<<

стр. 3
(всего 4)

СОДЕРЖАНИЕ

>>

правлений, что и белок, должна сильно зависеть от рН. Для
этого удобно использовать цвиттерионы, например простые ами-
нокислоты (глицин и р-аланин). Их изоэлектрические точки ле-
жат в нейтральной области рН (для глицина рI=5,97). При
этом диссоциации карбоксила с потерей протона и появлением
отрицательного заряда соответствует pKa1=2,34, а ионизации
концевой аминогруппы с присоединением протона и образова-
нием положительного заряда-рКa2=9,6. При рН 5,97 все мо-
лекулы глицина ионизированы по обоим концам и их суммар-
ный заряд равен нулю.
При сдвиге рН окружающей среды в щелочную сторону про-
исходит нейтрализация части молекул глицина по аминогруппе,
в то время как карбоксильные остатки всех молекул сохраняют
свой отрицательный заряд. Процесс этот-чисто статистиче-
ский, и для каждой отдельной молекулы можно говорить толь-
ко о большей или меньшей вероятности того, что она превратит-
ся в отрицательный ион или останется нейтральной. В совокуп-
ности же множества молекул при данном рН заряд будет нести
вполне определенная их доля. При незначительном сдвиге рН от
изоэлектрической точки, например при рН 6,8, эта доля будет
очень мала. При рН=рКa2 (9,6), согласно определению рК, уже
половина всех молекул должна быть нейтрализована по амино-
группе и, следовательно, заряжена отрицательно. Для фигури-
рующих ниже значений рН 8,3 и 8,9 количество отрицательных
ионов глицина будет меньше 50%, но все-таки значительным.
Описанные изменения доли заряженных молекул глицина
(или аланина) используются в системе ступенчатого электрофо-
реза. Для разных ступеней используют разные буферы, содер-
жащие, однако, в своем составе одно и то же слабое основание
или слабую кислоту, обеспечивающие собственно буферный эф-
фект: в щелочной буферной системе, где удобно фракциониро-
вать кислые белки, это может быть Трис, а в кислой системе
для разделения гистонов-уксусная кислота.
Рассмотрим для примера щелочную систему Орнстейна и
Дэвиса (рис. 21). Верхним буфером служит 0,005 М Трис, тит-
рованный добавлением глицина до рН 8,3. Глицин по отноше-
нию к Трису выступает в роли слабой кислоты. Для достижения
рН 8,3 концентрацию глицина приходится довести до 0,038 М.
При рН 8,3, как мы видели, значительная доля его молекул
должна быть заряжена отрицательно, что обеспечивает хорошую
электропроводность верхнего электродного буфера.
Крупнопористый формирующий гель полимеризуют в
0,0625 М Трис-HCl, рН 6,8. В таком же буфере вносят и препа-
рат (с добавкой, как обычно, до 10% глицерина или сахарозы).
Первоначально электропроводность этого буфера будет тоже
высокой благодаря ионам С1-. Их концентрация при рН 6,8 до-
статочно высока (см. выше).
Наконец, рабочий гель полимеризуют в 0,375 М Трис-HCl,
рН 8,9. Обращает на себя внимание высокая концентрация бу-

67


Рис. 21. Схема ступенчатого электрофореза
А - перед включением напряжения; Б - момент концентрирования препарата в тонкую
исходную полоску; В - фракционирование белковых зон
фера, необходимая по двум причинам. Во-первых, при рН 8,9
буферная емкость Трис-НСl уже мала, а в этом буфере должны
мигрировать сконцентрированные белковые полосы. Во-вторых,
относительное содержание ионов С1- при таком значении рН не-
велико, и для обеспечения необходимой электропроводности кон-
центрацию буфера приходится увеличивать. Нижний электрод-
ный буфер существенной роли не играет. Например, можно
взять 0,1 М Трис-HCl, рН 8,1.
Теперь рассмотрим процессы, протекающие в этой системе
после включения электрического напряжения. В первый момент
напряженность поля будет примерно одинаковой во всех ступе-
нях системы и начнется переход белков из буфера препарата в
формирующий гель. В это же время в верхней части формирую-
щего геля начнет развиваться новая ситуация. Под действием
поля ионы Cl- будут быстро уходить в направлении рабочего
геля, а на их место из электродного буфера будут поступать
ионы глицина. Но здесь они окажутся в буфере с рН 6,8. При
этом, как следует из изложенного, большинство молекул глици-
на восстановит заряд своих аминогрупп, нейтрализуется и пере-
станет участвовать в проведении тока. Сопротивление буфера
препарата, а за ним и верхней части формирующего геля резко
возрастет. Вместе с ним возрастет и напряженность поля. He-

68

многочисленные при рН 6,8 заряженные молекулы глицина
ускорят свое движение к аноду, обеспечивая непрерывность
электрического тока по всему гелю.
Неправильно представлять себе дело так, что только малое
число молекул глицина будет мигрировать в поле, а остальные
останутся на месте. Состояние диссоциации-ассоциации амино-
групп-это статистическое равновесие, захватывающее всю со-
вокупность молекул глицина, находящихся в растворе. Поэтому
все они (рывками) будут мигрировать в направлении анода, но
в каждое мгновение электрический заряд будет переносить лишь
небольшое число молекул, заряженных именно в это мгновение.
Но вернемся к событиям, развивающимся в геле.
Мы видели, что в верхней части формирующего геля возни-
кает область повышенной напряженности поля, в которой ока-
зываются и успевшие перейти в гель белки. Естественно, что
они мигрируют в ней относительно быстро. Так же быстро идет
переход белков из буфера препарата в формирующий гель.
Впрочем, белки мигрируют все же медленнее, чем ионы глици-
на, так как отношение заряда к массе у белков меньше. Описан-
ные явления постепенно распространяются на весь формирую-
щий гель. Ионы хлора, отступая, очищают весь объем этого ге-
ля. Вплотную за ними к границе с рабочим гелем подходит
глицин. Теперь весь формирующий гель находится в зоне повы-
шенной напряженности поля. В этом поле ускоренно движутся
белки, уже перешедшие из исходного раствора препарата в фор-
мирующий гель. Никакого их концентрирования пока не проис-
ходит; оно начнется лишь тогда, когда впереди идущие моле-
кулы белка достигнут границы рабочего геля. Тем временем
линия раздела ионов хлора и глицина уйдет уже в рабочий гель,
где замена одних ионов на другие не вызовет увеличения напря-
женности поля. Дело в том, что здесь молекулы глицина ока-
зываются при рН 8,9, который обеспечивается степенью иони-
зации и высокой концентрацией Триса. При этом рН большая
часть нейтральных молекул глицина снова превращается в ио-
ны. Эти нейтральные молекулы оказались в рабочем геле в силу
статистического характера миграции глицина, который был
описан выше. Электропроводность Трис-глицинового буфера в
верхней части рабочего геля оказывается столь же высокой, как
и Трис-НСl (этого добились подбором рН 8,9 и концентрации
всех компонентов системы). Напряженность электрического по-
ля в рабочем геле соответственно остается низкой, и это обстоя-
тельство играет решающую роль в концентрировании белков.
Впереди идущие молекулы белков достигают границы раз-
дела и переходят в рабочий гель, где попадают в область низ-
кой напряженности поля. Скорость их миграции резко падает.
Между тем следующие за ними молекулы белка еще движутся в
объеме формирующего геля, т. е. в области высокой напряжен-
ности поля, и движутся быстро. Потом и они входят в рабочий
гель и почти останавливаются. Это происходит со всеми моле-

69

кулами препарата. Находившиеся далеко сзади молекулы бел-
ка догоняют (почти догоняют) ушедшие вперед молекулы. Весь
исходный препарат, каков бы ни был его начальный объем, в
самом верху рабочего геля стягивается в тонкую полоску бел-
ков. Отсюда и начинается их медленная миграция в мелкопори-
стом геле при щелочном значении рН, т. е. фракционирование
белковой смеси. Между тем граница раздела ионов хлора и гли-
цина уходит все дальше вперед, и через какое-то время весь ра-
бочий гель оказывается в Трис-глициновом буфере примерно с
тем же рН. Замена буфера не сказывается на разрешающей
способности рабочего геля, а то обстоятельство, что фракцио-
нирование белков начинается с узкой исходной зоны, дает колос-
сальный выигрыш-разрешающая способность системы в целом
резко увеличивается. Для полноты картины отметим, что заря-
женные ионы Трис+, участвуя в поддержании рН буфера, будут,
замещая друг друга, медленно мигрировать вверх, в сторону ка-
тода. Ввиду малой подвижности этих ионов их вклад в электро-
проводность невелик.
Аналогичную картину ступенчатого электрофореза легко
Представить себе и для кислого буфера рабочего геля. В качест-
ве слабой ("буферной") кислоты можно использовать уксусную,
а роль быстро мигрирующего иона "поручить" К+. В качестве
цвиттериона, поставляющего медленно мигрирующие ионы, бе-
рут??-аланин. Подбор количественного соответствия концентра-
ций и рН дает следующую пропись для построения системы. Для
получения буфера рабочего геля 4,3%-ный водный раствор ук-
сусной кислоты титруют КОН до рН 4,3. Буфер формирующего
геля готовят аналогичным титрованием 0,35%-ного раствора ук-
сусной кислоты до рН 5,8. Буфер верхнего электрода (анода)
получают из 0,035 М водного раствора р-аланина, титруя его до
рН 4,5 опять-таки уксусной кислотой. Напомним (и это следует
не упускать из виду, особенно для лабильных белков), что рН
буфера рабочего геля во время фракционирования в нем белков
оказывается несколько иным, чем первоначальный (примерно
на 0,5 выше в случае использования щелочного буфера и на-
столько же ниже - для кислого).
Мочевину, детергенты (ДДС-Na, Тритон Х-100 и Твин-80), а
также ?-меркаптоэтанол или дитиотреитол можно вводить в со-
став буферов обоих гелей, например: с целью растворения труд-
норастворимых белков или для защиты их от окисления.
Как уже упоминалось, ступенчатый электрофорез можно ис-
пользовать и для разделения белков, находящихся в комплексе
с ДДС-Na. Такая система была разработана Лэммли еще де-
сять лет назад [Laemmli, 1970]. С тех пор она приобрела чрез-
вычайную популярность. Хотя выше и было высказано некото-
рое сомнение в том, что ее использование всегда оправдано, си-
стема заслуживает подробного описания.
В качестве рабочего геля в ней используют 10%-ный ПААГ,
формирующего-3%-ный; для обоих гелей С=2,6. Буфером

