<<

стр. 2
(всего 4)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

Рис. 11. Наложение фитилей
на гель в приборе "Мульти-
фор"



33





Рис. 12. Наложение антиконденсацион- Рис. 13. Внесение препарата в ко-
ной крышки лодцы геля
Описанные приборы не предъявляют строгих требований к
качеству полимеризации геля у его краев, поскольку края геля
не участвуют в электрофорезе. Полимеризацию пластины ПААГ
для прибора "Мультифор" ведут в форме, уплотненной по всем
четырем краям сплошной резиновой прокладкой. У одного из
своих углов она разрезана, и через этот разрез, слегка отогнув
прокладку, заливают раствор мономеров в форму. Последняя
образована двумя пластинами: стеклянной (толщиной 1 мм) и
толстой плексигласовой. На стеклянной пластине гель остается
во время электрофореза. Пластину из плексигласа после поли-
меризации геля снимают; на ней имеется ряд прямоугольных
выступов, которые при заливке формируют колодцы для внесе-
ния препаратов. Колодцы имеют фиксированный объем (для
"Мультифора" - 5 и 10 мкл). В таком же объеме надо вносить
и препарат, чтобы он заполнял все сечения геля, но не разли-
вался по его поверхности. Для этого препарат дозируют микро-
шприцем (рис. 13).
При сборке формы на стеклянную пластину накладывают
еще одну толстую пластину из плексигласа и все вместе зажи-
мают пружинными зажимами. Здесь нет необходимости наслаи-
вать воду, да и к материалу уплотнительной прокладки можно
не предъявлять высоких требований, поскольку в контакте с ней
гель может и не заполимеризоваться. После освобождения геля
оставшийся раствор мономеров по его краям можно убрать филь-
тровальной бумагой. Для облегчения разборки формы ее сле-
дует охладить в холодильнике.
Перед использованием ПААГ желательно выдержать не ме-
нее 12 ч обернутым в полиэтиленовую пленку во избежание под-
сыхания. Гели, содержащие додецилсульфат натрия (ДДС-Na),

34

не следует хранить в холодильнике, так как ДДС-Na мо-
жет выпасть в осадок. При установке пластины с гелем на ох-
лаждающий столик следует налить на него несколько милли-
литров раствора детергента, чтобы обеспечить хороший тепловой
контакт между столиком и пластиной. До этого имеет смысл про-
вести на столике водонесмываемым фломастером две линии на
расстоянии примерно 15 - 20 мм от каждого из противополож-
ных краев. Эти линии будут видны через гель и помогут ровно
уложить края фитилей, что немаловажно для создания в геле
однородного электрического поля.
Следует быстро вносить препараты в колодцы и сразу же
начинать электрофорез, так как бромфеноловый краситель
склонен диффундировать в геле. В процессе разделения нужно
следить за тем, чтобы колодцы с оставшимся в них буфером пре-
парата не обсыхали. Это нежелательно, так как искажает рас-
пределение тока по сечению геля. В ходе электрофореза можно
пополнять колодцы буфером или с самого начала добавить в
препарат 10-20% глицерина.
После электрофореза можно хранить гель на том же стекле,
обернув его целлофаном, или предварительно перенести на ме-
таллическую фольгу. Можно положить на гель фильтровальную
бумагу, которая хорошо к нему прилипает, и снять стекло. На
этой же бумаге (после фиксации и окрашивания) гель можно
и высушить.
Пластины для горизонтального электрофореза в агарозе
можно приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально ус-
тановленную (по уровню) плоскость кладут тонкое стекло опре-
деленного размера и на него выливают расплавленный раствор
агарозы в буфере. Его объем надо рассчитать или подобрать
так, чтобы получить пластину нужной толщины. Колодцы для
препаратов в этом случае можно и не делать. Фирма LKB реко-
мендует наносить препараты прямо на поверхность агарозы че-
рез прорези наложенного на пластину специального шаблона со
щелями. Препарат объемом 2 - 4 мкл вносят в щель шаблона,
откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравни-
тельно простое приспособление, смонтированное на столике для
заливки, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно
к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при заливке агарозы
образовать колодцы для препаратов. Перед использованием
пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфе-
ре в течение суток.
При электрофорезе нуклеиновых кислот в агарозе использу-
ют относительно большие токи, которые могут нагревать фити-
ли из фильтровальной бумаги. Было предложено фитили делать
тоже из агарозы - заливкой ее 1 - 2%-ного раствора в специ-
альные камеры; описаны конструкции соответствующих прибо-
ров [Kaplan et al., 1977; McDonell et al., 1977; Herrick, 1980].
На рис. 14 показан разрез одного из таких простых приборов.
В приборе фирмы "Bio-Rad" (модель 1415) фитилями из 0,5%-

35

Рис. 14. Прибор для препа-
ративного горизонтального
электрофореза ДНК в ага-
розном геле с агарозными
фитилями
1 - электродные резервуары; 2 -
форма для заливки агарозы;
3 - съемные перегородки; 4 -
гребенка


ного геля агарозы толщиной 6 мм оснащены специальные мо-
стики, на которых можно вести препаративный электрофорез
ДНК в пластинах геля агарозы толщиной до 1 см.
Вместе с тем для работы с микроколичествами препарата
описано приготовление гелей для горизонтального электрофоре-
за толщиной 0,1 мм на предметных стеклах. После высушива-
ния такой гель образует настолько тонкую, не заметную глазом
пленку, что она позволяет вести авторадиографию даже мечен-
ных 3H препаратов [Amaldi, 1972].
Высоковольтный горизонтальный электрофорез в пластинах
ПААГ толщиной 0,5 мм был использован для секвенирования
нуклеиновых кислот. Для улучшения теплоотвода гель разме-
ром 30 ? 50 см, подложив под него тонкую пленку, укладывали
на металлический охлаждающий столик самодельного прибора,
накрывали еще одной пленкой и плотно, по всей поверхности
прижимали к столику давлением наполненной воздухом подуш-
ки [Kutateladze et а1., 1979].
36

Глава 3
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ
В двух предыдущих разделах были детально описаны прак-
тические приемы подготовки и проведения опытов по электро-
форезу. Это позволяет приступить к подробному анализу, си-
стематизации и сопоставлению физической сущности и потенци-
альных возможностей многочисленных и разнообразных вари-
антов этого метода, развитых за последние годы. В главах 3 и 4
мы попытались представить более или менее целостную картину
бурного развития электрофоретических методов исследования
белков и нуклеиновых кислот по состоянию на середину 1980 г.
Главная задача изложения - выяснение существа и возможно-
стей каждого из рассмотренных ниже вариантов. Однако следу-
ет еще раз подчеркнуть абсолютную необходимость совершен-
ного овладения описанной выше техникой эксперимента, без
которой попытки реализации самых блестящих замыслов зара-
нее обречены на провал.
Из множества рассмотренных ниже экспериментальных ра-
бот в интересах экономии места и концентрации внимания на
главном будут взяты только самые существенные количествен-
ные данные. Не следует пытаться по ним воспроизвести эти ра-
боты - для этого необходимо тщательно изучить цитируемый
первоисточник.
Рассмотрению конкретных вариантов в обеих главах пред-
посланы довольно подробные замечания общего характера, ко-
торые постоянно следует иметь в виду при анализе и сопостав-
лении этих вариантов.
ЗАМЕЧАНИЯ ОБЩЕГО ХАРАКТЕРА
Миграция белков в геле
Ранее было показано, что электрофоретическая подвижность
биополимеров в геле (и') пропорциональна их подвижности в
свободной жидкости (uо), которая определяется отношением
суммарного заряда макромолекулы к ее массе. Фактором, об-
условливающим отличие и' от uо является сила трения о гель,
которая зависит от соотношения линейных размеров макромо-
лекул и пор геля, а следовательно, от молекулярных масс бел-
ков и концентрации ПААГ. Молекулярные массы подавляюще-
го большинства индивидуальных белков не превышают 500 000.
Поэтому использование гелей агарозы оказывается нецелесооб-
разным, кроме тех случаев, когда разделение белков хотят вести
только по величине отношения заряда к массе. Как правило,
электрофорез белков проводят в ПААГ, содержащем 5 - 20%
акриламида.
Белки являются, цвиттерионами. Их суммарным зарядом, а
следовательно и отношением заряда к массе, можно управлять

37

путем изменения рН буфера, в котором полимеризуют ПААГ и
ведут электрофорез и который далее будем именовать рабочим.
Очевидно, что оптимальное значение рН рабочего буфера обус-
ловливает не максимальный заряд, а максимальное различие
зарядов разных белков, составляющих исходную смесь. Поэто-
му в большинстве случаев нецелесообразно использовать экст-
ремальные величины рН рабочего буфера, слишком удаленные
от изоэлектрических точек всех белков смеси. Для обычных
кислых белков оптимальные значения рН буфера оказываются
в нейтральной или слабощелочной области; миграция белков
идет в направлении от катода к аноду. Для щелочных белков
(гистонов, белков рибосом и др.) целесообразно использовать
слабокислые буферы (рН 4 - 5). Эти белки различаются по ве-
личине суммарного положительного заряда и мигрируют в на-
правлении от анода к катоду.
Несмотря на малое количество фракционируемого белка, от
рабочего буфера требуется существенная емкость, так как при
образовании зоны локальная концентрация белка может ока-
заться значительной. Поэтому приходится использовать буферы
с концентрацией 0,1 - 0,2 М и более. При этом следует учиты-
вать, насколько близко к границе буферной области лежит рабо-
чее значение рН. Если такое приближение к границе необходи-
мо, то для обеспечения достаточной буферной емкости моляр-
ность буфера приходится еще увеличивать. Вопрос об электро-
проводности буферов рассмотрен ниже.
Отметим далее, что эффект трения о гель зависит не только
от молекулярной массы, но и от конфигурации и жесткости бел-
ковой макромолекулы. Глобулярные белки, неспособные к агре-
гации или диссоциации на субъединицы, ведут себя более или
менее одинаково, хотя их размеры зависят от плотности упа-
ковки глобулы. Рыхлые глобулярные и, особенно, фибриллярные
белки могут деформироваться при взаимодействии с гелем и тем
самым облегчать себе миграцию между его нитями. Этот эф-
фект особенно сильно выражен у высокомолекулярных нуклеи-
новых кислот.
Для однозначного определения молекулярной массы белка
по скорости его миграции при электрофорезе бывает целесооб-
разно распрямить полипептидную цепочку белка и придать ей
жесткость. Именно такой прием используется при электрофоре-
зе белков, обработанных додецилсульфатом натрия (подробно
это будет рассмотрено ниже).
Напряженность электрического поля (Н)
Разность потенциалов, или напряжение, приходящееся на
весь гель, обозначим через Е; тогда для однородного участка
геля длиной l Е = Нl. В проводящей ток жидкости приложен-
ному напряжению Е всегда отвечает некоторая сила тока I, ко-
торая в соответствии с законом Ома определяется суммарным

