менее этот способ нельзя рекомендовать во всех случаях
аналитического электрофореза, так как он имеет один недоста-

31

ток: открытые фитили могут неконтролируемым образом не-
сколько обсыхать. Это приводит к изменению их электрического
сопротивления, а следовательно, напряжения и тока, текущего
через гель (см. ниже).
По окончании электрофореза пластины разнимают, отслаи-
вая одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают
между пластинами со стороны карманов и слегка поворачива-
ют. Эту операцию не следует форсировать; лучше сначала прой-
ти шпателем с легким нажимом вдоль всего края пластины, на-
блюдая за тем, как между стеклом и гелем постепенно прони-
кает воздух, а потом уже приподнять пластину. Со второй пла-
стины гель снимают руками и переносят в ванночку для фикса-
ции или окраски. Хотя всегда есть возможность поднять гель с
пластины за "нерабочий" конец, лучше все же работать в пер-
чатках. Случайное прикосновение кожи рук к рабочей поверх-
ности геля при современных чувствительных методах окрашива-
ния может оставить на геле артефактное белковое пятно. При
авторадиографии влажный гель, лежащий на одной пластине,
можно прямо заворачивать в полиэтиленовую пленку.
ГОРИЗОНТАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ПЛАСТИНЫ
Преимущество такого расположения - не только в компакт-
ности прибора, но и в отсутствии проблемы уплотнения. Оба
электродных буфера находятся в резервуарах, расположенных
ниже уровня горизонтального столика, на который кладут гель.
Естественно, что этот столик используется и для отвода тепла
от пластинки геля - в его каналах циркулирует охлаждающая
вода.
Гель, полимеризованный на тонкой стеклянной пластинке,
помещают на столик открытой поверхностью кверху, поскольку
препарат вносят не с торца геля, а в ряд специальных "колод-
цев", расположенных на некотором расстоянии от его края.
Электрическая цепь замыкается через 8 - 10-слойные фитили из
фильтровальной бумаги, одним концом погруженные в элект-
родные резервуары, а другим - прижатые к гелю с перекрытием
в 10 - 12 мм (рис. 10, 11). При наложении фитилей на гель сле-
дует внимательно следить за отсутствием воздушных пузырей
между ними.
Показанные на рис. 10 перегородки в электродных камерах
препятствуют конвекционному переносу продуктов электролиза
от электродов к концам фитилей. В ходе электрофореза на ано-
де образуется свободная кислота, а на катоде - щелочь, кото-
рые по плотности отличаются от электродных буферов, а это
может вызвать конвекцию. Если электрофорез идет более 24 ч,
электродные буферы следует заменять. Если же они одинаковы
и между электродными резервуарами обеспечена циркуляция
жидкости, то кислота и щелочь взаимно нейтрализуются - и бу-
фер можно не заменять. В изображенном на схеме приборе

32

"Мультифор" (LKB, Швеция) циркуляция буфера не преду-
смотрена, но объем каждой камеры составляет 1,2 л.
Во избежание подсыхания фитилей и геля прибор во время
работы закрывают прозрачной крышкой (рис. 12), которую ино-
гда называют антиконденсационной. Она предохраняет гель в
случае существенного охлаждения от конденсации на его поверх-
ности влаги из окружающего воздуха. Впрочем, сама крышка
изнутри может запотевать за счет влаги, испаряющейся с фити-
лей, особенно в случае их перегрева. Это ухудшает условия на-
блюдения за ходом электрофореза, поэтому в аналогичном по
конструкции приборе фирмы "Bio-Rad" (модель 1415) по пери-
метру крышки у ее краев с внутренней стороны проходит трубка
с охлаждающей водой. Пары влаги конденсируются на трубке,
оставляя крышку прозрачной. Электродные резервуары у этого
прибора съемные, что облегчает их промывку. В качестве фити-
лей используется специально обработанная целлюлоза с повы-
шенной влагоемкостью.


Рис. 10. Схема прибора "Муль-
тифор" для электрофореза в
горизонтальных пластинах
(фирмы LKB)
1 - антиконденсационная крышка;
2 - электродный резервуар; 3 - ко-
лодец для внесения препарата; 4 -
гель; 5 - фитиль; 6 - охлаждающий
столик

стр. 1
(всего 4)

СОДЕРЖАНИЕ

>>