70

рабочего геля, как и у Ористейна и Дэвиса, служит 0,375 М
Трис-НСl (рМ 8,8) с добавлением ДДС-Na до 0,1%. Попутно
отметим, что 0,1%-ный ДДС-Na не препятствует развитию бак-
териальной флоры при комнатной температуре, поэтому его на-
до хранить на холоду. Электрофорез ведут в трубках диаметром
6 мм и длиной 15 см. Рабочий гель полимеризуют на длину
10 см, формирующий-на 1 см. Для формирующего геля Лэм-
мли использовал буфер вдвое большей концентрации, чем Орн-
стейн и Дэвис (0,125 М Трис-HCl, рН 6,8, с 0,1% ДДС-Na).
Для полимеризации в оба геля он вносил по 0,025% персульфа-
та аммония и ТЕМЕД. Верхний электродный буфер Лэммли
содержал Трис впятеро более высокой концентрации, чем цити-
ровалось выше (0,025 М), титрованный глицином до той же ве-
личины рН (8,3), чему соответствовала и впятеро более высокая
концентрация глицина (0,192 М). 0,1% ДДС-Na присутствовал
и в этом буфере.
Белковый препарат (0,2-0,3 мл) вносят в 0,0625 М Трис-
НС1 (рН 6,8), содержащем 10% глицерина и 0,001% бромфено-
лового синего. В препарат добавляют ДДС-Na до 2% и ?-мер-
каптоэтанол до 5%, а затем прогревают его в течение 1,5 мин
на кипящей водяной бане. Цель такой обработки была указана
выше. Если исходный белковый препарат имеется в виде осадка,
то его следует сначала растворить в буфере, а потом уже до-
бавлять ДДС-Na из концентрированного раствора. В противном
случае на поверхности осадка комплекс белок-ДДС-Na может
образовать корку, препятствующую его полному растворению
[Maizel, 1971].
Электрофорез при силе тока 3 мА на трубку занимает 7 ч.
Фиксацию белков в 50%-ном растворе ТХУ ведут в течение ночи,
окрашивание свежеприготовленным 0,1%-ным раствором СВВ
R-250 в 50%-ной ТХУ-в течение часа при 37°. Избыток краси-
теля из геля вымывают диффузией в 7%-ной уксусной кислоте.
Система Лэммли так же успешно используется для электро-
фореза в пластинах ПААГ. Для иллюстрации на рис. 22 пока-
зано расположение полос при сопоставлении субъединичного
состава трех РНК-полимераз амебы [D'Alessio et al., 1979]. Хо-
рошо видна высокая степень разрешения близких по молеку-
лярной массе полипептидов. Иногда ступенчатый электрофорез
по Лэммли используют в сочетании с градиентом пористости
рабочего геля, что еще более повышает разрешающую способ-
ность метода [Mahadik et al., 1976]. В случае угрозы агрегации,
например при фракционировании кислых белков хроматина, в
оба геля системы Лэммли можно ввести мочевину [Wilson, Spel-
sberg, 1975].
Имеются подтвержденные данные о том, что система, пред-
ложенная Лэммли, чувствительна к качеству ДДС-Na [Swaney
et al., 1974; Matheka et al., 1977]. Препараты, полученные от од-
них фирм ("Pierce", "Matheson, Coleman and Bell"), дают хоро-
шие результаты, в то время как с другими препаратами ДДС-

71

Na (BDH, "Serva") разрешение полу-
чается плохое, а белки менее под-
вижны. Этот эффект зависит и от
того, какие белки разделяются. Для
других буферных систем он не наблю-
дается, но белки разделяются в них
зачастую вообще хуже, чем в системе
Леммли. Природа описанного эффек-
та непонятна. По-видимому, при высо-
кой концентрации Триса связывание
ДДС-Na с белками зависит от моле-
кулярного состава детергента. Анализ
методом газовой хроматографии пока-
зывает, что продажные препараты
ДДС-Na неоднородны. В них может
содержаться до 10% примесей, имею-
щих значительно больше чем 12 ато-
мов углерода на молекулу.

Отмечено также, что некоторые,
особенно высокомолекулярные, белки
после первоначального полного их
восстановления обработкой ?-меркап-
тоэтанолом и ДДС-Na в ходе электро-
фореза снова частично окисляются с
образованием дисульфидных мости-
ков между полипептидными цепями,
что приводит к размыванию полос и не-
воспроизводимости результатов раз-
деления. Рекомендуется восстанов-
ленное состояние белкового препарата
закреплять путем его алкилирования
по SH-группам обработкой йодацета-
мидом. Для этого исходный препарат

Рис. 22. Фракционирование
РНК-полимераз I, II и III
амебы в системе Лэммли
[D'Alessio et al" 1979]
Цифры слева - молекулярные
массы некоторых субъединиц
(тыс. дальтон)
инкубируют с избытком этого реагента по отношению к количе-
ству внесенного для восстановления белка ?-меркаптоэтанола
при 50° в течение 15 мин. От избытка йодацетамида и побочных
продуктов реакции можно не избавляться, а наносить всю инку-
бационную смесь прямо на гель [Lane, 1978].
Ступенчатый электрофорез в сочетании с обработкой ДДС-
Na успешно используется для пептидного анализа и сопоставле-
ния белков по пептидному составу. В 1977 г. группа авторов с
участием Лэммли предложила для этой цели систему двумерно-
го электрофореза, в которой ферментативный гидролиз белков
проводят без их элюции, непосредственно в геле, после чего ве-
дут электрофорез во втором направлении, позволяющий сопо-
ставлять пептиды [Cleveland et al., 1977]. В первом направлении
используют описанную выше систему Лэммли для разделения
смеси сопоставляемых белков. После кратковременной окраски
с целью обнаружения полос индивидуальных белков последние

72

вырезают и вымачийают в буфере формирующего геля. Затем
их помещают в карманы пластины геля второго направления,
добавляют туда по 10 мкл того же буфера, но содержащего 20%
глицерина, а потом наслаивают еще по 10 мкл буфера, но с 10%
глицерина, в котором растворена сооответствующая протеаза.
Во втором геле снова сформирована система ступенчатого элек-
трофореза по Лэммли. Включают напряжение, а когда бром-
феноловый синий приблизится к границе рабочего геля, напря-
жение на 30 мин отключают. За это время протеаза, которая
тоже перешла в формирующий гель, гидролизует белок непо-
средственно в нем. В присутствии ДДС-Na протеолиз проходит
не полностью, но в определенных условиях воспроизводимо.
В ходе дальнейшего электрофореза пептиды разделяются и мо-
гут быть сопоставлены в параллельных треках пластины.
Без существенных изменений этот подход был использован
и другими авторами [Przybyla et al., 1979; Gadasi et al., 1979].
В аналогичной работе (Bordier, Crettol-Jarvinen, 1979] в первом
направлении использовали систему Лэммли в сочетании с гра-
диентом пористости рабочего геля в пластине-концентрация
ПААГ изменялась от 5 до 17,5%. При внесении в карманы геля
второго направления полоски индивидуальных белков, вырезан-
ные из пластины первого направления, заливали расплавлен-
ным 1%-ным раствором агарозы, чтобы фиксировать их исход-
ное положение на дне кармана. В другой недавней работе
[Nikodem, Fresco, 1979] белки гидролизовали бромистым циа-
ном. Как и в предыдущей работе, в первом направлении белки
фракционировали ступенчатым электрофорезом с обработкой
ДДС-Na в градиенте пористости геля, вырезали слегка окрашен-
ные полоски белков и обрабатывали их BrCN прямо в геле.
Реакцию вели в маленьких пластмассовых флаконах под тягой.
Затем полоски геля вымачивали в буфере и переносили в кар-
маны пластины второго направления для разделения пептидов.
Другие авторы [Boulikas et al., 1980] аналогичным образом про-
водили промежуточный гидролиз белков в геле N-бромсукцин-
имидом. В первом направлении белки разделяли электрофоре-
зом в "кислой мочевине".
Особенно совершенной оказалась двумерная система фрак-
ционирования белков и пептидов, предложенная 0'Фаррелом
[O'Farrel, 1975]. В этой системе во втором направлении также
использована методика Лэммли в сочетании с градиентом пори-
стости ПААГ. Подробный разбор системы 0'Фаррела и ее мо-
дификаций здесь провести нельзя, поскольку в первом направ-
лении в ней используется не электрофорез, а электрофокусиро-
вание.
ГРАДИЕНТ ПОРИСТОСТИ ПААГ
В конце предыдущего раздела было рассмотрено несколько
примеров использования градиентов пористости ПААГ. Теперь
рассмотрим возможности этого метода подробнее.

73

Техника приготовлений гелей с изменяющимися вдоль на-
правления миграции белков размерами пор, или, как их назы-
вают, "градиентов пористости ПААГ", была подробно описана
в главе 2. Постепенное уменьшение среднего размера пор вдоль
градиента достигается путем увеличения концентрации акрил-
амида. Электрофорез в градиенте пористости ПААГ имеет це-
лый ряд существенных преимуществ.
Во-первых, ему присуще самоограничение миграции белков
в геле. По мере продвижения в электрическом поле белковые
зоны попадают в области все более мелких пор, трение о гель
усиливается и движение зон замедляется. Если размеры белков
достаточно велики, то в какой-то момент времени миграция их
может практически прекратиться. Для разных зон этот момент
наступает не обязательно одновременно. Белки каждой зоны
мигрируют до своего конечного положения, соответствующего их
размерам, независимо друг от друга. Достигнув этого положе-
ния, они могут оставаться в нем неограниченно долго. Для бел-
ков разной величины конечные положения окажутся в разных
участках градиента пористости. К моменту окончания процесса
фракционирования в целом все белковые зоны займут свои ста-
ционарные положения и останутся в них до тех пор, пока будет
включено электрическое напряжение. Таким образом, экспери-
ментатору нет нужды наблюдать за окончанием электрофореза.
Его продолжительность можно выбрать "с запасом", например
поставить опыт на ночь.
Во-вторых, в ходе электрофореза происходит непрерывное
сужение белковых зон. Оно происходит потому, что белки в пе-
редней части каждой зоны постоянно оказываются в области
чуть более мелких пор, чем идущие в задней части этой же зоны.
Впереди идущие белки, таким образом, тормозятся гелем не-
много сильнее, а идущие сзади их постепенно догоняют. Этот
процесс противодействует диффузии белков из зоны. Убедитель-
ная иллюстрация эффективности такого противодействия была
приведена выше (см. рис. 16).
При электрофорезе в градиенте пористости ПААГ отпадает
необходимость в первоначальном сужении полос. Можно вести
электрофорез в простой непрерывной системе и не очень забо-
титься об объеме исходного препарата. Сделанное замечание
находится в противоречии с цитированными выше недавними
работами, где градиентный гель использовали в сочетании со
ступенчатым электрофорезом по Лэммли. Возможно, что при та-
ком сочетании хорошее разделение зон достигается быстрее, но
не исключено, что в некоторых конкретных случаях оно обус-
ловлено определенным консерватизмом и "перестраховкой".
По существу, картина разделения белковых зон при электро-
форезе в градиенте пористости ПААГ зависит только от соот-
ношения размеров белков в препарате и характера градиента
пористости. Выбор буфера и электрического режима электрофо-
реза играет второстепенную роль. Поэтому, в частности, можно