38

сопротивлением цепи R (I=E/R). В ПААГ проводящей жидко-
стью служит буфер, находящийся между нитями полимера.
Свой вклад в проводимость вносят и мигрирующие в геле заря-
женные макромолекулы, но ввиду их низкой концентрации этим
вкладом можно пренебрегать.
Электрическое сопротивление буфера определяется двумя
факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электро-
форетической подвижностью. Второй фактор играет очень важ-
ную роль. Например, при одинаковых концентрациях в двух бу-
ферах ионов С1- и СН3СОО- электропроводность первого буфе-
ра будет заметно выше, чем второго. Следует также помнить о
том, что электрический ток одинаков по всей длине электриче-
ской цепи, т. е. в любом сечении трубки или пластины. Разры-
вов или скачков тока по длине геля физически быть не может,
это аксиома. Иначе обстоит дело с напряжением или напряжен-
ностью электрического поля.
Если в любой электрической цепи последовательно включе-
ны два различных по своей величине сопротивления R1 и R2, то
одинаковый для всей цепи ток I протекает через первое из них
за счет падения на нем напряжения Е1=IR1, а через второе - за
счет Е2=IR2. Полное напряжение по всей электрической цепи
Е=Е1+Е2. Если R1 сильно отличается от R2, то и Е1 также от-
личается от E2. При изменении сопротивлений двух участков рас-
пределение напряжений на них может существенно измениться,
оставаясь в сумме своей неизменным.
Такая ситуация может возникать в ПААГ, состоящем из двух
последовательно расположенных участков, где при полимериза-
ции были использованы разные буферы (содержащие ионы с
разной подвижностью или просто различающиеся по концентра-
ции). Сопротивления этих участков могут оказаться разными:
следовательно, различными могут быть и падения напряжения
на них, но эти параметры зависят от длины участков. Однако
заведомо будут различаться в рассматриваемом случае значе-
ния напряженности поля на двух участках. Действительно, па-
дение напряжения на участке пропорционально его сопротив-
лению, а следовательно, длине участка. Напряженность же поля
есть результат деления падения напряжения на длину, поэтому
соотношение напряженностей поля на двух участках геля не за-
висит от их длины и определяется только концентрациями и под-
вижностями содержащихся в них ионов. Это - очень важный
вывод. В реальных буферных системах геля такую ситуацию
можно себе представить в двух простейших вариантах.
Вариант 1. Предположим, что буферы и, соответственно,
ионы на двух участках геля (A и В) одинаковы, но концентра-
ция буфера на участке A в 10 раз меньше. Это приведет к тому,
что напряженность поля в А будет вдесятеро больше, чем в В.
Скорость миграции ионов пропорциональна напряженности поля,
и ионы на участке А будут мигрировать в 10 раз быстрее, чем
такие же ионы на участке В; это компенсирует разницу в их

39

концентрациях. Число ионов, проходящее за 1 с через любое се-
чение обоих участков, а также через границу между ними, будет
одинаковым, что и означает неизменность тока I по всей длине
составного (ступенчатого) геля. При этом предполагается, что
количество ионов в A не истощается - оно пополняется за счет
ионов, поступающих из электродного буфера.
Вариант 2. Теперь допустим, что концентрации ионов на обо-
их участках одинаковы, но ионы на участке A отличаются на-
много меньшей электрофоретической подвижностью. Речь идет
о подвижности в свободной жидкости (u0), так как сетка геля
не препятствует миграции малых ионов. Например, пусть в геле
A содержатся отрицательные ионы глицина (при щелочном рH),
а в геле В - ионы хлора. Меньшая подвижность ионов обуслов-
ливает большую величину сопротивления. Суммарное напряже-
ние распределится между участками A и B так, что напряжен-
ность поля в A будет соответственно выше, причем именно на-
столько, чтобы скорость миграции ионов глицина, пропорцио-
нальная произведению подвижности на напряженность поля,
стала точно такой же, как и у ионов хлора. Этого опять требует
условие неизменности величины тока вдоль всего геля.
В более сложных случаях могут различаться как подвижно-
сти ионов, так и их концентрации, но в любом случае напряжен-
ности электрического поля в двух последовательно расположен-
ных участках геля устанавливаются такими, что они компенси-
руют все различия и обеспечивают постоянство тока во всем
геле. Значения напряженности могут при этом оказаться очень
разными. Очень важно, что это различие существенным образом
влияет и на соотношение скоростей миграции одних и тех же
белков (или нуклеиновых кислот) в двух участках геля. На "ом
участке, где напряженность поля выше, белки будут двигаться
быстрее, чем на соседнем. Эта любопытная ситуация будет рас-
смотрена ниже при обсуждении проблемы сужения белкоых
зон для противодействия диффузии. В заключение заметим, что
сам процесс электрофореза в рабочем геле следует вести в од-
нородном по напряженности электрическом поле, чтобы разде-
ление белков отражало истинное различие их собственных ха-
рактеристик - молекулярных масс и электрического заряда.
Выбор буфера рабочего геля
Вернемся к зависимости тока и напряженности поля в геле от
природы и концентрации рабочего буфера. Заметим сразу, что
сама по себе величина рН практически не сказывается на элект-
ропроводности геля. Даже при рН 4 концентрации протонов
(0,1 мМ) не даст заметного вклада в электропроводность по
сравнению с ионами буфера, концентрация которых, как будет
видно дальше, как минимум в 100 раз выше. То же относится и
к ионам ОН- в реально используемом диапазоне рН щелочных
буферов.

40

В то же время косвенным образом выбор рН может сильно
влиять на электропроводность данного буфера, определяя сте-
пень диссоциации его ионов. Рассмотрим широко используемый
Трис-НСl-буфер. В нем всегда находятся ионы Трис+, С1- и не-
заряженные молекулы Триса. Для этого буфера рKa = 8,1. Это
означает, что при рН 8,1 ровно половина молекул Триса несет
положительный заряд, практически целиком за счет протонов
соляной кислоты, которой титровали буфер. Очевидно, что в рас-
творе находится такое же количество ионов С1-. Таким образом,
при рН 8,1 0,1 М Трис-НСl содержит 0,05 М Трис+ и 0,05 М С1-.
Электропроводность этого буфера будет определяться, в основ-
ном, ионами С1-, так как их подвижность намного выше, чем у
тяжелых ионов Трис+. 0,05 М С1- обеспечивает достаточно вы-
сокую электропроводность. Трис-ацетатный буфер такой же
концентрации и рН имеет значительно меньшую электропровод-
ность, так как подвижность аниона СН3СОО- явно ниже, чем
С1-.
При рН 6,7 электропроводность 0,1 М Трис-НСl увеличится
примерно вдвое, так как этот рН лежит вблизи границы буфер-
ной емкости Триса и почти все его молекулы будут ионизирова-
ны; следовательно, концентрация С1- составит около 0,1 М. На-
оборот, при рН 8,9 электропроводность этого буфера значитель-
но ниже, чем при рН 8,1, так как для титрования до рН 8,9 по-
требуется заметно меньше НС1.
Существенную роль в определении электропроводности иг-
рает выбор природы буфера, т. е. характера его ионов. Легко
понять, что К- или Nа-фосфатные буферы, как и Трис-НСl, от-
личаются высокой электропроводностью за счет ионов К+ и
Nа+. То же относится к К- или Nа-ацетатным буферам. Между
тем электрофорез в чистой уксусной кислоте умеренной концент-
рации не связан с высокой электропроводностью. Имидазол-фос-
фатный буфер той же молярности, что и К-фосфатный, отлича-
ется меньшей электропроводностью. Относительно низкую
электропроводность имеют Трис-боратный, Трис-глициновый и
Трис-барбитуратный буферы. Вообще, можно утверждать, что
электропроводности буферных систем, в которых не участвуют
легкоподвижные ионы сильных неорганических кислот и щело-
чей, относительно невелики. Это важное заключение будет иг-
рать существенную роль в дальнейшем изложении. К сожале-
нию, такие буферы нередко отличаются и меньшей емкостью.
Таким образом, электропроводность рабочего буфера опре-
деляется тремя факторами: концентрацией, необходимой для
поддержания нужного рН в белковых зонах, степенью диссоциа-
ции буферных веществ при этом рН и характером участвующих
в диссоциации ионов.
Очевидно, что буфер геля не должен содержать посторонних
солей даже в малых концентрациях. Соль, зачастую присутству-
ющую в исходном препарате, несмотря на его малый объем, сле-
дует предварительно удалить или хотя бы снизить ее концентра-

41

цию до 0,05 М. На избыток соли в препарате указывает, между
прочим, размытый характер передней границы и резкая задняя
граница полосы препарата сразу после его вступления в гель.
При нормальном разделении должна иметь место как раз об-
ратная картина - резкая передняя и более диффузная задняя
граница полосы. Это можно проконтролировать путем окраши-
вания пробного геля через 20 - 30 мин после начала электрофо-
реза или при использовании люминесцентных маркеров (см.
ниже).
Помимо суммарной электропроводности, определенную роль
играет электрофоретическая подвижность ионов буфера, мигри-
рующих в том же направлении, что и разделяемые макромоле-
кулы. Качество полос выигрывает, если эти ионы по своей под-
вижности приближаются к самим макромолекулам. Таковы
большие органические ионы: Трис+ (катион), остатки барбиту-
ровой и какодиловой кислот (анионы) и такие цвиттерионы, как
глицин и аланин. Следовательно, при прочих равных условиях
Трисовый буфер следует предпочесть при фракционировании ще-
лочных белков, а барбитуратный - для кислых белков вблизи
нейтральной области рН буфера.
Выделение тепла при электрофорезе
Высокая электропроводность буфера нежелательна, посколь-
ку ограничивает возможность повышения напряженности элект-
рического поля в геле из-за увеличения тока и связанного с этим
выделения тепла. Между тем, именно напряженность поля обес-
печивает всегда желательное ускорение миграции белков.
Электрическая мощность, рассеиваемая в виде тепла в геле,
равна произведению силы тока на падение напряжения по длине
геля (IЕ). В главе 1 было отмечено, что разумной продолжи-
тельности электрофореза соответствует напряженность поля
10 - 20 В/см. Кстати, как показывает практика, при заметном
превышении этих значений качество полос в обычных условиях
охлаждения ухудшается. Для геля длиной 20 см такой напря-
женности соответствует напряжение 200 - 400 В. При воздуш-
ном охлаждении вертикально расположенных пластин эффектив-
ный теплоотвод возможен при рассеиваемой мощности не более
20 Вт, что соответствует силе тока 50 - 100 мА на пластину.
В приборе GЕ-2/4 фирмы "Рhаrmасiа" (рис. 15) с принудитель-
ным жидкостным охлаждением пластин уровень мощности мо-
жет быть увеличен до 100 Вт с соответствующим повышением
напряженности поля и ускорением фракционирования белков.
Приборы для электрофореза в горизонтальных пластинах успеш-
но осуществляют теплоотвод при мощности до 40 Вт.
В процессе электрофореза электрическое сопротивление геля
может изменяться (чаще всего увеличивается). Причиной этого
является замена более подвижных ионов буфера в геле на ме-
нее подвижные, например при ступенчатом электрофорезе.

42


Рис. 15. Прибор для электрофореза в вертикальных пластинах с циркуляцией
буфера (Тип GЕ-2/4 фирмы "Рharmacia")
Как уже отмечалось, для сокращения продолжительности
разделения и уменьшения диффузии зон электрофорез желатель-
но вести при максимальном напряжении. Его начальное значе-
ние ограничивается требуемой вначале силой тока и максималь-
но допустимой для данного прибора мощностью. По мере роста
сопротивления в геле сила тока снижается, и напряжение мож-
но увеличивать. Современные источники напряжения делают
это автоматически, поддерживая заданный постоянный уровень
мощности, рассеиваемой в геле. От опасного (с точки зрения
надежности изоляции) повышения напряжения при этом можно
застраховаться, ограничив максимально допустимую его вели-
чину. Достигнув ее, прибор переключается на режим поддержа-
ния постоянного напряжения, поэтому при дальнейшем возра-
стании сопротивления сила тока и расходуемая в геле мощность
начинают снижаться.
В некоторых случаях сопротивление всей цепи электрофоре-
за может и уменьшаться. В частности, это может происходить
как из-за нагревания геля (напомним, что подвижность ионов
с температурой возрастает), так и за счет накопления ионов в
электродных резервуарах. В этих случаях источник тока, отрегу-
лированный на постоянную мощность, автоматически снижает
напряжение, а максимально допустимая сила тока может быть
заранее ограничена. Такого типа источники ("Соnstant роwеr
suрр1у") выпускаются фирмами "Рharmaciа" (модель
ЕСРS 3000/150) и LКВ (модель 2103). В других типах источни-

43

ков (ЕРS 500/400 фирмы "Рharmaciа" и модель 500 фирмы
"Вio-Rad") можно заранее установить постоянные значения на-
пряжения или тока и задать величину максимально допустимой
мощности, по достижении которой соответственно напряжение
или ток начинают автоматически уменьшаться.
Загрузка геля. Ширина белковых зон
Очевидно, что разделение близко идущих зон белков будет
тем успешнее, чем уже сами эти зоны, поэтому при электрофо-
резе следует заботиться о максимальном сужении белковых зон
(полос). Это накладывает ограничения на допустимую загрузку
геля. Разумеется, строгость таких ограничений зависит от со-
става белковой смеси и характера разделения полос. В качестве
ориентировочного максимума можно принять загрузку порядка
1 мг суммарного препарата белка на 1 см2 сечения геля. Для
кармана шириной 5 мм в пластине толщиной 1,5 мм это соответ-
ствует примерно 75 мкг белка, а для трубки диаметром 6 мм -
до 200 мкг. Идентификацию полос белка по их окраске можно
проводить при загрузках, в 10 раз меньших. При перегрузке бел-
ковые полосы бывают резкими в передней своей части и размы-
тыми сзади. При этом следует всегда считаться с возможностью
преципитации белка в момент вступления его в гель, когда все
макромолекулы стягиваются в узкую полоску и локальная кон-
центрация их сильно увеличивается.
Чем меньше загрузка геля, тем лучше разделение близких
зон. Ограничения в этом случае накладываются только метода-
ми обнаружения слабых полос. Поскольку диффузия зон идет
во времени, всегда желательно сокращение продолжительности
электрофореза, но не за счет чрезмерно высокой силы тока, вы-
зывающей неравномерный нагрев геля и искажение полос.
Электрофорез при пониженной температуре в этом плане дает
немного. Интенсивность диффузии уменьшается, но вместе с тем
снижается и электрофоретическая подвижность белков, а следо-
вательно, увеличивается продолжительность электрофореза.
В простом варианте электрофореза желательно наносить бел-
ковую смесь на гель в минимальном объеме, чтобы высота ис-
ходного слоя препарата была не более 2 - 3 мм. Выполнить это
условие нередко бывает затруднительно ввиду недостаточной
концентрации исходного препарата. На основании приведенных
выше цифр легко рассчитать, что концентрация белка в препа-
рате должна составлять 3 - 5 мг/мл. Ряд мер позволяет обойти
эту трудность; они направлены на концентрирование белкового
препарата в узкую зону в момент вступления его в рабочий гель.
Основной прием заключается в том, чтобы создать перед гелем
область с повышенной напряженностью поля, где белки мигри-
руют намного быстрее, чем в рабочем геле. В момент перехода
из этой области в рабочий гель они будут стягиваться в узкую
полосу, так как находившиеся первоначально далеко позади

44


Рис. 16. Концентрирующий эффект электрофореза в градиентном геле (4 -
30% ПААГ)
а - начало фракционирования белков сыворотки; б - тот же гель после 60 ч диффузии
при комнатной температуре и выключенном напряжении; в - через 6 ч после возобновле-
ния электрофореза
молекулы белка "догонят" впереди идущие молекулы, замедлив-
шие свое движение при вступлении в рабочий гель.
Область с повышенной напряженностью поля можно создать
в крупнопористом геле, полимеризованном в буфере с малопод-
вижными ионами (см. выше, вариант 2). Такой подход исполь-
зован в системе ступенчатого электрофореза, рассмотренного
ниже. Этого же можно добиться и путем растворения исходного
препарата белка в том же рабочем буфере, но в 5 - 10 раз ме-
нее концентрированном (вариант 1). Нанесение препарата на
гель в разбавленном рабочем буфере нашло широкое примене-
ние в силу простоты и достаточно хорошей эффективности этого
приема.
Другой очень эффективный способ сужения полос - исполь-
зование градиента пористого геля. В этом случае при миграции
вдоль геля передний край каждой полосы все время оказывает-
ся в области чуть более концентрированного геля, чем задний.
Молекулы белка, расположенные ближе к переднему краю по-
лосы, тормозятся трением о гель сильнее, чем идущие сзади, что
и приводит к непрерывному сужению полос в ходе их продви-
жения по гелю. Силу этого эффекта убедительно продемонстри-
ровали специалисты фирмы "Рharmaciа" на выпускаемых этой
фирмой стандартных пластинах с градиентом концентрации
ПААГ (4 - 30%). Начав электрофоретическое фракционирова-
ние белков сыворотки, они затем прерывали его и оставляли
пластину на 60 ч при комнатной температуре. За это время диф-
фузия полностью размывала сформировавшиеся было белковые
полосы. Однако через 6 ч после возобновления электрофореза
удавалось получить четкую картину полос, содержащую все
обычно наблюдаемые компоненты сыворотки (рис. 16).

45

Введение мочевины и ?-меркаптоэтанола.
Некоторые артефакты
Высокая концентрация белков в зонах может привести к их
осаждению или, по крайней мере, образованию агрегатов: ди-
мерных, тримерных и более крупных белковых комплексов, ко-
торые могут давать дополнительные полосы. Агрегация проис-
ходит, в основном, за счет водородных связей. Для ее предотвра-
щения в рабочий буфер нередко добавляют мочевину в концент-
рации 4 - 8 М. Она должна быть хорошо очищена, в частности
деионизована. Кроме того, следует всегда иметь в виду возмож-
ность частичного разложения мочевины с образованием циано-
вой кислоты и карбамоилирования белков. Это особенно отно-
сится к долго хранящимся буферам, поэтому лучше добавлять
сухую мочевину в буфер непосредственно перед приготовлением
геля. Если все же возникает подозрение, что некая полоса появи-
лась за счет карбамоилирования, то следует добавить в исход-
ный препарат цианат и посмотреть, не усилится ли подозритель-
ная полоса. Для предварительной деионизации маточный рас-
твор мочевины (10 М) суспендируют с бифункциональной ионо-
обменной смолой (например, AG 501 ? 8) в соотношении 5 г
смолы на 100 мл раствора в течение часа при комнатной темпе-
ратуре.
?-Меркаптоэтанол в концентрации 1 - 5% нередко вносят в
исходный белковый препарат для предохранения его от окисле-
ния и образования лишних дисульфидных мостиков. Более энер-
гичное воздействие с разрывом нативных дисульфидных связей
и разделением белковых субъединиц производят путем нагрева-
ния белкового раствора до 90 - 100° в присутствии не только ?-
меркаптоэтанола или его аналогов, но н ДДС-Na.
В некоторых случаях при использовании боратного буфера
или буферов, содержащих аминокислоты (глицин, аланин), воз-
можно образование комплексов компонентов буфера с белками.
Их электрофоретическая подвижность может оказаться несколь-
ко иной, чем у чистых белков, и соответствующие белковые по-
лосы раздвоятся. Проверить такого рода артефакт можно по-
вторным электрофорезом. В силу равновесного характера про-
цесса образования комплексов каждая из двух полос дублета
при ее повторном электрофорезе в том же буфере даст снова две
полосы.
В главе 1 уже упоминалось об опасности, которую представ-
ляют для белков сохраняющиеся в геле после полимеризации
долгоживущие свободные радикалы. Указывалось также на спо-
соб их удаления - "преэлектрофорез", т. е. пропускание тока
через гель без внесения препарата. Добавим, что в особых слу-
чаях для полной очистки от радикалов во время преэлектрофо-
реза через гель пропускают такие связывающие их соединения,
как цистеин, меркаптоуксусная (тиогликолевая) кислота или
гидрохинон.