74

использовать любые буферы сравнительно малой концентра-
ции (0,03-0,05 М), достаточной лишь для сохранения знака
заряда белка. Это позволяет повысить напряженность поля, что
для данного метода немаловажно, так как скорости миграции
белков при приближении к конечным положениям существенно
уменьшаются.
Указанные преимущества объясняют растущую популяр-
ность градиентных гелей, несмотря на большую сложность их
приготовления по сравнению с обычным ПААГ. Легко понять, '
почему такая ведущая фирма, как "Pharmacia", специализиро-
валась на выпуске стандартизированных градиентных ПААГ.
Фирма предлагает гели в виде пластин с рабочими размерами
78х78х2,7 мм для двух интервалов концентраций ПААГ: 2-
16% и 4-30% (РАА 2/16 и РАА 4/30). Профиль градиента по-
ристости в этих пластинах подобран так, что в пределах некото-
рого диапазона- молекулярных масс нативных глобулярных бел-
ков они обеспечивают линейную зависимость расстояния миг-
рации белка (до конечного положения) от логарифма его моле-
кулярной массы. Калибровочные данные прилагаются фирмой
к каждому гелю вместе с указанием стандартных условий
фракционирования. Рабочие диапазоны молекулярных масс та-
ковы: для РАА 2/16-от 100 тыс. до 5 млн. дальтон, для РАА
4/30 - от 50 тыс. до 2 млн. Для РАА 4/30, например, это озна-
чает, что при достаточно длительном электрофорезе белки с мо-
лекулярной массой менее 50 тыс. могут выйти из геля, а имею-
щие массу более 2 млн.-не войдут в него. Последняя цифра
может относиться, конечно, только к белковым комплексам или
нуклеиновым кислотам.
Градиентами пористости ПААГ можно, как мы видели, поль-
зоваться и для разделения комплексов белок-ДДС-Na. Ламбен
обнаружил, что для белков, обработанных ДДС-Na, линейный
градиент концентрации ПААГ в интервале 3-30% позволяет
проводить электрофорез до полной обстановки белков с молеку-
лярными массами от 13 до 950 тыс. дальтон. При этом справедливо
следующее линейное соотношение: lg M = A lg T+B, где М-
молекулярная масса белка, а Т-концентрация ПААГ в месте
расположения белковой полосы. Для линейного градиента эта
концентрация легко вычисляется по расстоянию полосы от нача-
ла пластины. А и В-коэффициенты, указывающие на линей-
ный характер зависимости. Определять их нет нужды, если име-
ется возможность воспользоваться, как обычно, набором мар-
керных белков. Обработку исходного препарата можно прово-
дить в тех же условиях, что для обычного электрофореза в ПААГ
с ДДС-Na [Lambin, 1978].
Недавно Ламбен и Фаин [Lambin, Fine, 1979] предложили
способ определения молекулярной массы нативных белков (без
ДДС-Na) по кинетике их миграции в линейном градиенте кон-
центрации ПААГ (3-20%). Оказалось, что для любого белка
характер его непрерывно замедляющегося движения в таком

75

геле хорошо описывается линейной зависимостью: ??t=aD+b,
где t-любой момент времени с начала электрофореза, пока
белок еще движется; D-пройденное им к этому моменту рас-
стояние в геле; а и b - постоянные в данном опыте величины.
Для каждого конкретного белка такую зависимость легко
получить экспериментально. Удобно, например, в разные карма-
ны одной пластины геля последовательно, через известные про--
межутки времени, вносить аликвоты раствора исследуемого
белка. К моменту прекращения опыта для каждого трека на
пластине будет известна продолжительность электрофореза, а
расстояние миграции легко измерить. Это можно сделать даже
для смеси нескольких белков. Далее по экспериментальным точ-
кам строят график зависимости ??t от D, имеющий вид прямой
линии. Тангенс угла наклона этой прямой-значение коэффи-
циента а в написанном выше уравнении. Ясно, что этот коэффи-
циент должен зависеть от молекулярной массы белка: чем он
крупнее, тем медленнее мигрирует в геле. Оказывается, что
соотношение между логарифмами коэффициента а и молеку-
лярной массы белка имеет тоже приблизительно линейный ха-
рактер в широком интервале молекулярных масс-от 20 до
950 тыс. дальтон. Коэффициенты в этом втором линейном урав-
нении зависят от выбора буфера. Авторы дают их значения для
трех стандартных буферов: фосфатного (рН 7,2), Трис-боратно-
го (рН 8,2) и Трис-барбитуратного (рН 9,8). Так, для 0,01 М
Na-фосфатного буфера (рН 7,2) имеет место зависимость:
Lg M = l,93 lg a + 6,99. Точность определения молекулярной мас-
сы невысока-в среднем ±20%. Однако важное достоинство
метода состоит в возможности оценивать суммарную молеку-
лярную массу белков, состоящих из субъединиц, которые диссо-
циируют при обработке ДДС-Na. Таким образом, комбинируя
результаты определения молекулярной массы некоего белка
описанным методом с тем, что дает для него же электрофорез с
использованием ДДС-Na, можно выяснить субъединичное строе-
ние белка.
В заключение следует подчеркнуть, что градиентный гель хо-
рош только для разделения белков по размерам. В случае раз-
деления по заряду он может даже ухудшить результат, так как
белки с различной величиной заряда, но одинаковых размеров
при длительном электрофорезе остановятся в одном и том же
месте.
ДВУМЕРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПААГ
Полное разделение сложной смеси белков далеко не всегда
удается осуществить в ходе одного опыта даже с применением
описанных выше приемов повышения разрешающей способно-
сти электрофореза в ПААГ. Всегда достаточно высока вероят-
ность того, что в данной системе электрофореза различные бел-
ки мигрируют в одной зоне либо в силу близости их размеров,
либо ввиду совпадения значений их электрофоретических под-

76

вижностей при выбранном значении рН, либо, наконец, в ре-
зультате неблагоприятной для разделения комбинации этих
параметров. Поэтому в сложных случаях каждую полосу после
первого электрофоретического фракционирования смеси бел-
ков следует проверить на гомогенность, используя ее как исход-
ный препарат для электрофореза в других условиях. Это можно
сделать одновременно для всех полос первого разделения, или,
как его часто называют, "разделения в первом направлении".
Для этого трубку или полоску, вырезанную по всей длине трека
из пластины первого направления, накладывают на стартовую
зону пластины "второго направления". Контакт между двумя
гелями обеспечивают, заливая место их соприкосновения стар-
товым буфером или, для надежности, расплавленным раствором
агарозы в этом же буфере. Электрофорез ведут в направлении,
перпендикулярном длине трубки или полоски. Каждая негомо-
генная белковая полоса может дать несколько пятен, если при
новых условиях электрофореза подвижности первоначально об-
разовавших ее нескольких белков окажутся неодинаковыми.
В результате на пластине второго направления после прокра-
шивания выявляется картина распределенных по всей поверх-
ности пятен, напоминающая "фингерпринт" в двумерной тонко-
слойной хроматографии. Число пятен, которое удается разли-
чить на одной пластине, в некоторых случаях приближается к
двум тысячам (!).
При сочетании гелей двух направлений вовсе не обязательно,
чтобы они были одинаковой толщины. Например, гель из труб-
ки диаметром 6 мм вполне можно совместить с пластиной толщи-
ной 1 мм. Для этого в месте перехода от трубки к пластине сле-
дует образовать продольно расположенную полость, предпочти-
тельно клиновидного сечения, куда можно заложить цилиндрик
геля и залить'его там буфером, агарозой или даже заполиме-
ризовать в переходный, крупнопористый ПААГ. Способ образо-
вания и форма сечения этой полости не играют большой роли.
Необходимо выполнить только одно условие: цилиндрик или по-
лоска геля первого направления должны лежать параллельно
краю геля в пластине второго направления. Можно, например,
воспользоваться простым вкладышем из плексигласа (рис. 23).
Этот вкладыш легко монтируется в обычный прибор для элек-
трофореза в вертикальной пластине [Hoffman, Dowben, 1978a].
Иногда из цилиндрика вдоль его продольной оси вырезают пло-
ский, тонкий слой и накладывают его на гель второго направ-
ления, как и полоску трека, вырезанную из пластины. Для вы-
резания плоского слоя из трубки (в замороженном состоянии)
удобно воспользоваться простым приспособлением, описанным
Уоттсом и др. [Watts et al., 1977].
В каждом из направлений двумерного электрофореза ис-
пользуют одну из рассмотренных выше систем, отвечающую спе-
цифическим особенностям фракционируемых белков. Широкое
применение двумерный электрофорез нашел, например, для

77


Рис. 23. Вкладыш из плексигласа для двумерного электрофореза [Hoffman,
Dowberi, 1978a]
Рис. 24. Результаты двумерного электрофореза рибосомальных белков [Mets,
Bogorad, 1974]
I-первое направление; II-второе направление
анализа белков рибосом из разных источников. Это, в основном,
слабощелочные белки, и в первом направлении их разделяют ча-
ще всего по заряду. Для этого используют крупнопористый гель,
чтобы различие молекулярных размеров по возможности не
сказывалось на разделении белков в этом направлении, т. е. не
накладывалось на разделение по заряду. Во втором направле-
нии в этом случае белки разделяют по их размерам.
Так, Мете и Богорад электрофорез рибосомальных белков в
первом направлении проводили в трубках диаметром 4 мм и
длиной 10 см [Mets, Bogorad, 1974]. 4%-ный ПААГ полимери-
зовали в буфере с рН 5. При этом все рибосомальные белки за-
ряжены положительно и различия значений их суммарных за-
рядов выражены наиболее ярко. В буфер вводили 8 М мочевину,
чтобы помешать агрегации белков. При полимеризации геля
вносили больше ТЕМЕД, чем персульфата аммония (0,1 и
0,03%), так как в кислой среде каталитическая активность
ТЕМЕД понижена (см. главу 2). 0,1-0,2 мг смеси рибосомаль-
ных белков вносили растворенными в 8 М мочевине с 10 мМ ди-
тиотреитолом. Разделение вели при силе тока 1,5 мА на трубку
в течение 4-5 ч. Во втором направлении использовали ступен-
чатый электрофорез. Рабочим гелем служил 10%-ный ПААГ,
полимеризованный в буфере с рН 6,75. Формирующий гель-
такой же, как гель первого направления (4% ПААГ, рН 5). Его
полимеризовали вокруг геля из трубки, уложенного в клиновид-
ное расширение над пластиной. Концентрацию мочевины в этом
геле снизили до 7 М, чтобы цилиндрик не мог всплыть во время
полимеризации. В качестве медленно мигрирующего иона верх-
него электродного буфера использовали MES (2-(N-морфолино-