46

При фракционировании очень малых количеств белка может
оказаться заметной сорбция их на геле (белки "размазывают-
ся" по гелю). Блокировать это явление можно, вводя в исход-
ный препарат дополнительный быстро мигрирующий белок. Про-
ходя через гель впереди всех остальных белков препарата, он
насыщает собой центры неспецифической сорбции в геле.
Лидирующие красители
Для наблюдения за ходом электрофореза в исходный препа-
рат вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что
и фракционируемые белки. Он не должен заметным образом свя-
зываться с белками, а скорость его продвижения по гелю долж-
на быть заведомо больше, чем у наиболее быстро мигрирующего
белка. Вместе с тем краситель не должен слишком сильно от-
рываться от белков, чтобы его прохождению до конца пласти-
ны или трубки соответствовало использование большей части
находящегося в них геля для фракционирования белков. Быть
может, по ассоциации с велосипедными гонками за лидером, этот
краситель называют лидирующим ("tracker dye").
В щелочных и нейтральных буферах, когда кислые белки за-
ряжены отрицательно и мигрируют к аноду, а также для любых
белков в комплексе с ДДС-Na (см. ниже) используют отрица-
тельно заряженные красители. Наибольшее распространение по-
лучил бромфеноловый синий, имеющий достаточно сложную
структуру; в его состав, в частности, входят два дибромфеноль-
ных остатка. Иногда используют еще более сложно построен-
ный краситель - ксиленцианол, электрофоретическая подвиж-
ность которого примерно вдвое ниже, чем бромфенолового сине-
го, поэтому его используют при фракционировании крупных бел-
ков и нуклеиновых кислот.

Для характеристики электрофоретической подвижности бел-
ка в данных условиях электрофореза принято указывать отно-
шение расстояния, пройденного белковой полосой от начала ра-
бочего геля, к аналогичному расстоянию до полосы красителя
в этом же геле. Это отношение, как и в хроматографии, обозна-
чают Rf.

47

В качестве положительно заряженного красителя для элект-
рофореза в кислой среде, когда белки мигрируют в направлении
катода, используют метиловый зеленый или пиронин.

РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПО РАЗМЕРАМ И ЗАРЯДУ
В этом случае в электродных резервуарах и для полимериза-
ции ПААГ используют один и тот же буфер, поэтому такую си-
стему иногда называют непрерывной, или простой. Строго гово-
ря, непрерывность нарушается тем, что буфер, в котором вносят
белковый препарат, с целью концентрирования исходной зоны
разбавляют в 5 - 10 раз водой.
Подбор оптимальных условий электрофореза сводится к вы-
бору следующих параметров: пористости геля и степени его
сшивки, т. е. значений Т и С (см. главу 1); природы, концентра-
ции и рН буфера; диссоциирующих добавок (если это необхо-
димо); максимально допустимой мощности, напряжения и силы
тока, а также продолжительности разделения; объема и кон-
центрации исходного препарата; процедуры предварительной об-
работки препарата.
Выбор значений T и С в зависимости от молекулярных масс
разделяемых белков был подробно обоснован в главе 1. Чаще
всего с белками работают при T = 3,5 - 20 и C = 1 - 3.
Выбор рабочего буфера
Для обеспечения хорошей электрофоретической подвижности
и сохранения вместе с тем ощутимых различий в суммарных
электрических зарядах белков выбирают рН буфера, отличаю-
щийся на 3 - 4 единицы от среднего значения рI для белков дан-
ного типа. Если эти значения неизвестны, то желательно соста-
вить себе представление о характере зарядов белков при раз-
личных рН по характеру их сорбции на ионообменных смолах.
Для кислых белков часто используют буфер с рН 8,9, для
щелочных - с рН 4,3 - 4,5. В качестве слабощелочных буферов

48

для кислых белков применяют Трис-HCl, Трис-глициновый,
Трис-боратный или Трис-барбитуратный. Для щелочных белков
чаще всего используют К-ацетатный и Трис-ацетатный буферы,
а иногда, если белок это выдерживает, то и просто уксусную
кислоту в концентрации 0,9 М или 5% (0,9 М СН3СООН имеет
рН 2,4; 0,1 М - рН 2,87). О преимуществах буферов, не содер-
жащих легко подвижных ионов (С1-, К+), было сказано выше.
Концентрацию буфера выбирают, исходя из допустимой мощ-
ности тепловыделения, и вместе с тем так, чтобы напряженность
электрического поля в геле не превышала 15 В/см. При более
высоких значениях напряженности возможны искажения формы
белковых полос. Для 0,1 М Трис-глицинового буфера, напри-
мер, такой напряженности отвечает плотность тока 20 мА/см2.
Это означает, что через трубку диаметром 6 мм и длиной 8 см
в этом случае можно пропускать ток до 5,5 мА при напряжении
120 В. Поскольку трубки довольно трудно охлаждать, обычно
используют меньшие величины тока - около 3 мА на трубку.
Для вертикальной пластины размером 10 ? 14 см и толщиной
1,5 мм в этих же условиях сила тока составит около 30 мА при
напряжении около 210 В. Разумеется, эти цифры приведены
лишь для ориентировки, и для других условий электрофореза
они окажутся иными. Впрочем, вариации для хорошо выбран-
ных систем оказываются не очень значительными, так как для
любой буферной системы сохраняется одна и та же тенденция -
использовать максимально возможную напряженность поля при
максимально допустимой с точки зрения теплоотвода мощности
тока.
В двух приведенных простейших примерах напряженность
поля в геле можно рассчитывать просто путем деления напря-
жения, указываемого источником тока, на длину геля. При этом
пренебрегают падением напряжения в электродных резервуа-
рах - на участке цепи между электродами и гелем. В том слу-
чае, когда электродные буферы находятся в непосредственном
контакте с гелем, это вполне допустимо.
Иначе обстоит дело в приборах с горизонтально расположен-
ными пластинами. Например, для электрофореза в приборе типа
"Мультифор" при ширине пластины 20 см и толщине геля 1 мм
плотности тока 20 мА/см2 соответствует его сила 40 мА. Паде-
ние напряжения в самом геле длиной 10 см при напряженности
поля 15 В/см составит, очевидно, 150 В. Однако напряжение, ко-
торое надо установить на источнике тока, должно быть сущест-
венно выше ввиду значительного падения напряжения на фити-
лях, соединяющих буферные резервуары с гелем. Это падение
напряжения трудно оценить, поэтому для выяснения значения
напряженности поля в самом геле прибор "Мультифор" снабжен
специальным вольтметром, измеряющим падение напряжения
между двумя точками поверхности геля, находящимися на опре-
деленном расстоянии друг от друга. В рассмотренном примере
использовали Трис-глициновый буфер с довольно высоким элект-

49

рическим сопротивлением. Мощность, расходуемая в приборе
"Мультифор", в этом случае составит всего лишь 6 Вт (150 В ?
? 0,04 А). Иная картина получится, если тот же гель заполиме-
ризовать в 0,1 М Na-фосфатном буфере с рН 7,1. Электропровод-
ность этого буфера довольно высока за счет легко подвижных ио-
нов Na+. Измерения в том же приборе показывают, что уже при
напряженности поля 5 В/см (падение напряжения - 50 В на
пластину) плотность тока в геле возрастает до 100 мА/см2. Если
довести напряженность поля в геле до 15 В/см, то сила
тока через пластину сечением 2 см2 (20 ? 0,1 см) составит
600 мА. При падении напряжения на геле, равном 150 В, это
привело бы к совершенно неприемлемому уровню тепловыделе-
ния (мощность 90 Вт). Однако дойти до этого режима практи-
чески невозможно ввиду большого падения напряжения на фи-
тилях, их разогрева, обсыхания и дальнейшего увеличения со-
противления. В итоге, при работе с фосфатным буфером прихо-
дится ограничивать силу тока (˜200 мА) и работать при пони-
женных значениях напряженности электрического поля. Соот-
ветственно увеличивается и продолжительность электрофореза.
Еще раз подчеркнем, что электропроводность любого буфера
определяется не только концентрацией, но степенью и характе-
ром его ионизации (близостью рН к рKa буфера и подвижностью
образующих ионов). Концентрации рабочих буферов в пределах
0,05 - 0,1 М можно считать ориентировочно нормальными, хотя
для слабо ионизированных буферов, используемых вблизи гра-
ницы их буферной области, можно встретить в литературе и бо-
лее высокие значения концентрации - вплоть до 0,4 М.
В непрерывной системе сопротивление геля не должно замет-
ным образом изменяться в процессе электрофореза. Как след-
ствие этого, не должна изменяться и расходуемая мощность. По-
вышение напряжения источника, работающего в режиме посто-
янного тока, или уменьшение силы тока при постоянном напря-
жении говорят о каких-то неполадках в электрической цепи, на-
пример: о высыхании фитилей или нарушении контактов между
ними и гелем.
Использование мочевины
Уже указывалось, что для предотвращения агрегации белков
в рабочий буфер геля нередко вводят мочевину в концентрации
от 2 до 8 М. Ее, разумеется, добавляют и в исходный белковый
препарат. В электродные буферы вносить мочевину не нужно,
так как, не будучи заряженной, она не мигрирует в геле, а сле-
довательно, и не нуждается в пополнении. На электропроводно-
сти буфера присутствие мочевины практически не сказывается.
Однако под влиянием нового окружения могут изменяться рК
отдельных групп и суммарный заряд белка. Это может заметно
повлиять на конфигурацию, а следовательно, и на подвижность
белков.