78

этенсульфокислоту) - продажный препарат для составления
буферов с рКа 6,15. Быстрым ионом служил остаток уксусной
кислоты. В состав верхнего буфера ввели также 1% ДДС-Na и
0,01% тиогликолевой кислоты, которая, как уже упоминалось,
служит для очистки гелей от остаточных свободных радикалов
персульфата аммония. Она мигрирует из электродного буфера
в гель, где и движется впереди белков. Отметим, что преэлек-
трофорез в ступенчатой системе невозможен-он нарушил бы
распределение ионов по ступеням. Однако его можно провести
предварительно, использовав в качестве верхнего обычный бу-
фер с быстро мигрирующим ионом, а затем заменить его, как
описано выше. Верхний электрод является катодом, анод рас-
положен внизу. Под действием поля ДДС-Na из верхнего элек-
тродного буфера мигрирует в гель. В цилиндрике геля первого
направления он образует комплексы с белками. Далее отрица-
тельно заряженные комплексы белок - ДДС-Na выходят из ци-
лкндрика и фракционируются ступенчатым электрофорезом в
пластине. Обработка белков ДДС-Na, таким образом, 'происхо-
дит в отсутствие ?-меркаптоэтанола. Его отчасти заменяет мо-
чевина; кроме того, исходно, до электрофореза в первом направ-
лении, белки восстанавливают 10 мМ дитиотреитолом. Электро-
форез во втором направлении ведут в течение 5 ч при силе тока
25 мА на пластину. Метод удобен тем, что между разделениями
в первом и втором направлениях нет надобности вымачивать
гель, так как буфер геля первого направления-тот же, что и у
формирующего геля второго направления. Результаты электро-
фореза представлены на рис. 24.
В другой работе [Howard, Traut, 1973] разделение рибосо-
мальных белков по заряду в первом направлении вели тоже в
4%-ном ПААГ в присутствии 6 М мочевины, но в 0,4 М Трис-
боратном буфере, рН 8,7. При этом рН часть белков рибосом
оказывается заряженной отрицательно, а другая часть-поло-
жительно. Белковый препарат смешивали с расплавленной
1%-ной агарозой и вносили в середину трубки, наслаивая его
на заполимеризованный нижний участок ПААГ. После затвер-
девания агарозы в трубку заливали новую порцию смеси моно-
меров и полимеризовали верхний участок ПААГ. При этом в
интересах концентрирования полос на обеих границах с ПААГ
агарозу с белковым препаратом полимеризовали в разбавлен-
ном (0,06 М) Трис-боратном буфере. При включении напряже-
ния миграция белков шла в обе стороны-к катоду и аноду.
Во втором направлении разделение белков вели по их размерам,
но без обработки ДДС-Na. Для этого использовали пластину
еще. более мелкопористого геля, чем в предыдущей работе (T=
=18,25; С=1,37), полимеризованного в 0,9 М уксусной кисло-
те, титрованной КОН до рН 4,5, также с добавлением 6 М моче-
вины. В этом случае все белки были заряжены положительно и
мигрировали к катоду. В качестве лидирующего красителя ис-
пользовали 0,1%-ный раствор пиронина. Из цилиндрика геля

79

вдоль его продольной оси вырезали плоскую полоску, вымачи-
вали ее в 0,013 М К-ацетатном буфере (рН 5,2) с 8 М мочеви-
ной. Полоску зажимали между стеклянными пластинками фор-
мы и прямо на нее заливали раствор мономеров рабочего геля.
Катионом верхнего электродного буфера служил глицин
(˜0,19 М), титрованный уксусной кислотой до рН 4. Таким об-
разом, осуществлялась система ступенчатого электрофореза,
где в качестве быстрого иона выступал К+, а медленного-гли-
цин. Отметим, что в системе Орнстейна и Дэвиса глицин фигу-
рировал в качестве медленного аниона, а здесь он служил ка-
тионом. Возможность такого двоякого использования вытекает
из цвиттерионной природы глицина. Формирующим гелем в этой
системе служила сама полоска, вырезанная из геля первого на-
правления. Аналогичная система двумерного электрофореза ри-
босомальных белков описана и в другой работе [Sherton, Wool,
1974]. .
Гамильтон [Hamilton, 1974] при разделении рибосомальных
белков по заряду в первом направлении использовал ступенча-
тый электрофорез в кислом буфере (7,5%-ный ПААГ с рН 4,6-
в рабочем геле, 2,5%-ный ПААГ с рН 6,5-в формирующем).
Во втором направлении он вел разделение белков в комплексе
с ДДС-Na в 15%-ном ПААГ. Обработку детергентом он осуще-
ствлял, вымачивая извлеченный из трубки гель первого направ-
ления в 1%-ном растворе детергента. В работе были определены
молекулярные массы рибосомальных белков (путем сравнения
с маркерами во втором направлении) и оценены их количествен-
ные соотношения в составе малой субъединицы рибосом печени
крысы.
Интересный подход к фракционированию рибосомальных
белков был использован в недавней работе [Hoffman, Dowben,
1978b]. При разделении в первом направлении авторы исполь-
зовали различие в протяженности гидрофобных участков по-
верхности у разных белков рибосомы. Оно проявлялось в степе-
ни связывания этих белков с мицеллами Тритона Х-100, который
вводили при полимеризации геля до концентрации 0,15%. Ком-
плексы белков с Тритоном Х-100 разделяли по размеру в 8%-ном
ПААГ в присутствии 2 М мочевины. Концентрация детергента
была оптимальной; при меньших концентрациях он мало влияет
на подвижность белков, а при больших, как уже отмечалось,
препятствует последующей обработке ДДС-Na, который в этой
работе использовали при фракционировании белков во втором
направлении. Подробнее об использовании Тритона Х-100 в этих
целях будет сказано в следующем разделе.
В качестве лидирующего красителя при фракционировании
рибосомальных белков в кислом буфере недавно было предло-
жено использовать FeCl3. Ионы Fe3+ в присутствии уксусной
кислоты образуют стойкие комплексы коричневого цвета, миг-
рирующие к катоду впереди самого мелкого из рибосомальных
белков [Bernabeu et al., 1979].

80


Рис. 25. Сочетание хроматографии с электрофорезом в геле агарозы fBloom,
Anderson, 1979]
1 - хроматографическая колонка; 2-обессоливавие в "биофибрах", 3 - перистальтиче-
ский насос; 4- раствор агарозы; 5 - нагреватели; 6- трубка для электрофореза; 7-
охлаждающая смесь

Рис. 26. Разделение гистонов сочетанием хроматографии на оксиапатите (на-
правление I) и электрофореза в градиенте концентрации ПААГ (направление
II) в присутствии ДДС-Na [Bloom, Anderson, 1979]
Двумерным электрофорезом часто разделяют и другие ще-
лочные белки. Например, факторы инициации белкового синте-
за из ретикулоцитов образуют много пятен при фракционирова-
нии каждого из них в первом направлении по заряду в кислой
мочевине, а во втором-по размерам ступенчатым электрофо-
резом в системе Лэммли [Floyd et al., 1979].
Двумерный электрофорез белков хроматина описан Бакае-
вым и соавторами (Bakayev et al., 1978]. В первом направлении
хроматин после обработки его микрококковой нуклеазой фрак-
ционировали в 5%-ном ПААГ и буфере низкой ионной силы
(0,01 М ТЭА-НС1, рН 7,6) на олиго-, моно- и субнуклеосомы за
счет заряда входящей в их состав ДНК, как это было описано
выше. Во втором направлении авторы использовали в одном
случае фракционирование белков хроматина по размеру в си-
стеме Лэммли после вымачивания геля первого направления в
1%-ном растворе ДДС-Na. Детергент обеспечивал и диссоциа-
цию белков от ДНК. В другом варианте разделения диссоциа-
цию осуществляли с помощью цетавлона, а электрофорез во
втором направлении вели в кислой мочевине. Во втором вариан-
те хорошо выявлялась группа быстро мигрирующих негистоно-
•вых белков хроматина (HMG-белков). Для анализа этих белков
авторы экстрагировали их 0,35 М раствором Nad, очищали
осаждением ТХУ (2-20%) и разделяли двумерным электрофо-
резом, причем в первом направлении использовали фракциони-
рование по заряду в кислой мочевине, а во втором - разделение
по размерам в 15%-ном ПААГ после обработки ДДС-Na.

81

Двумерный электрофорез субъединиц различных РНК-поли-
мераз в уже цитированной работе д'Алессио и соавторов про-
водили в двух вариантах разделения белков по заряду в первом
направлении. В обоих вариантах использовали ступенчатую си-
стему электрофореза: в одном-с кислым буфером (рН 4,3) для
рабочего геля, в другом-со щелочным (рН 9,4). Во втором на-
правлении в обоих случаях белки фракционировали по их раз-
мерам после обработки ДДС-Na в системе Лэммли [d'Alessio et
al., 1979].
Мы не случайно в качестве примеров двумерного электрофо-
реза рассмотрели только случаи фракционирования щелочных
белков. Для кислых белков все другие варианты двумерного
фракционирования вытеснила уже упоминавшаяся система
О'Фарелла. Щелочные белки до последнего времени плохо раз-
делялись в этой системе, однако недавно была предложена ее
модификация, позволяющая успешно вести разделение и щелоч-
ных белков.
Блум и Андерсон предложили оригинальный метод двумер-
ного разделения белков [Bloom, Anderson, 1979]. Собственно,
электрофорез в нем используется только во втором направле-
нии. Фракционирование белков в первом "направлении" осуще-
ствляется на хроматографической колонке (рис. 25). Элюат с
колонки обессоливают, пропуская его через "биофибры", погру-
женные в 10%-ный раствор ДДС-Na с 1% ?-меркаптоэтанола.
Затем его подогревают до 96° и по каплям смешивают с раство-
ром расплавленной при такой же температуре агарозы. Оба
раствора подают одним двухканальным перистальтическим на-
сосом, и горячая смесь постепенно заполняет погруженную в лед
трубку. Таким образом, в трубке полимеризуется элюат с хро-
матографической колонки, т. е. по длине геля располагаются
белковые зоны в той последовательности, как они выходят из
колонки. Затем гель извлекают из трубки и накладывают на
пластину ПААГ, заливают расплавленной агарозой и ведут
электрофорез в системе Лэммли. В частности, авторы элюирова-
ли гистоны с колонки оксиапатита линейным градиентом кон-
центрации NaCl (0-1,5 М) в 1 мМ Na-фосфатном буфере
(рН 6) с 6 М мочевиной. Гистоны выходили, не разделившись,
а лишь растянувшись по элюату. Во втором направлении ис-
пользовали электрофорез в присутствии ДДС-Na в градиенте
пористости ПААГ (8-25%). На пластине гистоны оказались
прекрасно отделенными друг от друга (рис. 26). В частности,
гистоны Н2А и Н2В далеко отошли от НЗ благодаря значитель-
ному различию в их сродстве к оксиапатиту.
Исходный препарат в такой постановке опыта может быть
и не элюатом с колонки, а реакционной смесью, в которой со
временем происходят изменения белкового состава, например
в результате протеолиза. Маркерные белки с известной молеку-
лярной массой можно прикалывать при заполнении трубки так,
что их положение по ее длине будет заведомо определенным.