50

В концентрированных растворах мочевины происходит дена-
турация белков, часть дисульфидных мостиков рвется и полипеп-
тидная цепочка, утратив вторичную структуру, ведет себя как
хаотический клубок. Денатурация не является полной и может
быть обращена. Степень и обратимость денатурации зависят от
природы белка и концентрации мочевины, поэтому при выборе
этой концентрации иногда приходится искать компромисс меж-
ду опасностью агрегации белков и угрозой их необратимой де-
натурации. Об очистке мочевины было сказано выше; добавим
только, что образование цианата в растворах мочевины идет ус-
коренно при щелочных рН, поэтому щелочные буферы с добав-
кой мочевины следует использовать сразу после их приготовле-
ния.
Для составления геля пользуются обычно "маточными" рас-
творами повышенной концентрации. Удобно, например, приго-
товить 40%-ный водный раствор смеси мономеров (T = 40). Ha-
помним, что Т выражает процентное отношение массы обоих мо-
номеров к конечному объему их раствора, а С - отношение мас-
сы NN/-мeтилeнбиcaкpилaмидa к сумме масс двух мономеров.
Отсюда следует, что С не изменяется при разбавлении маточ-
ного раствора. Так, если предполагается иметь для рабочего
геля параметры Т = 10 и С = 2,6, то при составлении маточного
раствора можно взять T = 40 и С = 2,6. Практически это означа-
ет, что надо отвесить (40 ? 2,6)/100 = 1,04 г метиленбисакрилами-
да и 40 - 1,04 = 38,96 г акриламида и растворить их в воде до ко-
нечного объема 100 мл. Маточный раствор буфера может иметь
двух- или пятикратную концентрацию. В последнем случае по-
лезно проверить, что рН буфера сохраняется при соответствую-
щем разбавлении. Смесь расчетных объемов маточных раство-
ров мономеров и буфера доводят до нужного объема водой.
Персульфат аммония лучше добавлять в минимальном объ-
еме, который можно не учитывать. Для этого готовят концент-
рированный, обычно 10%-ный, маточный раствор персульфата,
остатки которого вскоре приходится выбрасывать, так как он
не хранится. Объемом вносимого в смесь ТЕМЕД также всегда
можно пренебрегать. Выбор содержания персульфата аммония
и ТЕМЕД, порядок их внесения в раствор мономеров, необхо-
димость деаэрации и контроль за процессом полимеризации геля
были подробно рассмотрены в главе 1,
Для приготовления геля с высоким содержанием мочевины ее
добавляют во все маточные растворы. При растворении моно-
меров до Т = 40 концентрацию мочевины приходится ограничи-
вать значением 2 - 3 М. Зато маточный раствор буфера можно
приготовить на 10 М мочевине и такой же концентрации раствор
ее использовать для доведения до расчетного объема вместо
воды.
Особо гидрофобные белки, например тяжелые цепи миозина,
при концентрировании их в полосах агрегируют даже в присут-
ствии 8 М мочевины. Во избежание этого их можно обработать

51

фенолом, который играет роль мягкого детергента. Белок сна-
чала растворяют в буфере до безопасной концентрации, а потом
переводят в смесь, состоящую из 50% фенола, 25% уксусной
кислоты, мочевины до концентрации 2 М и воды. Электрофорез
проводят в ПААГ, полимеризованном в 35%-ной уксусной кис-
лоте с 5 М мочевины [d'Abbis et al., 1979].
В некоторых случаях бывает необходимо при электрофорезе
сохранить ферментативную активность белка - либо для по-
следующей его элюции и использования, либо для обнаружения
с помощью биологического теста, т. е. по превращению субстра-
та ферментативной реакции (см. ниже). Использование в этом
случае концентрированного раствора мочевины является неже-
лательным, и уменьшать опасность агрегации приходится за счет
снижения загрузки геля. Чувствительность биологических тестов
зачастую позволяет это сделать. Необходимо точно проверить
устойчивость фермента при выбранной величине рН рабочего
буфера. При этом следует иметь в виду, что истинная величина
рН в геле примерно на 0,5 ед. больше, чем у используемого ще-
лочного буфера, и на 0,5 меньше, чем у кислого [Shuster, 1971].
Иногда следует проверить сохранность ферментативной ак-
тивности белка в ходе электрофореза в связи с возможностью
разобщения фермента с другими белками или необходимыми
для его работы кофакторами. Такую проверку можно проводить
следующим образом: на разных стадиях электрофореза выре-
зать и гомогенизировать участки геля, содержащие соответству-
ющую белковую полосу, и прямо в гомогенате, в сопоставимых
условиях, проверять сохранение активности фермента, исполь-
зуя возможность диффузии субстрата реакции в гель, а ее про-
дукта - из геля.
Загрузка геля и подготовка препарата
Исходный белковый препарат растворяют в том же рабочем
буфере, но меньшей концентрации (в 5 - 10 раз). По рассмот-
ренным выше причинам это приводит к значительному сужению
исходной зоны белков при ее вступлении в гель. Если электро-
форез идет в присутствии мочевины, то ее концентрация в раз-
бавленном буфере должна быть такой же, как в рабочем буфе-
ре геля. Еще раз подчеркнем необходимость удаления солей из
препарата; в противном случае эффект концентрирования белка
при вступлении в гель будет смазан. Недавно был предложен
простой и остроумный способ диализа белкового раствора в кап-
ле на плавающем мембранном фильтре [Marusyk, Sergeant,
1980].
Иногда проводят предварительное полное восстановление
белка путем прединкубации его в течение ночи при комнатной
температуре в буфере с рН 8,5 - 9, содержащем 0,1 М (?-меркап-
тоэтанола и 9 М мочевины (щелочное значение рН буфера спо-
собствует восстановительному эффекту ?-меркаптоэтанола).

52

В раствор препарата добавляют до 10% глицерина или саха-
розы, чтобы облегчить его подслаивание под электродный буфер
(см. выше). Наконец, в препарат вносят еще и краситель, на-
пример бромфеноловый синий до концентрации 0,01%. Мигра-
ция этой "лидирующей" зоны до конца геля определяет момент
окончания электрофореза. Заметим кстати, что при последую-
щей фиксации белков бромфеноловый синий обесцвечивается.
Если далее предполагается определение величины Rf, то поло-
жение окрашенной полоски сразу после извлечения геля из фор-
мы следует отметить (например, вколоть в гель тонкую прово-
лочку) .
Как уже подчеркивалось, препарат должен быть заведомо
свободен от пыли, нерастворенных белков и других частиц. Пос-
ле внесения препарата в трубку или карман пластины на 5 -
15 мин включают напряжение, пониженное примерно вдвое про-
тив расчетного. За это время лидирующий краситель должен
полностью войти в гель. Такая процедура улучшает условия
формирования исходной белковой полосы в геле. Затем перехо-
дят на расчетный режим электрофореза по напряжению и силе
тока.
Вопросы фиксации, окраски и других методов обработки бел-
ков после электрореза,как и способы определения радиоактив-
ности и элюции белков, рассмотрены отдельно ниже.
Некоторые примеры
Теперь для иллюстрации целесообразно привести некоторые
примеры, отнюдь не отражающие всего безграничного разнооб-
разия приложений электрофореза белков, даже в его простей-
шем, только что рассмотренном варианте.
Обзорный клинический анализ белков сыворотки человека. В приборе с
горизонтальным гелем (типа "Мультифор") одновременно можно обследовать
сыворотку крови 20 пациентов. Условия разделения: гель указанных выше
размеров, T = 3,5, С = 2,6; 0,1 М Трис-глициновый буфер, рН 8,9; напряжен-
ность поля 15 В/см, сила тока 45 мА; температура охлаждающей воды 10°;
преэлектрофорез в течение 30 мин при силе тока 60 мА. Препараты сыворотки
разбавляют в отношении 1 : 3 тем же буфером, разведенным в 10 раз. Объем
каждого препарата 5 мкл. В первые 10 мин электрофореза силу тока снижа-
ют до 20 мА. Скорость миграции бромфенолового синего 4,5 см/ч; общая про-
должительность электрофореза 1,3 ч. На рис. 17, A сопоставлены картины
фракционирования белков сыворотки 10 пациентов с различными заболева-
ниями (по два препарата от каждого). Крайние слева и справа пары треков
содержат сыворотку нормальных доноров. Направление миграции белков -
снизу вверх. Интенсивные пятна вверху - низкомолекулярные компоненты
сыворотки.
Заметно лучше, особенно в области крупных белков, те же препараты
разделяются в более концентрированном геле (T = 7,5; С = 2,6), однако в этом
случае часть наиболее крупных белков выпадает в осадок на границе геля

53



54

(рис. 17, Б). Скорость миграции бромфенолового синего 1,8 см/ч при рабочей
силе тока 40 мА; продолжительность разделения 2,8 ч [Fehrnstrom, Moberg,
1977].
Фракционирование гистонов и других щелочных белков.
5%-ный (0,9 М) раствор уксусной кислоты с добавлением 4 -
8 М мочевины часто используют для электрофоретического
фракционирования гистонов [Panyim, Chalkley, 1969]. Молеку-
лярные массы гистонов лежат в диапазоне 11 - 22 тыс. дальтон,
поэтому для их разделения используют мелкопористые гели
(T = 15 - 20). Положительно заряженные в кислой среде гисто-
ны мигрируют в направлении катода. Наибольшей подвижностью
обладает гистон Н4, затем следуют Н2А, Н2В и НЗ, которые в
этой простой системе разделяются довольно плохо. От них за-
метно отстает относительно более крупный гистон H1. В каче-
стве лидирующего красителя используют пиронин.
Недавно Спайкер описал систему фракционирования гисто-
нов в двуступенчатом ПААГ с "кислой мочевиной". Основной
рабочий гель - пластина (толщиной 0,5 мм) 15%-го ПААГ в
0,9 М СН3СООН с 2,5 М мочевины. Над ним полимеризована
полоска формирующего геля: 7,5% ПААГ в 0,375 М СН3СООК,
рН 4, с 2,5 М мочевины. Электрофорез при повышенном напря-
жении - за 1 - 2 ч. Качество полос и их разрешение в такой си-
стеме сильно выигрывают [Spiker, 1980].
Электрофорез "в кислой мочевине" успешно используют и
для фракционирования других щелочных белков: рибосомных,
факторов инициации трансляции, субъединиц РНК-полимеразы
и др. Впрочем, намного более совершенное разделение сложных
смесей этих белков происходит при двумерном электрофорезе,
когда фракционирование "в кислой мочевине" используют в од-
ном из направлений. Ниже, при анализе метода двумерного
электрофореза, будут даны соответствующие ссылки.
Если есть опасение, что воздействие уксусной кислоты на бе-
лок может оказаться слишком жестким, то ее 50%-ный раствор
титруют КОН до рН 4,3 - 4,5. При этом надо иметь в виду, что
электропроводность такого буфера будет за счет ионов калия
значительно выше, чем одной уксусной кислоты, что потребует
соответствующего уменьшения напряжения, подаваемого на
гель.
Описано электрофоретическое разделение гистонов и при
рН 7,8 (0,18 М глицилглицин, титрованный NaOH), которое ис-
пользуется для изучения гистон-гистонового взаимодействия и
некоторых лабильных модификаций гистонов. Все гистоны, кро-
ме H1, при этом почти одинаково и относительно слабо заряже-
ны, поэтому фракционирование идет главным образом по моле-
кулярной массе. Добавление мочевины предупреждает агрега-
цию гистонов, однако несколько изменяет взаимное расположе-
ние полос. Мочевина разворачивает гистоны Н2А, Н2В и Н3,
но не влияет на конфигурацию H1 и Н4. По-видимому, эти по-

55

следние развернуты и в отсутствие мочевины [Hoffman, Chalk-
ley, 1976].
Щелочные белки рибосом удается разделять не только в кис-
лых, но и в слегка щелочных условиях, например в Трис-борат-
ном буфере, рН 8,7. Электрофорез проводят в 4%-ном ПААГ
[Howard, Traut, 1973]. Исходный белковый препарат полимери-
зуют в геле с мочевиной на середине высоты трубки. Вблизи изо-
электрической точки часть рибосомальных белков оказывается
заряженной отрицательно, а другая - положительно. Миграция
в электрическом поле идет в обе стороны, к катоду и аноду. Ще-
лочные белки рибосом при рН 8,7 растворяются с трудом и толь-
ко в присутствии 6 М мочевины, которую вводят также и в бу-
фер геля.
Электрофорез хроматина. Электрофоретическое фракциони-
рование хроматина после его обработки микрококковой нуклеа-
зой ведут в буфере низкой ионной силы, например в 0,01 М три-
этиламмоний-НСl (рН 7,6; 2 мМ ЭДТА), что обусловлено плохой
растворимостью хроматина в более концентрированных буферах.
Хроматин в целом (благодаря ДНК) заряжен отрицательно и
мигрирует к аноду. Удается разделить субнуклеосомы, моно-
нуклеосомы с различным содержанием ДНК и белков, лежащих
вне их "ядра" ("core"), а также ди- и тринуклеосомы. Ввиду
малой электропроводности разбавленного буфера при напря-
женности 15 В/см сила тока через трубку диаметром 6 мм со-
ставляет всего лишь 3 мА. Электрофорез в трубках длиной 7 см
занимает 1,5 ч.
РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПО РАЗМЕРУ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДДС-Na
Существо метода
Рассмотренный выше электрофорез белков в простой систе-
ме удобно использовать для их разделения, но не для характери-
стики. Электрофоретическая подвижность каждого белка в про-
стой системе зависит одновременно и от его суммарного заряда,
и от молекулярной массы, и от конфигурации, и, наконец, от
жесткости упаковки полипептидной цепи. Вклад каждого из этих
факторов неизвестен и может существенно изменяться в зави-
симости от условий электрофореза. Для установления строгой
количественной корреляции между каким-либо одним из пере-
численных параметров и электрофоретической подвижностью
белка надо исключить влияние всех остальных.
Электрофорез в ПААГ с использованием ДДС-Na позволяет
фракционировать белки в зависимости от значений только од-
ного параметра - их молекулярной массы. Для этого белки в
исходном растворе препарата обрабатывают не менее чем трех-
кратным избытком ДДС-Na. За счет гидрофобных взаимодей-
ствий детергент примерно одинаково связывается с подавляю-
щим большинством белков в соотношении 1,4 мг ДДС-Na на

56

1 мг белка [Reynolds, Tanford, 1970]. Огромный избыток пол-
ностью диссоциированных остатков сульфокислоты, привноси-
мых с детергентом, в большинстве случаев делает несуществен-
ной роль собственного заряда белка. Постоянство соотношения
детергент/белок делает практически одинаковым отношение от-
рицательного заряда к массе для любого белка, даже для гисто-
нов с их заметным собственным положительным зарядом. Бла-

годаря электрическому отталкиванию
тесно расположенных по поверхности
белка остатков серной кислоты поли-
пептидная цепочка распрямляется и
приобретает форму жесткого эллипсои-
да вращения. Его малая ось имеет дли-
ну 1,6 нм, а размер большой линейно
связан с числом аминокислотных остат-
ков, а следовательно, с молекулярной
массой белка. Это справедливо лишь
для неразветвленных полипептидов, ли-
шенных дисульфидных мостиков, поэ-
тому одновременно с обработкой ДДС-
Na необходимо обеспечить полную де-
натурацию белка и разрыв всех S-S-
связей. С этой целью белковый препа-
рат обрабатывают высокой концентра-
цией ?-меркаптоэтанола при повышен-
ной температуре.

Рис. 18. Линейная зависи-
мость логарифма молеку-
лярной массы (IgM) от от-
носительного расстояния
миграции белков (Rf) при
электрофорезе в ПААГ
Электрофоретическая подвижность
(и') жесткого комплекса белок - ДДС-Na оказывается связан-
ной с молекулярной массой белка (М) простым соотношением:
и'=А - В lg М, где А и В - коэффициенты, зависящие от порис-
тости геля, температуры и других условий эксперимента. Вели-
чину и' удобнее представлять в относительных единицах, выра-
жающих отношение путей миграции белка и бромфенолового
синего за время электрофореза, т. е. в значениях введенной ра-
нее величины Rf. Такая замена отразится только на значениях
коэффициентов А и В. Нет смысла определять эти коэффициенты
в каждом опыте. Одновременно с фракционированием исследуе-
мой смеси можно провести электрофорез набора белков-"марке-
ров", молекулярные массы которых точно известны. Разумеется,
вся предварительная обработка ДДС-Na и меркаптоэтанолом
должна быть строго одинаковой для исследуемого препарата и
маркеров. При электрофорезе в пластине для смеси маркеров
можно отвести отдельный трек. При использовании трубок мар-
керы лучше добавить прямо в препарат, так как нельзя гаран-
тировать строгой идентичности условий электрофореза в двух
разных трубках.
По окончании электрофореза, измерив пути миграции бром-
фенолового синего и каждого из маркеров, можно рассчитать
значения Rf и, зная молекулярные массы маркеров, построить

57

экспериментальную зависимость lg M от Rf для данного опыта.
Если пористость геля выбрана удачно (см. ниже), такая зави-
симость получается линейной (рис. 18). Определив теперь Rf
для интересующего нас белка, из графика можно найти для него
величину lg M и подсчитать M. Положение и наклон прямой
на графике изменяются при вариации концентрации ПААГ и
других условий эксперимента, поэтому нельзя пользоваться ка-
кой-либо стандартной калибровкой. График зависимости Ig M
от Rf надо строить для каждого опыта. Отметим также, что при
определении Rf надо вводить поправки на набухание или съежи-
вание геля при фиксации, окраске белков и удалении красителя,
приводя все к исходному линейному размеру.
Метод определения молекулярной массы белков электрофоре-
зом в ПААГ с ДДС-Na завоевал себе прочную репутацию и ис-
пользуется очень широко. Тем не менее следует проявлять из-
вестную осторожность. Исследуемый белок может оказаться
принадлежащим к той, по-видимому, сравнительно немногочис-
ленной, категории белков, для которой количественное соотно-
шение в комплексе с ДДС-Na существенно отличается от 1 : 1,4.
Есть данные о том, что на полноту комплексообразования с
ДДС-Na может влиять распределение зарядов по полипептид-
ной цепочке. Показано, например, что обработка рибонуклеазы
малеиновой кислотой снижает количество связывающегося с ней
ДДС-Na с 1,9 до 0,3 г на 1 г белка. Такая обработка не изме-
няет заметным образом молекулярной массы рибонуклеазы, но
вносит отрицательный заряд карбоксила на место положитель-
ного заряда аминогруппы. С другой стороны, на связывании
ДДС-Na с лизоцимом обработка малеиновой кислотой никак не
сказывается [Tung, Knight, 1972]. Ненормальное связывание
ДДС-Na может быть также обусловлено необычной обогащен-
ностью белка какой-либо гидрофильной аминокислотой. Глико-
протеиды хуже связываются с ДДС-Na, чем чистые белки.
Разной степенью связывания ДДС-Na, по-видимому, следует
объяснить и успешное разделение ?- и ?-цепей глобина кролика
электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ с ДДС-Na. Различие моле-
кулярных масс этих цепей (15 419 и 16 000) вряд ли само по
себе могло бы обеспечить это разделение (Wood, Shaeffer, 1975].
Недавно было показано, что единственная мутационная замена
аминокислоты (Арг?Цис) в белке с молекулярной массой 26 000
приводит к кажущемуся изменению этой величины на 1000. Су-
щественно отметить, что такое изменение связано с заменой
только одного из нескольких остатков аргинина, входящих в со-
став белка. Следовательно, в этом случае играет роль еще и
окружение аргинина [Noel et al., 1979].
Рассмотренные примеры не могут дискредитировать плодо-
творный метод определения молекулярной массы белков элект-
рофорезом с участием ДДС-Na. Они лишь указывают на необхо-
димость некоторой осторожности и критичности в оценке ре-
зультатов эксперимента, особенно с малоизученными белками.