82

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ТРИТОНА Х-100 И ЦЕТАВЛОНА
Тритон Х-100
Многие белки, например: рибосомальные и мембранные, пло-
хо растворимы в водных буферах. Добавление Тритона Х-100 за-
частую улучшает их растворимость и, .к тому же, в отличие от
мочевины, не влечет за собой их денатурации. Сохраняются
вторичная и третичная структура белков, а в ряде случаев и их
биологическая активность.
Авторы одной из работ [Hearing et al., 1976] растворяли бел-
ки до концентрации 1 мг/мл в течение нескольких часов в
1%-ном растворе Тритона Х-100. Затем этот раствор смешивали
с равным объемом 20%-ной сахарозы в верхнем электродном
буфере удвоенной концентрации и в таком виде наносили на
формирующий гель в трубке. Тритон Х-100, связавшись с бел-
ком, может мигрировать вместе с ним, сохраняя растворимость
белка, однако разделение полос оказывается более надежным,
если 0,1% Тритона Х-100 вводят в гель. Правда, при фиксиро-
вании белков ТХУ Тритон Х-100 дает опалесцирующий фон, ко-
торый приходится дольше отмывать.
Образование комплексов с Тритоном Х-100 можно использо-
вать не только для растворения, но и для фракционирования
белков. Характер комплекса и количество связавшегося с бел-
ком детергента зависят от протяженности гидрофобного участ-
ка на поверхности белковой глобулы. Некоторые белки могут
связывать по нескольку десятков молекул Тритона Х-100 на мо-
лекулу (родопсин-до 70). Это дает прирост эффективной мо-
лекулярной массы в тысячи, а иногда и в десятки тысяч дальтон
(молекулярная масса Тритона Х-100 равна 632). Такой прирост
легко обнаружить электрофорезом в мелкопористом геле.
В работе Фернандеса и соавторов [Fernandes et al., 1978] бел-
ки из бактериальной мембраны экстрагировали до концентра-
ции 4 мг/мл 5%-ной уксусной кислотой с 4 М мочевиной и 5%
(?-мсркаптоэтанолом. Иногда уже при экстракции добавляли
Тритон Х-100 до концентрации 2%, что улучшало выход белков
из мембраны, но приводило к появлению дополнительных полос
в верхней части геля при электрофорезе. Весьма существенно
вносить Тритон Х-100 и мочевину в сам гель, причем в опреде-
ленной пропорции. Мочевина препятствует связыванию Тритона
Х-100 с белком, тем самым повышая избирательность этого про-
цесса. Оптимальное соотношение концентраций детергента и
мочевины для данного типа белков подбирают эксперименталь-
но. В цитируемой работе использовали пластину 12%-ного
ПААГ (С = 0,8), полимеризованного в 5%-ном растворе уксус-
ной кислоты с 8 М мочевиной и 12 мМ (0,75%) Тритоном Х-100.
Следует иметь в виду, что детергент ухудшает сцепление ПААГ
со стеклом. Этим, по-видимому, и было обусловлено понижен-

83

ное против обычного содержание метиленбисакриламида. Иног-
да, во избежание выскальзывания мелкопористого геля, содер-
жащего Тритон Х-100, из трубки или пластины под ним прихо-
дится предварительно заполимеризовать "пробку" обычного
ПААГ. Тритон Х-100 усиливает опасность окисления белков за
счет остаточных свободных радикалов, поэтому особое внима-
ние следует уделить преэлектрофорезу. Авторы работы вели его
сначала в течение 3-4 ч при напряжении 240 В до постоянства
силы тока, подключив анод к нижнему электроду. Затем в элек-
тродные резервуары заливали свежую 5%-ную уксусную кисло-
ту, а в карманы пластины вносили 0,2 М цистамина и до 2 мг/мл
протамина, растворенных в 5%-ной уксусной кислоте с 8 М мо-
чевиной. Возобновляли преэлектрофорез еще на 45 мин, поме-
няв полярность напряжения, подаваемого на гель. Только после
этого вносили белковые препараты и вели электрофорез при по-
стоянном напряжении 100 В в течение суток при той же поляр-
ности напряжения (белки мигрируют к катоду).
В рассматриваемой работе удалось наблюдать значитель-
ные различия белкового состава мембран разных штаммов Е. со-
li и даже мутантов одного штамма. Было использовано и дву-
мерное разделение. Полоски геля после электрофореза в при-
сутствии Тритона Х-100 и мочевины вымачивали по 5 мин сна-
чала в 1,5 М Трис-НСl (рН 8,8) с 1% ДДС-Na, потом в 0,5 М
Трис-НСl (рН 6,8) с 1% ДДС-Na и, наконец, в воде. После это-
го их переносили на вторую пластину для ступенчатого электро-
фореза в комплексе с ДДС-Na. Такой двумерный электрофорез
позволяет разделять белки, не поддающиеся разделению одним
только электрофорезом в присутствии Тритона Х-100 и мочеви-
ны или ступенчатым электрофорезом по Лэммли.
Электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ, полимеризованном в
5%-ной уксусной кислоте с 0,5% Тритона Х-100 и 6 М мочеви-
ной, удается также хорошо разделять разные формы а- и {?-це-
пей глобина [Rovera et al., 1978]. Предварительную денатура-
цию белков в этом случае проводили в присутствии 5% (?-мер-
каптоэтанола, так как окисление может существенно изменять
гидрофобные свойства белка.
Аналогичное фракционирование гистонов проводили в геле,
полимеризованном в 0,9 М уксусной кислоте с 0,38% Тритона
Х-100 и 8 М мочевиной [Newrock et al., 1978]. Здесь также пре-
электрофорез вели сначала с цистамином, затем с протамином.
В более поздней работе [Levy et al., 1979] для разделения гисто-
нов использовали другую пропорцию тех же компонентов буфе-
ра геля: 7%-ная уксусная кислота+0,22% Тритона Х-100 + 4 М
мочевины.
Электрофорез в кислой мочевине с добавкой Тритона Х-100
использовали и для очистки гистонов от примеси рибосомаль-
ных белков. Тритон Х-100 плохо связывается с последними, по-
этому при электрофорезе в первом направлении благодаря ком-
плексу с Тритоном Х-100 гистоны удается отделить от рибосо-

84

мальных белков с близкими молекулярными массами. Гистоны
мигрируют вместе с относительно более крупными белками ри-
босом. Во втором направлении электрофорез в пластине 1'5%-
ного ПААГ в присутствии 0,1% ДДС-Na позволяет выявить раз-
личие истинных молекулярных масс этих двух типов белков.
ДДС-Na вытесняет Тритон Х-100 из комплекса с белком, и от-
носительно более низкомолекулярные гистоны уходят вперед,.
отделяясь от рибосомальных белков [Savic, Poccia, 1978].
Вообще, двумерный электрофорез гистонов, включающий
комплексообразование с Тритоном Х-100 в одном из направле-
ний, использовался довольно -часто [Hamana, Iwai, 1976; Gar-
nird, 1976; Franklin, Zweidler, 1977; Blankstein et al., 1977].
В последние годы описано применение в тех же целях других,
сходных с Тритоном Х-100 неионных детергентов. Так, после
обычного электрофореза в кислой мочевине для второго направ-
ления был использован 15%-ный ПААГ, полимеризованный в
0,8 М уксусной кислоте, содержащей 0,4% Lubrol WX (фирмы
"Sigma") и 6 М мочевину [Bhatnagar, Bellve, 1978]. Гистон Н2А
печени и других органов мыши при этом удалось разделить на
два компонента, гистон НЗ-на три или четыре; в ряде случа-
ев расщеплялся и гистон HI. В другой работе [Allis et al., 1979]
был использован Тритон DF-16. В 12%-ном ПААГ, полимеризо-
ванном в 5%-ной уксусной кислоте с 0,4% Тритона DF-16 и 6 М
мочевиной, гистоны мигрируют в следующем порядке: Н4, Н1+
+Н2В, НЗ и Н2А. Электрофорез по размерам во втором направ-
лении (система Лэммли) разделяет их очень хорошо.
Цетавлон
Цетилтриметиламмонийбромид (цетавлон) - положительно
заряженный ионный детергент. Как известно, ДДС-Na раство-
ряет не все щелочные белки, зато хорошо растворяет нуклеино-
вые кислоты, которые могут создавать помехи при электрофоре-
зе белков, входящих в состав нуклеопротеидов. Паним и соавто-
ры предложили заменить ДДС-Na на цетавлон [Panyim et al.,
1977]. Как и ДДС-Na, цетавлон способствует растворению бел-
ков за счет связывания с гидрофобными участками полипепти-
дов. Благодаря электростатическому отталкиванию положитель-
но заряженных аммониевых групп цетавлона белковые цепи рас-
прямляются и приобретают жесткость. Комплекс белка с цетав-
лоном, особенно в кислой среде, заряжен заведомо положитель-
но. Вместе с тем цетавлон взаимодействует с нуклеиновыми
кислотами как "жирный катион" и осаждает их из, раствора.
Использование цетавлона имеет и свои трудности. При взаи-
модействии с персульфатом аммония он довольно легко выпадает
в осадок, поэтому полимеризацию геля приходится вести при
слегка повышенной температуре (37°), в термостате. Кроме то-
го, цетавлон осаждает красители типа СВВ R-250, поэтому окра-
шивание геля ведут при температуре 80-100°.

85

Паним и соавторы для разделения смеси стандартных белков использова-
ли 10%-ный ПААГ (С=1,5), полимеризованный в 0,09 М Na-ацетатном буфе-
ре (рН 4,6) с 0,09% цетавлона. Примерно таким же буфером заполняли элек-
тродные резервуары. Исходный препарат готовили, растворяя белки до кон-
центрации 0,25-0,5 мг/мл в 0,0.1 М Na-ацетатном буфере (рН 4,6) с 0,5%
цетавлона и 1% р-меркаптоэтанола. Назначение последнего - такое же, как
при обработке белков ДДС-Na. Белковый раствор кипятили 5 мин или инку-
бировали 2 ч при 37°, а затем добавляли мочевину до концентрации 6 М. На
трубку (10x0,6 см) вносили 20 мкл раствора препарата (5-10 мкг белка).
Электрофорез вели при силе тока 8-10 мА на гель и напряженности поля
8-10 В/см. В качестве лидирующего красителя использовали 0,05%-ный рас-
твор Azure А. Белки окрашивали 0,25%-ным раствором СВВ R-250 в 10%-ной
уксусной кислоте, содержащей 45% метанола, в течение 30-60 мин при тем-
пературе 80-100°. Отмывали излишек красителя в 0,9 М уксусной кислоте
при той же температуре.
Как и при электрофорезе с ДДС-Na, в случае обработки це-
тавлоном также наблюдается линейная зависимость между ло-
гарифмом молекулярной массы белка и расстоянием его мигра-
ции в геле. Пользуясь этой зависимостью, удается оценивать
молекулярные массы белков в интервале 15-90 тыс. дальтон.
Эли и соавторы недавно предложили модификацию описан-
ной выше системы [Ely et al., 1979J. Они заменили персульфат
аммония на флавинмононуклеотид (ФМН) в качестве инициа-
тора полимеризации, которая идет при освещении (ФМН рас-
творим лучше, чем рибофлавин). Это снимает проблему осаж-
дения цетавлона при полимеризации геля.
В качестве рабочего буфера геля использовали U,l М Na-фосфат (рН'7)
с 0,l% цетавлона. Белковый препарат перед электрофорезом денатурировали
в течение 1 мин на кипящей водяной бане в том же буфере, но содержащем
0,5% цетавлона и 10-15% р-меркаптоэтанола. Лидирующий краситель-
малахитовый зеленый. Электрофорез в 10%-ном ПААГ при силе тока 8 мА на
трубку (10x0,6 см) занимал около 5 ч. Белки фиксировали в кипящей 10%-
ной ТХУ, затем окрашивали при комнатной температуре 0,5%-ным раствором
СВВ R-250 в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 4'5% этанола, в течение
10ч.
Обработку цетавлоном удобно использовать для диссоциа-
ции белков от ДНК в хроматине с одновременным осаждением
ДНК и последующим электрофорезом комплексов белков с це-
тавлоном. При низких значениях рН связывание цетавлона с ги-
стонами и негистоновыми белками хроматина носит избиратель-
ный характер, что способствует их электрофоретическому раз-
делению.
Фракционирование белков по степени их гидрофобности мож-
но преобразовать в разделение по заряду с помощью следующе-
го приема [Helenius, Simons, 1977]. Для исключения роли раз-
меров белков электрофорез ведут в 1%-ной агарозе, растворен-
ной в 0,05 М глициновом буфере с 0,1 М NaCI и 0,5% Тритона

86


Рис. 27. Обнаружение гидрофобных белков двумерным электрофорезом "со
сдвигом заряда" [Bhakdi et al., 1977]
А - без дополнительных детергентов; Б - с добавлением ДОХ; В-с добавлением це-
тавлона
Х-100 с добавлением в него либо цетавлона до 0,5%, либо дез-
оксихолата натрия (ДОХ) до 0,25%. Тритон Х-100 образует
мицеллы, которые связываются с гидрофобными участками бел-
ка в количестве, пропорциональному размеру этих участков.
Цетавлон или ДОХ объединяются с Тритоном Х-100 в смешан-
ные мицеллы, привнося тем самым в комплекс с белком соответ-
ственно положительный или отрицательный заряд, существенно
превышающий собственный заряд белка. При электрофорезе
белки мигрируют со скоростью, обусловленной знаком и вели-
чиной привнесенного заряда. Такой прием можно назвать "элек-
трофорезом со сдвигом заряда". Необычное введение в буфер
геля 0,1 М NaCl по-видимому, способствует как растворимости
белков, так и образованию, мицелл. Напряженность поля при
этом приходится снижать до 4,5 В/см.
Аналогичный подход был использован для обнаружения гид-
рофобных белков в двумерном варианте электрофореза [Bhakdi
et al., 1977]. Разделение белков в первом направлении (I) вели
в 1%-ной агарозе с 0,5% Тритона Х-100. Вырезали полоску, пе-
реносили ее в форму, куда заливали такой же раствор агарозы,
но с добавлением цетавлона или ДОХ. После электрофореза во
втором направлении (II) все гидрофильные белки ложились на
диагонально расположенную прямую, а гидрофобные выпадали
из нее (рис. 27).
Комбинация электрофореза в кислой мочевине с Тритоном
Х-100 в первом направлении и такой же системы, но с цетавло-
ном вместо Тритона, во втором позволила Боннеру и соавторам
выявить значительное число дополнительных фракций при раз-
делении гистонов двумерным электрофорезом. В обоих направ-
лениях использовалась система ступенчатого электрофореза
(3,3%-ный ПААГ-формирующий, 15 %-ный- рабочий). По-
лимеризацию вели с рибофлавином. После электрофореза в пер-
вом направлении белки фиксировали и окрашивали СВВ. При
этом отпадала необходимость вести электрофорез во втором на-

87

правлении немедленно по окончании первого разделения И обе-
спечивалась возможность оценить качество последнего. Цетав-
лон, который вносили в верхний электродный буфер (0,15%),
мигрируя под действием поля через полоску препарата, снова
растворял белки и освобождал их от красителя. Во избежание
образования дисульфидных мостиков в раствор красителя для
геля первого направления добавляли до 0,1% цистамина. Для
предупреждения фотоокисления гистонов гели держали вдали
от яркого света [Bonner et al., 1980].
В заключение отметим, что при электрофорезе мембранных
липопротеидов главная проблема связана с их растворением.
Даже в 1%-ном ДДС-Na при 100° не удается добиться надеж-
ного растворения. Между тем липопротеиды хорошо растворя-
ются в смеси 6 г глицина и 10 мл 98%-ной муравьиной кислоты.
Электрофорез можно вести в 13 М НСООН (50%). Для этого
полимеризуют гель в воде, потом его вынимают, вымачивают в
13 М НСООН и с каплей глицерина вставляют в трубку, диа-
метр которой на 0,1-0,2 мм больше, чем у той, которая исполь-
зовалась при полимеризации. В ней и ведут электрофорез [Mok-
rasch, 1978]. В другом варианте электрофореза водонераствори-
мых белков в качестве рабочего буфера геля использовали смесь
фенола, этиленгликоля и воды в соотношении 3:2:3 (масса/объ-
ем/объем). Мономерный акриламид реагирует с фенолом, по-
этому полимеризацию ПААГ в пластинах проводили опять-таки
в водной среде, которую затем путем вымачивания геля заменя-
ли описанной выше смесью [Pusztai, Watt, 1973].
ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ В ПААГ
Обнаружение и локализацию белковых зон после их разде-
ления электрофорезом в ПААГ в большинстве случаев осуще-
ствляют путем их прокраски в геле. Зоны проявляются как ок-
рашенные полоски или пятна различной интенсивности, в
зависимости от содержания в них белка. Для окраски гель вы-
мачивают в растворе красителя, который диффундирует внутрь
него и прочно связывается с белками. Процесс диффузии, как
правило, занимает несколько часов. Во избежание размывания
полос за это время белки иногда предварительно фиксируют
осаждением. Для этого гель сначала вымачивают в 10%- или
50%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Чаще фиксацию сов-
мещают с окрашиванием, используя раствор красителя в .смеси
уксусной кислоты и метанола или в ТХУ.
Одновременно с белками окрашенным оказывается и сам
гель. Это происходит как за счет простого замещения буфера ге-
ля на раствор красителя, так и в результате некоторой сорбции
его на геле. Однако связывание красителя с гелем значительно
менее прочно, чем с белками, поэтому от "фона" удается без
особого труда избавиться "отмывкой" геля, например вымачи-
ванием его в относительно большом объеме растворителя с не-

88

сколькими сменами. Если отмывка идет только за счет диффу-
зии красителя из геля, она занимает несколько часов, обычно ее
ведут в течение ночи. Во избежание растворения осажденных
белков краситель отмывают тоже уксусной кислотой, часто .в
смеси с метанолом, который улучшает растворимость красите-
ля. Отмывка ускоряется при повышенной температуре (37-
50°) и перемешивании растворителя, однако при этом есть опас-
ность ослабления окраски полос.
Все типы обычно используемых красителей для белков несут
на себе электрический заряд того или иного знака, поэтому от-

Рис. 28. Устройство для электрофоретической отмывки гелей [Shortess, 1974]
мывку геля можно еще ускорить, если в растворителе суспенди-
ровать немного ионообменной смолы, связывающей краситель
и тем самым сдвигающей равновесие диффузии. Часто исполь-
зуют для этой цели смолу смешанного типа AG 501х8.
Наконец, процесс отмывки можно сократить до десятков ми-
нут, если воспользоваться электрофорезом. Электрическое поле
накладывают на гель в поперечном направлении - перпенди-
кулярно оси трубки или поверхности пластины. Не связанные с
белками молекулы красителя благодаря своему заряду быстро
выходят из геля. Разумеется, для этой цели нужно иметь специ-
альный, хотя и очень простой, прибор для поперечного электро-
фореза. Такие приборы ("дестейнеры") имеются в продаже, но
их легко изготовить и в лаборатории.
Простое устройство для этой цели описано и схематически
изображено на рис. 28 [Shortess, 1974]. На пластинку из нержа-
веющей стали с отогнутым концом кладут кусок поролона, смо-
ченного 10%-ным раствором уксусной кислоты. Его помещают в
ванночку и заливают таким же раствором до уровня чуть ниже
верхней поверхности поролона. Ряд трубок или пластину геля
кладут на поролон, накрывают фильтровальной бумагой, смочен-
ной уксусной кислотой, и прижимают перфорированной алюми-
ниевой пластинкой или сеткой, также с отогнутым концом.
К отогнутым концам обеих пластинок присоединяют провода от
источника тока; стальная пластинка служит анодом. Перфора-
ции в катодной пластинке нужны для выхода пузырей газа. Че-
рез пластину геля размером 12х7х0,3 см нужно пропускать
ток силой 0,6 А. Отмывка занимает 15-20 мин. Находящиеся в