58

Выбор пористости геля
При данной пористости (концентрации) геля описанная выше
линейная зависимость имеет место только для белков, молеку-
лярные массы которых лежат в определенном интервале. Слиш-
ком крупные для данного геля белки, очевидно, вовсе не смогут
мигрировать в нем. Подвижности слишком малых белков, для
которых поры геля практически не создают препятствий, будут
зависеть не от их молекулярной массы, а только от отношения
заряда к массе. Как указывалось, в присутствии ДДС-Na это
отношение одинаково для большинства белков. Для ориентиров-
ки можно назвать некоторые цифры. Так, для одинаково сши-
тых гелей (С = 3,3) были рекомендованы следующие значения Т
в зависимости от молекулярной массы белков (M) [Dunker,
Rueckert, 1969]:

Фирма BDH для своего стандартного набора белков-марке-
ров в интервале М 56 - 280 тыс. дальтон предлагает использо-
вать гели с T = 3,3, а в интервале 14 - 72 тыс. - с T = 10; в обоих
случаях С = 2,6. Отметим попутно, что эффект торможения миг-
рации биополимеров в слабосшитых гелях с С < 2,6 быстро ос-
лабляется с уменьшением С при неизменном значении Т. По-
видимому, в этом случае ярко проявляется способность жестко-
го комплекса белок - ДДС-Na раздвигать гибкие, слабосшитые
нити акриламида.
Для определения молекулярных масс пептидов та же фирма
выпускает набор стандартных фрагментов миоглобина с диапа-
зоном М 2,5 - 17 тыс. Для него и соответствующих пептидов ре-
комендуется использовать сильно сшитый гель (Т = 12,5; С =
= 9), содержащий 8 М мочевину, которая усиливает торможение
малых пептидов в геле.
О важности правильного выбора пористости геля можно су-
дить из сопоставления двух картин разделения набора из семи
маркерных белков (рис. 19) [Fehrnstrom, Moberg, 1977]:

Разделение вели в приборе "Мультифор", использовав 5%- и
10%-ный ПААГ. Легко видеть, что в 5%-ном геле миоглобин
движется почти с такой же скоростью, как и цитохром с. При
перенесении результатов этих опытов на графики (рис. 20) по-
лучается, как и следовало ожидать, что точка, отвечающая по-

59


ложению цитохрома с в 5%-ном геле, выпадает из прямой ли-
нии, проходящей через все остальные точки, тогда как для 10%-
ного геля она оказывается на такой прямой.
Присутствие мочевины и неионных детергентов
Хотя для коротких олигопептидов присутствие мочевины ока-
зывается полезным, при электрофорезе белков ее не следует
вводить в гель. Мочевина вносит конформационные изменения в
структуру белка. Влияние этих изменений как на степень связы-
вания ДДС-Na, так и на характер миграции комплекса белок -
ДДС-Na в геле еще не изучено.

60
Из аналогичных соображений следует удалять из белкового
препарата перед его обработкой ДДС-Na другие детергенты, в
частности неионные. Иногда это удается добиться за счет вне-
сения в препарат еще большего избытка ДДС-Na, с тем чтобы
он вытеснял неионный детергент из связи с белком, образуя с
ним свободно растворенные смешанные мицеллы. Такие мицел-
лы могут "уходить" от комплекса белок - ДДС-Na, быстро миг-
рируя в электрическом поле [Nielsen, Reynolds, 1978]. Широко
используемый для растворения мембранных белков Тритон
Х-100 сильно мешает проведению электрофореза в ПААГ с
ДДС-Na. Его можно извлечь из белкового препарата экстрак-
цией хлороформом. Чтобы предотвратить выпадение плохо рас-
творимых белков в осадок, перед экстракцией к препарату сле-
дует добавить ДДС-Na до 1%, который в хлороформ не перехо-
дит [Horikawa, Ogawara, 1979].
Выбор рабочего буфера геля
Из изложенного ясно, что рН буфера в этом варианте элект-
рофореза не играет существенной роли, так как заряд белка оп-
ределяется его комплексированием с ДДС-Na. Обычно работают
с нейтральными буферами. По традиции, идущей еще от пионер-
ской работы Вебера и Осборн [Weber, Osborn, 1969], часто ис-
пользуют 0,1 М Na-фосфатный буфер, рН 7,1. Его концентрация
обусловлена только желанием обеспечить 10-кратное различие в
электропроводностях буферов геля и препарата. В качестве по-
следнего берут 0,01 М Na-фосфат, рН. 7,1. Как уже указывалось,
такое различие обеспечивает концентрирование исходной поло-
сы при переходе белков из буфера препарата в гель. Однако
ввиду большой электропроводности Na-фосфатного буфера на-
пряженность поля приходится ограничивать значением 5 В/см,
что замедляет процесс разделения, поэтому вместе Na-фосфат-
ного имеет смысл использовать другой, менее проводящий бу-
фер, например имидазолфосфатный, рН 7. Молярность рабочего
буфера можно снизить до 0,05 М, сохранив для буфера препара-
та концентрацию 0,01 М. Это позволит значительно увеличить
напряженность поля и сократить продолжительность электрофо-
реза.
В электродных резервуарах обычно используют тот же буфер,
что и в геле. В буферы вносят и ДДС-Na до концентрации 0,1%.
Необходимость присутствия ДДС-Na в рабочем буфере геля
одно время оспаривалась [Stoklosa, Latz, 1974]. Авторы цити-
руемой работы утверждали, что ДДС-Na образует с белком
прочный комплекс, не разрушающийся в процессе электрофоре-
за. В более поздней работе, напротив, подчеркивается необходи-
мость введения ДДС-Na в буфер геля или хотя бы в катодный
буфер, откуда он будет поступать в гель. Показано, что ДДС-Na
может выходить из комплекса с белком. В тех случаях, когда
скорость миграции детергента в геле намного больше, чем бел-

61

ка, последний будет терять ДДС-Na и изменять свою подвиж-
ность в геле [Kubo et al., 1979]. Это обстоятельство было пред-
ложено использовать в своеобразном процессе двухстадийного
электрофореза [Sorimachi, Condliffe, 1977]. После обычной об-
работки ДДС-Na и ?-меркаптоэтанолом авторы сначала вели
электрофорез в течение 2 ч в 10%-ном ПААГ, полимеризован-
ном, как обычно, в 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7) с 0,1%
ДДС-Na. Через некоторое время буфер в катодном резервуаре
заменяли на такой же, но без ДДС-Na. Это приводило к быст-
рой очистке геля от детергента, мигрирующего к аноду. Затем
от ДДС-Na освобождались и белки. Дальнейшее разделение шло
уже по заряду белков. При этом рН буфера можно с самого на-
чала выбрать оптимальным именно для второго этапа разделе-
ния, поскольку на первом этапе в присутствии ДДС-Na рН роли
не играет.
Подготовка белкового препарата
На эту операцию следует обратить особое внимание. Сопо-
ставлять молекулярные массы белков по скорости их миграции
можно только в том случае, когда есть уверенность в полной де-
натурации белка при обработке его ДДС-Na.
Вебер и сотрудники ввели широко употребимую до сих пор
процедуру обработки. Белковый препарат диализуют против
0,01 М Na-фосфата, содержащего 0,1% ДДС-Na и 0,1% ?-мер-
каптоэтанола, удаляя из него остатки соли. Затем концентрации
ДДС-Na и ?-меркаптоэтанола увеличивают до 1% (каждого) и
прогревают препарат при 100° в течение 2 мин. Концентрация
белка при этом должна составлять около 1 мг/мл [Weber et al.,
1972]. Если предполагается присутствие в препарате протеаз,
прогрев можно продлить до 5 мин. Показано, например, что
трипсин и химотрипсин сохраняют значительную каталитиче-
скую активность в .присутствии 1% ДДС-Na, но прогрев при
100° в течение 5 мин эту активность полностью подавляет [Рог-
tci, Preston, 1975]. Если же при высокой температуре наблюда-
ется неферментативный гидролиз белка, то прогревание при 100°
можно заменить инкубацией при 37° в течение 2 ч. Перед нане-
сением препарата на гель в него дополнительно добавляют ?-
меркаптоэтанол до концентрации 4 - 5%.
Несмотря на жесткость описанной обработки, авторы метода
рекомендуют при определении молекулярной массы малоизу-
ченного белка проверить полноту его денатурации. Для этой це-
ли они предлагают обрабатывать контрольный препарат белка
по более сложной прописи, гарантирующей его полную денату-
рацию (7 М гуанидинхлорид и 1,5%-ный ?-меркаптоэтанол с по-
следующим алкилированием йодацетамидом). После этого фор-
мируют комплекс белка с ДДС-Na и сопоставляют картины
электрофореза белка, обработанного обычным способом, и кон-
трольного препарата.