89

осадке белки и прочно связанный с ними краситель при непро-
должительном поперечном электрофорезе остаются на своих ме-
стах в геле.
До сих пор речь шла о неспецифической окраске белков. Если
в ходе электрофореза ферменты не утрачивают своей биологи-
ческой активности, то их локализацию в геле можно осуществить
с помощью специфической ферментативной реакции или цепи
реакций, дающих окрашенные продукты. В этом случае гель вы-
мачивают в растворе соответствующих субстратов. Разумеется,
фиксировать белки осаждением в этом случае нельзя и прихо-
дится мириться с некоторым размыванием белковых полос.
Впрочем, низкомолекулярные субстраты зачастую диффунди-
руют в гель быстрее, чем довольно крупные молекулы красите-
лей, и продолжительность вымачивания бывает можно сократить.
Иногда возникает необходимость вести наблюдение за миг-
рацией белковых зон в ходе электрофореза. Для этого исходную
смесь белков можно окрасить красителем "Remazol" [Griffith,
1972], который ковалентно связывается с белком и мигрирует
вместе с ним. Реакцию между белком и красителем проводят в
присутствии ДДС-Na, в щелочной среде. Например, к 2 мг бел-
ка, растворенного в 0,2 мл 0,15 М NaCI с 0,2 М NazHPt^ и 10%
ДДС-Na, добавляют краситель до концентрации 0,16% и прогре-
вают при 56° в течение 20 мин. Для очистки от свободного кра-
сителя белок переосаждают ацетоном.
Чувствительность окрашивания белков многократно увеличи-
вается при использовании перечисленных ниже флюоресцентных
красителей. Многие из них связываются с белками или пептида-
ми, в основном по концевым аминогруппам. Их также можно
использовать для наблюдения за ходом электрофореза после
предварительной обработки исходного препарата.
Рассмотрим теперь подробнее наиболее распространенные
марки красителей и особенности их применения.
Кислые красители
Исторически для окраски белков в геле были прежде всего
использованы давно апробированные промышленные красители
для шерсти - сложные молекулы с несколькими ароматически-
ми кольцами и заряженными группами. Механизм их взаимодей-
ствия с белками еще далеко не ясен. По-видимому, первоначаль-
ное связывание идет за счет кулоновского взаимодействия суль-
фогрупп красителей с положительно заряженными аминокислот-
ными остатками в белке. Затем оно, вероятно, закрепляется
ван-дер-ваальсовскими, водородными, а возможно, и гидрофоб-
ными связями.
Как уже упоминалось, для фиксации белковых полос окра-
шивание ведут в кислой среде. Какой бы буфер ни использовал-
ся при электрофорезе, к моменту окрашивания он замещается
на довольно крепкий раствор (10% и более) уксусной кислоты

90

или ТХУ, поэтому преимущественный заряд любого белка оказы-
вается положительным за счет остатков лизина, аргинина и ги-
стидина, так что для белков используются преимущественно кис-
лые красители, несущие остатки сульфокислоты. Они сохраняют
свой отрицательный заряд и при низких значениях рН.
В прошлом десятилетии широко использовали "амидо-
шварц"-краситель с фирменным названием "Amido Black 10B"
(сейчас его выпускают под названием "Naphthalene Black 12B").
Его растворяли до концентрации 1% в 7%-ном растворе уксус-
ной кислоты. В настоящее время его вытеснил другой краси-
тель-кумасси ярко-голубой ("Coomassie brilliant blue", сокра-
щенно СВВ). Этот краситель дает лучшую чувствитель-
ность и линейную зависимость интенсивности окраски от концент-
рации белка в более широком ее диапазоне. Краситель выпус-
кают в двух модификациях: R-250 и G-250. Здесь для ориенти-
ровки приведена структурная формула второго из них. Структура
СВВ R-250 отличается только отсутствием двух метальных групп.
Фирма BDH сейчас выпускает эти красители под названиями
"PAGE blue 83" и "PAGE blue G-90" соответственно.

Кумасси G-250
Обилие ароматических колец в структуре красителей типа
СВВ делает их плохо растворимыми не только в воде, но и в раз-
бавленной уксусной кислоте. Для улучшения растворимости к
кислоте часто добавляют метанол. Обычно используют водные
растворы, содержащие 9-10% уксусной кислоты и 40-45% ме-
танола (по объему), однако рабочая концентрация СВВ R-250 в
этой смеси составляет 0,1-0,25%, реже 0,5%. Иногда СВВ R-250
растворяют в 25%-, 50%-ной ТХУ или в смеси, содержащей
10% ТХУ и 25% изопропанола (остальное-вода). Возможны
и другие варианты, не меняющие существа дела: краситель дол-
жен полностью раствориться в кислом растворителе, осаждаю-
щем белок. Не растворившиеся примеси следует отфильтровать.
Их наличие не. говорит о плохом выборе растворителя, так как

91

Препараты красителя, изготавливаемые для промышленных це-
лей, редко бывают чистыми.
Продолжительность окрашивания зависит от толщины и по-
ристости геля и может варьировать от 2-3 до 12 ч. Для ускоре-
ния процесса можно окрашивать гель при 37°, а ванночку с рас-
створом красителя покачивать. Отмывку от не связавшегося с
белком красителя ведут, как описано выше, например вымачи-
вая гель в 7%-ной уксусной кислоте или в смеси, содержащей
7,5% уксусной кислоты и 5% метанола. В этих условиях раство-
римость красителя достаточна для вымывания его свободных
молекул, а десорбция его с белка незначительна. Если электро-
форез вели в присутствии высокой концентрации мочевины, то лучше отмывать смесью, содержащей 7,5% уксусной кислоты и
20% метанола.
Гель из трубки отмывают в пробирке, пластину геля- в ван-
ночке. При окрашивании соотношение объемов жидкости и геля
должно составлять примерно 3:1, при отмывке - 5:1 или даже
10: 1 с двумя-тремя сменами растворителя. Если в растворитель
добавлена ионообменная смола, то его менять не нужно. Отмыв- ку можно вести поперечным электрофорезом, как подробно опи-
сано выше.
Окрашенный гель из трубки можно сканировать в специаль-
ном приборе или с помощью приставки, которой комплектуются
сейчас многие продажные спектрофотометры. Не следует, впро-
чем, слишком полагаться на соотношение размеров пиков такой
электрофореграммы при оценке количественного соотношения
белков в полосах, так как связывание красителя зависит не толь-
ко от концентрации, но и от химического состава и конформации
белка.
Если электрофорез проводили в кварцевых трубках, то гели
можно сканировать, не извлекая их из трубок, по ультрафиоле-
товому поглощению белков (или нуклеиновых кислот, что значи-
тельно легче).
В этом случае необходимо тщательно очищать или перекри-
сталлизовывать акриламид для уменьшения его собственного
поглощения в ультрафиолетовой области спектра.
Другая возможность количественной регистрации электрофо-
реграммы заключается в денситометрировании его фотографии.
В этом случае ошибка в оценке истинного соотношения коли-
честв белка в полосах может еще усугубиться за счет нелиней-
ности чувствительности фотопленки и других особенностей фото-
графического процесса.
Наиболее надежным способом количественных измерений яв-
ляется счет радиоактивности в белковых полосах при условии
однородности радиоактивной метки по всем компонентам смеси и обеспечения полноты выхода счета, о чем будет подробнее ска-
зано ниже.
После окрашивания СВВ R-250 можно качественно, но впол-
не надежно обнаружить полосу, содержащую 10 мкг белка. На

92

порядок более высокую чувствительность окраски можно полу-
чить с помощью красителя СВВ G-250. Для этого используют
относительно плохую его растворимость в хлорной кислоте. Го-
товят 0,04%-ный коллоидный раствор красителя в 3,5%-ном вод-
ном растворе НС104, фильтрованием освобождаются от крупных,
не растворившихся частиц. В полученном коричневом растворе
вымачивают гель в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
Сорбция на белке сдвигает равновесие в сторону диссоциации
коллоидных частиц; краситель связывается с белком и окраши-
вает его в синий цвет (коричневая окраска была обусловлена
наличием коллоидных частиц). На геле при этом краситель не
сорбируется. Синеватые полосы белка проступают на бледно-ко-
ричневом фоне геля уже через 30 мин. По истечении 1,5 ч гель
переносят в 5%-ный раствор уксусной кислоты. Интенсивность
окраски полос при этом увеличивается, а фон становится проз-
рачным и светло-голубым - часто его можно не отмывать [Hoi-
brook, Leaver, 1976]. Описан и другой вариант использования
СВВ G-250: его растворяют сначала в 1 н. H2S04, а затем в
12%-ной ТХУ [Blakesley, Boezi, 1977].
Для окрашивания гистонов после электрофореза иногда
используют краситель "Fast green FCF" [McMaster-Kaye, Kaye,
1974]. Его можно использовать и для других белков. Он менее
чувствителен, чем СВВ, но более надежен для количественных
оценок содержания белка в полосах путем денситометрирования,
так как при отмывке геля СВВ в большей степени, чем "Fast
green", вымывается из белковых полос, причем иной раз неоди-
наково для различных белков [Bertolini et al., 1976].
Следует отметить, что в случае плотных белковых полос при
недостаточной продолжительности окрашивания можно столк-
нуться с артефактом - возникновением "двойной полосы". На
самом же деле это одна полоса, интенсивно окрашенная с двух
своих торцевых поверхностей.
Во всех описанных способах белки перед окрашиванием или
в его процессе фиксируют осаждением кислотой и спиртом.
Однако некоторые основные белки (например, рибонуклеаза и
протамин), а также низкомолекулярные пептиды и гормоны при
такой обработке не осаждаются, а, наоборот, растворяются и
вымываются из геля. Недавно был предложен принципиально
иной подход к фиксации белков и пептидов в геле после электро-
фореза. Гель в течение 1 ч вымачивают в 5%-ном растворе фор-
мальдегида в 25%-ном этаноле с добавлением СВВ R-250 до
0,11%. В этих условиях формальдегид ковалентно сшивает пеп-
тиды с матрицей геля за счет образования метиленовых мости-
ков между аминогруппами аминокислот и первичными аминами
ПААГ. На приведенных в работе фотографиях можно видеть ра-
зительный эффект обнаружения щелочных и низкомолекулярных
белков: гели, кажущиеся пустыми при обычном окрашивании, на
самом деле содержат множество белковых полос. Гели с ДДС-Na
красят более продолжительное время (до 3 ч) в 3,5%-ном рас-

93

творе формальдегида, что обеспечивает вытеснение ДДС-Na
красителем. Отмывку гелей ведут в течение ночи в 3,5%-ном рас-
творе формальдегида в 25%-ном этаноле [Steck et al., 1980].
Другие красители и методы окрашивания
Определенные затруднения возникают при окраске кислых
фосфопротеидов, например фосфитина. Наличие отрицательно
заряженных остатков фосфорной кислоты мешает окрашиванию
анионными красителями. Конечно, можно использовать такие
положительно заряженные (катионные) красители, как толуи-
диновый синий или акридиновый оранжевый (см. ниже), но они
дают высокий уровень фона, так как матрица ПААГ всегда не-
сет на себе некоторое количество отрицательно заряженных ос-
татков акриловой кислоты.
Есть возможность пойти другим путем. Известна высокая
степень сродства фосфопротеидов к трехвалентным металлам,
поэтому можно использовать ионы А13+ для блокирования заря-
дов фосфатов. Это позволит успешно вести окрашивание белков
кислым красителем. Так, для фосфопротеидов была рекомендо-
вана следующая смесь: 0,05% СВВ R-250+0,1 M A1(NO3)3+10%
уксусной кислоты + 25% изопропанола + 1% Тритона Х-100. От-
мывают гель, как обычно, в 7%-ной уксусной кислоте [Hege-.
nauer et al., 1977].
Гликопротеиды, белки, липиды и даже нуклеиновые кислоты
можно окрасить одновременно красителем с выразительным
фирменным названием "Stains-all", формула которого представ-
лена ниже.

0,1%-ный маточный раствор этого красителя в формамиде
можно хранить при 4° в темной бутыли в течение месяца. Его ра-
бочая концентрация-0,0012% в 0,01 М Трис-НСl (рН 8,5) с
5% формамида и 25% изопропанола. Окрашивать гель следует
в темноте, в течение ночи. Можно затем отмывать гель в воде, но
делать это не обязательно, так как на свету находящийся в геле
свободный краситель быстро выцветает, в то время как связан-
ный с белком оказывается значительно более стойким. Замеча-
тельно, что разные по своей природе биополимеры окрашивают-
ся при этом в различные цвета: гликопротеиды-в синий, бел-
ки - в красный, липиды - в желто-оранжевый, ДНК - в синий,
а РНК - в голубовато-пурпурный. Однако по чувствительности
этот универсальный краситель заметно уступает специализиро-
ванным. Кроме того, он обесцвечивается при контакте с ДДС-Na,

94

который из-за этого приходится отмывать после электрофореза,
вымачивая гель в течение 18-36 ч в 25%-ном растворе изопро-
панола [King, Morrison, 1976].
Если примириться с некоторой диффузией полос во время ок-
рашивания и не осаждать белки, то их можно красить в водных
буферах кислыми или щелочными красителями (в зависимости
от заряда белка). Связь между красителем и белком в этих слу-
чаях осуществляется в основном за счет сил кулоновского взаи-
модействия. В области нейтральных рН такие кислые красители,
как СВВ, бромфеноловый синий и "Fast green", заряжены отри-
цательно. Их изоэлектрическая точка лежит ниже рН 3,5. Ще-
лочные красители (метиленовый синий, толуидиновый синий и
пиронин) в нейтральных буферах несут положительный заряд
(рI>9,5). Таким образом, кислые белки в мягких условиях мож-
но красить щелочными красителями, а щелочные-кислыми.
Красители растворяют в воде до концентрации 0,02% и нейтра-
лизуют раствор добавлением 0,2 М фосфатного буфера (рН 7)
до концентрации 5 мМ. Гель после электрофореза для удаления
избытка рабочего буфера вымачивают в воде в течение 5 мин,
затем окрашивают 10 мин при комнатной температуре. Отмыть
фон можно в течение часа в деионизованной воде или смеси ме-
танол-вода (1 : 2), что стабилизирует окраску. Окрашенные ге-
ли хранят в разбавленных водных растворах красителей во избе-
жание их десорбции. В воду добавляют в качестве антисептика
азид натрия до концентрации 0,01% [Ruchel et al., 1978].
Недавно был предложен принципиально новый способ окрас-
ки белков после электрофореза в ПААГ, обеспечивающий, по
утверждению авторов, на два порядка более высокую чувстви-
тельность, чем СВВ R-250 [Merril et al., 1979]. Белки окраши-
вают ионами серебра в присутствии небольшой добавки ионов
меди. Эти ионы вносят в составе нитратов серебра и меди, рас-
творенных в воде с добавлением пиридина и этанола. Гель пред-
варительно обрабатывают формальдегидом. После первой обра-
ботки этими ионами гель еще раз споласкивают довольно кон-
центрированным (11%) щелочным раствором нитрата серебра и,
наконец, восстанавливают серебро обработкой смесью формаль-
дегида и лимонной кислоты в 10%-ном этаноле. Механизм окра-
шивания неясен. По-видимому, он сходен с восстановлением се-
ребра в фотографическом процессе, так как "передержанный"
гель можно ослабить обычным ослабителем для фотографии.
Несмотря на свою огромную чувствительность, предложен-
ный способ достаточно сложен и связан с расходом дорогостоя-
щего нитрата серебра, поэтому в середине 1980 г. другая группа
авторов опубликовала упрощенную методику высокочувстви-
тельной окраски белков серебром, дающую, по-видимому, такие
же результаты [Oakley et al., 1980]. Ввиду перспективности это-
го метода цитируем его подробно.

95

Все растворы готовят на бидистилляте, а работу ведут в перчатках. При-
веденный ниже режим обработки соответствует пластинам размером 140x
x140x0.8 мм; для более толстых гелей продолжительность обработки на
каждом этапе надо увеличить. При всех процедурах, кроме одной, используют
осторожное перемешивание растворов на ротационной мешалке ("New Bruns-
wick gyrotory shaker", модель 2) со скоростью 40 об/мин. Ниже описаны со-
ответствующие процедуры.
Гель вымачивают в течение 30 мин в 10%-ном водном растворе глутаро-
вого альдегида, споласкивают в течение 10 мин в 0,5-1 л воды с двумя сме-
нами и оставляют для набухания в воде не менее чем на 2 ч. Затем воду сли-
вают и заливают гель свежеприготовленным раствором аммиачного серебра.
Для получения 100 мл этого раствора добавляют 1,4 мл свежего концентри-
рованного раствора аммиака к 21 мл 0,36%-ного раствора NaOH, а затем с
энергичным перемешиванием медленно прибавляют 4 мл 19,4%-ного раствора
азотнокислого серебра (20 г AgNO3+100 мл воды). При этом может времен-
но образоваться коричневый осадок. После его растворения добавляют воду
до объема 100 мл. Для создания хорошей, ровной окраски и во избежание
прилипания геля ко дну надо, чтобы он свободно плавал в ванночке размером
20Х20 см со 150 мл раствора аммиачного серебра. Скорость перемешивания
в это время следует увеличить до 75 об/мии. Окрашивание должно длиться не
более 15 мин, чтобы серебро не успело осесть на поверхности геля. Так как
раствор аммиачного серебра при высыхании может взрываться, после его ис-
пользования серебро осаждают в виде AgCl подкислением НС1. Гель вынима-
ют из раствора и промывают водой в течение 2 мин. Чтобы он не прилип к
кювете, здесь и на следующем этапе следует не сливать жидкость, а перено-
сить его из кюветы в кювету. Затем гель переносят в свежеприготовленный
раствор, содержащий 0,005% лимонной кислоты и 0,019% формальдегида.
(разбавлен из продажного 3'8%-ного формальдегида в 10%-ном метаноле); при этом и проступают полосы белков. Гель вынимают, когда фон только на-
чинает темнеть, и промывают водой в течение часа с тремя сменами при пере-
мешивании. Если концентрация ПААГ превышает 10%, то фон может ока-
заться темным. Он уменьшается в случае предварительной фиксации белков в
10%-ной уксусной кислоте с 50% метанола в течение 30 мин и последующей
промывки геля в 7%-ной уксусной кислоте с 5% метанола в течение ночи.
Минимальная концентрация белка в полосе, которую можно
обнаружить, составляет примерно 10-4 мкг/мм2. По приведенным
в работе фотографиям создается впечатление, что чувствитель-
ность метода столь же высока, как и первоначальной методики
Меррила и соавторов, но четкость линий немного хуже. В этом
случае также возможно ослабление с помощью фотоослабите-
лей.
Хотя в рассмотренной работе об этом и не говорится, Меррил
и соавторы указывают, что после окрашивания серебром гели
становятся хрупкими. Для высушивания их рекомендуется пред-
варительно подвергнуть следующей обработке: вымочить в тече-
ние 15 мин в 30%-ном водном растворе тиосульфата натрия, про-
мыть 4 раза по 15 мин в воде и, наконец, вымочить в смеси ме-
танол - вода - глицерин (70 : 27 : 3) в течение 5 мин.

96

В начале 1981 г. Меррил и соавторы предложили еще одну
методику окрашивания белков в геле серебром. В отличие от их
первого метода, где был использован гистологический подход, в
данном случае восстановление серебра происходит фотохимиче-
ским путем.
После двумерного разделения белков в ПААГ по 0'Фарреллу их фиксиру-
ют и одновременно вымывают ДДС-Na сначала раствором, содержащим 12%
СН3СООН и 50% метанола (10 мин), потом дважды по 5 мин-5%-ной
СН3СООН с 10% этанола. Далее для улучшения равномерности окраски гель
вымачивают 5 мин в 0,5%-ном растворе железосинеродистого калия (красной
кровяной соли). После трехкратного ополаскивания в воде гель заливают рас-
твором, содержащим 0,2 г нитрата серебра, 0,2 г нитрата аммония, 0,5 мл
37%-ного формальдегида и 0,06 мг бензотриазола (антивуалирующего сред-
ства для фотографии) в 100 мл воды. Гель в растворе освещают вольфраме-.
вой лампой накаливания мощностью 1500 Вт в течение 20 мин. Затем раствор
сливают и гель, не споласкивая, заливают 200 мл 3%-ного раствора Na2CO3,
содержащего 0,1 мл формальдегида и 0,12 мг бензотриазола. Окраска появ-.
ляется уже через 1 мин. Не прекращая освещения, раствор сменяют 2-3 раза
до достижения желаемой интенсивности окраски белков. Процесс окрашива-
ния прерывают погружением геля на 5 мин в 1%-ный раствор СН3СООН,
а затем промывают его водой.
Чувствительность метода столь же высока, как и у ранее опи-
санных методов окраски серебром, но процедура существенно
проще, дешевле и занимает всего 1 ч [Merril et al., 1981].
Флюоресцентные красители
Данзилхлорид выпускается в виде двух кристаллических
форм: кристаллы красного цвета плавятся при 70°, желтые--
при 73°. Они хорошо растворяются в ацетоне. Максимум их пог-
лощения в растворе лежит в области 330-360 нм, флюоресцен-
ции - 510 нм. Молярная экстинкция E=4,3 · 106.

В щелочной среде, отщепляя ион хлора, данзильный остаток
присоединяется к аминокислотам, пептидам и белкам, главным
образом, по их концевой аминогруппе. При этом его способность
флюоресцировать сохраняется.

97

Данзилирование белков и пептидов позволяет следить эа хо-
дом их миграции при электрофорезе путем освещения гелей
длинноволновым ультрафиолетовым светом, достаточно хорошо
проникающим через пирексовое стекло. Скорость миграции бел-
ков при данзилировании практически не изменяется, поэтому не-
большие примеси данзилированных препаратов можно исполь-
зовать в качестве маркеров при разделении неокрашенных бел-

<<

стр. 3
(всего 4)

СОДЕРЖАНИЕ

>>