62

С другой стороны, некоторые белки, в частности липопротеи-
ды, при кипячении с 1 % ДДС-Na и 1 % ?-меркаптоэтанола мо-
гут выпасть в осадок и не войти в гель. В этих случаях прихо-
дится уменьшать концентрацию ?-меркаптоэтанола или не вво-
дить его совсем.
При повышенной температуре иногда обнаруживается уси-
ленный протеолиз исходных белков. Известно, что денатурация
белка многократно увеличивает его доступность для атаки про-
теолитическими ферментами. ДДС-Na не входит в число их эф-
фективных ингибиторов. Если опасность протеолиза существу-
ет, в исходный препарат до денатурации белков вводят мощные
ингибиторы протеаз: фенилметилсульфонилфторид (300 мкг/мл) и 1,10-фенантролин (1 мг/мл).
Проведение электрофореза
Что касается режима электрофореза, т. е. выбора рабочего
напряжения, силы тока и продолжительности разделения, то
здесь остаются в силе все те соображения, которые были приве-
дены в предыдущем разделе. Вкладом ДДС-Na в электропро-
водность рабочего буфера можно при этом пренебречь. Электро-
форез не следует вести на холоду, так как это может повлечь за
собой выпадение ДДС-Na в осадок (его растворимость очень
сильно зависит от температуры). При длительном электрофоре-
зе электродные буферы следует обновлять.
Для белков с молекулярной массой менее 12000 определение
ее электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na становится ненадежным
даже при высокой концентрации геля. В этом случае локальные
различия в составе и заряде белков, влияющие на их взаимо-
действие с ДДС-Na, уже не усредняются. Степень надежности
определения молекулярной массы малых белков и олигопепти-
дов увеличивается, как было указано, при введении в буфер 8 М
мочевины, а также при увеличении степени сшивки геля.
В 12,5%-ном ПААГ с 0,1% ДДС-Na в присутствии 8 М мочеви-
ны при электрофорезе малых (данзилированных) олигопептидов
с диапазоном М от 1 до 12 тыс. дальтон наблюдалась хорошая
линейная зависимость lg M от Rf [Kato et al., 1975], однако точки
для инсулина (М=5782) и глюкагона (M = 3483) из графика
этой зависимости выпадали.
Разделение улучшается в случае малых исходных количеств
белка (1 - 5 мкг) и длинных гелей с расстоянием миграции око-
ло 15 см. При определении молекулярной массы неизвестного
белка лучше начать подбор условий с 7,5%-ного ПААГ и соот-
ветствующего набора стандартных маркеров. Затем следует
поварьировать условия - и, в частности, сопоставить значения
молекулярной массы исследуемого белка, получающиеся в ге-
лях с различным содержанием акриламида.
В цитированной выше работе Вебера и др. приведен список
около 40 стабильных белков, которые можно использовать в ка-

63

честве стандартных маркеров в интервале М 12 - 200 тыс. даль-
тон. Однако молекулярные массы продажных белков, особенно
при М > 70 тыс., далеко не всегда надежно известны, поэтому
фирма BDH при разработке своих стандартных наборов марке-
ров пошла по другому пути. Она готовит каждый из наборов на
основе только одного белка с хорошо известным значением М,
сшивая его в димеры, тримеры и далее вплоть до гексамеров
обработкой глутаровым альдегидом. Аналогичный подход в свое
время был описан и в лабораторной практике [Inouye, 1971].
Кстати, автор цитируемой работы проводил одновременно и дан-
зилирование своих маркерных белков, что позволяло ему фик-
сировать их положение при УФ-освещении без окраски геля.
При определении молекулярной массы коллагена использо-
вание глобулярных белков в качестве маркеров возможно в том
случае, если строить график зависимости от расстояния мигра-
ции. не самой молекулярной массы белка, а длины его полипеп-
тидной цепи (логарифма числа аминокислотных остатков). Ско-
рость миграции зависит именно от размера молекулы белка -
переход к молекулярной массе предполагает некое среднее ее
значение, приходящееся на один остаток. Между тем, в состав
коллагенов входит необычно много легких аминокислот: глици-
на, аланина, пролина [Noelken et al., 1981].
Окрашивание и элюция белков
Эти вопросы рассмотрены ниже в специальных параграфах,
но все же имеет смысл несколько замечаний, связанных с ис-
пользованием ДДС-Na, сделать именно здесь
После электрофореза в присутствии ДДС-Na гель окрашива-
ют, как обычно, например, в 0,25%-ном растворе СВВ R-250
(см. ниже) в 9%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% мета-
нола, в течение нескольких часов при комнатной температуре, а
затем отмывают в 7,5%-ной уксусной кислоте с 5% метанола и
добавкой ионообменника AG 501 ? 8 для связывания красителя.
Фиксация белков идет одновременно с их окрашиванием. Од-
нако следует иметь в виду, что ДДС-Na является эффективным
детергентом и препятствует осаждению, а следовательно, и
фиксации белков. Для малых белков фиксация при окрашива-
нии может оказаться ненадежной. Их лучше фиксировать пред-
варительно, вымачивая гель в 10%-ной трихлоруксусной кисло-
те (ТХУ). ДДС-Na, находясь в комплексе с белком, еще и пре-
пятствует в некоторой мере самому процессу окрашивания.
10%-ная ТХУ частично отмывает белок от ДДС-Na. Еще лучше
это можно делать, вымачивая гель в 50%-ном растворе ТХУ (в
течение ночи). Изопропанол ускоряет вымывание ДДС-Na, по-
этому его целесообразно включить в фиксирующий белки рас-
твор.
Можно окрашивать белки в геле, вымачивая его прямо в
0,05%-ном растворе СВВ R-250 в 10%-ной ТХУ. Краситель до-

64

вольно плохо растворим в ТХУ, поэтому происходит его распре-
деление между жидкой фазой и белками в пользу последних.
Белковые полосы проявляются очень быстро, и гель можно от
красителя не отмывать. Однако чувствительность окраски не-
сколько снижена по сравнению со стандартной процедурой. Ни-
же будут оценены возможности повышения ее чувствительности
с помощью таких флюоресцентных красителей, как данзилхло-
рид, флюоресцамин, ортофталевый альдегид и др. Здесь умест-
но отметить, что их присоединение к белкам исходного препара-
та не влияет на электрофоретическую подвижность этих белков.
Белок из неокрашенного геля можно извлекать одним из под-
робно рассмотренных ниже способов, в частности повторной
элюцией из кусочков геля встряхиванием в течение 6 - 12 ч при
37° с четырехкратным объемом 0,01 М бикарбоната аммония с
0,1% ДДС-Na. Объединенные элюаты лиофилизируют, удаляя
бикарбонат, и растворяют в воде до 0,1 исходного объема. За-
тем для удаления ДДС-Na добавляют 9 объемов (по отношению
к воде) ацетона, лучше подкисленного, так как в нем хорошо
растворяется ДДС-Na. Белок осаждают центрифугированием и
промывают 90%-ным ацетоном. В случае необходимости более
полного освобождения белков от ДДС-Na лиофилизированный,
как указано выше, элюат из геля растворяют снова в 0,1 объе-
ма, но не воды, а 0,05 М раствора бикарбоната аммония с 6 М
мочевиной (для предотвращения неспецифической сорбции бел-
ка на смоле). Раствор пропускают через микроколонку с Do-
wex 1 ? 2 (200 - 400 МЕШ), уравновешенную тем же буфером.
Мочевину затем удаляют диализом.
Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na сейчас в подав-
ляющем большинстве случаев ведут в системе, предложенной
Лэммли [Laemmli, 1970]. В этой системе обработка белка
ДДС-Na совмещена с использованием описанной ниже схемы
ступенчатого электрофореза. Такое усложнение не кажется
всегда оправданным, поскольку достаточно хорошее сужение
исходной белковой полосы можно получить просто за счет раз-
бавления буфера, в котором вносится препарат. Больший инте-
рес, по-видимому, представляет сочетание обработки белка
ДДС-Na с использованием градиента пористости геля. Этот при-
ем будет рассмотрен ниже.
Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na был успешно
использован для фракционирования белков хроматина без их
предварительной очистки. Хроматин диализовали в течение 12 ч
против 0,01 М Na-фосфата с 1% ДДС-Na и 1% ?-меркаптоэта-
нола при комнатной температуре, а затем еще 12 ч - против
свежей порции такого же раствора при 37°. Только после этого
его прогревали в течение 3 мин при 100° и диализовали еще 2 раза по 12 ч против того же буфера, но содержащего вдесяте-
ро меньше ДДС-Na и (?-меркаптоэтанола. При такой обработке
ДНК отделяется от белка и не мешает протеканию последующе-
го электрофореза белков хроматина [Elgin, 1975].

65

СТУПЕНЧАТЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
(DISC-ELECTROPHORESIS)
Отличительной особенностью этой системы является полиме-
ризация в одной трубке или пластине двух гелей: рабочего, мел-
копористого, и непосредственно над ним - "формирующего",
крупнопористого. Кроме степени пористости, эти два геля резко
различаются по рН и молярности буферов, в которых они поли-
меризуются. Отсюда и название системы - ступенчатый элек-
трофорез. По-английски его сокращенно называют "disc-electro-
phoresis" (от слова "discontinuous"-прерывистый). Этот вид
электрофореза был предложен Орнстейном и Дэвисом еще в са-
мом начале становления метода электрофореза в ПААГ [Ornste-
in, Davis, 1964].
Пористость, длина и выбор буфера для нижнего (рабочего)
геля определяются точно такими же соображениями, что и для
простого непрерывного электрофореза. Единственное, что здесь
своеобразно-это обязательное использование в составе рабо-
чего буфера быстроподвижных ионов, мигрирующих в том же
направлении, что и белки, например: иона Cl- для щелочных бу-
феров или иона К+-для кислых. Выше отмечалось, что ис-
пользование таких ионов невыгодно, так как приводит к огра-
ничению напряженности поля и скорости миграции белков.
Однако в данном случае использование "быстрых" ионов дик-
туется самим существом метода, как это будет ясно из дальней-
шего изложения. Заметим, кстати, что если концентрация этих
ионов и зависит от рН буфера, то их электрофоретическая под-
вижность от рН совершенно не зависит.
В формирующем геле небольшой протяженности (1-3 см)
фракционирования белков не происходит. Наоборот, назначение
этого геля-собрать смесь всех белков перед переходом в ра-
бочий гель в одну узкую полосу, толщина которой может со-
ставлять сотые доли миллиметра независимо от первоначаль-
ного объема препарата. Для рабочего геля она является исход-
ной зоной для фракционирования, а это резко повышает его
разрешающую способность. Поскольку в формирующем геле
белки разделяться не должны, его концентрацию стараются сде-
лать минимальной (Т=2,5-3). Формирующий гель полимери-
зуют обычно в таком же по составу буфере, что и рабочий гель
(следовательно, он тоже содержит быстроподвижный ион), од-
нако по концентрации и значению рН эти буферы не одинаковы.
Буфер формирующего геля, как правило, почти нейтральный,
буфер рабочего геля - щелочной или кислый. Смысл этого раз-
личия будет раскрыт ниже.
Важную роль в ступенчатом электрофорезе играет выбор
электродного буфера, находящегося в контакте с белковым пре-
паратом и формирующим гелем ("верхнего" буфера в случае
использования системы с вертикальным расположением геля).
В этом буфере подвижность иона, мигрирующего в том же на-

66

<<

стр. 2
(всего 4)

СОДЕРЖАНИЕ

>>