<<

стр. 4
(всего 4)

СОДЕРЖАНИЕ

ковых смесей.
Данзилирование не мешает протеолизу белка, что позволяет
проводить пептидный анализ данзилированных белков после их
разделения электрофорезом в ПААГ и элюции из геля. При этом
удается обнаруживать по флюоресценции не только концевые,
но и внутренние пептиды. Дело в том, что Данзилирование, хотя
и намного менее эффективно, чем по концевым аминогруппам,
происходит (в порядке ослабления) по SH- и ОН-группам цис-
теина и тирозина, ?-NН3-группам лизина и по гистидину. Цен-
ным является то обстоятельство, что автолиз неданзилирован-
ных протеаз не создает никаких помех при картировании пепти-
дов.
Недавно описано Данзилирование белков для последующего
разделения ступенчатым электрофорезом в комплексе с ДДС-Na
(в системе Лэммли) [Tijssen, Kurstak, 1979]. Белки растворяют
до концентрации 2 мг/мл в 0,1 М Трис-ацетатном буфере (рН
8,2) с 10% ДДС-Na, добавляют 1/15 объема 10%-ного. раствора
данзилхлорида в ацетоне и, закрыв пробирку парафильмом, ин-
кубируют в течение 15 мин на водяной бане при 50°. Свободный
данзилхлорид нерастворим в водном ацетоне и образует мутно-
желтую суспензию, тем не менее Данзилирование в ней происхо-
дит. Раствор просветляется после добавления 1/15 объема ???мер?
каптоэтанола и дополнительной инкубации в течение 15 мин.
Меркаптоэтанол связывает и растворяет избыток данзилхло-
рида.
Инкубационную смесь можно без дальнейшей очистки под-
вергать электрофорезу. Ярко люминесцирующие побочные про-
дукты данзилирования быстро отделяются от белков и уходят
вперед. В работе описан и препаративный вариант разделения
белков под контролем данзилированных аликвот. При этом ис-
пользуется электрофоретическая элюция белковых полос из ге-
ля. Описан также пептидный анализ разделенных белков элек-
трофорезом в системе Лэммли с градиентом пористости рабоче-
го геля. Несколько ранее препаративный электрофорез белков
под контролем данзилированных аликвот был описан Стефенсом
[Stephens, 1975].
Флюоресцамин (иногда поставляется под фирменным наиме-
нованием "Fluram") - желтовато-белый порошок, хорошо раст-
воримый в ацетоне, диметильсульфоксиде и ацетонитриле. Хра-
нить раствор следует не более двух недель: он неустойчив, осо-
бенно при рН<4 и рН>10. При взаимодействии с первичными
аминами (концевыми аминогруппами, ?-NH2-группами лизина)

98

в водной среде флюоресцамин дает сильно флюоресцирующие
продукты в соответствии с представленной ниже схемой.

Реакция идет успешнее в щелочной среде. Продукт реакции
имеет два максимума поглощения (при 300 и 390 нм) и макси-
мум флюоресценции при 480 нм. Замечательно, что ни сам флюо-
ресцамин, ни продукты его распада в растворе не флюоресци-
руют. При окрашивании белков и пептидов флюоресцамином не
создается флюоресцирующего фона и окрашенный продукт мож-
но не отделять от красителя, что чрезвычайно удобно. При ис-
пользовании флюоресцамина для окраски белков или пептидов
перед электрофорезом следует иметь в виду, что он вносит до-
полнительный отрицательный заряд (за счет образующегося
карбоксила) и этим изменяет электрофоретическую подвижность
окрашенного белка. В случае разделения белков, обработанных
ДДС-Na, этот единичный заряд практической роли не играет.
В недавней работе [Jackowski, Liew, 1980] флюоресцамин использовали
для окраски белков после их двумерного фракционирования влектрофокуси-
ровкой и электрофорезом по методу 0'Фаррела. Белки фиксировали в пласти-
не геля, вымачивая ее в течение ночи в 10%-ной уксусной кислоте с 50% ме-
танола (одновременно вымывались амфолины, которые окрашиваются флюо-
ресцамином). Гель споласкивали в 7%-ной уксусной кислоте, помещали на
1 ч в диметилсульфоксид (ДМСО) и на 2ч - в 0,04 М раствор борной кисло-
ты в ДМСО, титрованный NaOH до рН 10. Затем добавляли равный объем
раствора флюоресцамина (0,5 мг/мл) в ДМСО и встряхивали смесь в течение
8 ч. Белковые пятна проявлялись уже через 2 ч. Их фотографировали при ос-
вещении длинноволновым ультрафиолетовым светом.
Хранить гель в ДМСО следует в темноте: на свету способ-
ность к флюоресценции за 24 ч падает до нуля. Чувствитель-
ность и разрешающая способность окраски флюоресцамином
примерно такие же, как и СВВ R-250, но линейный участок за-
висимости интенсивности окраски (флюоресценции) от количе-
ства белка больше - вплоть до 7 мкг белка на 1 см2 в пятне или полосе. Для окраски СВВ R-250 линейность сохраняется не да-
лее, чем для 3 мг/см2.
Окрашивание белка флюоресцамином перед электрофорезом
было использовано значительно раньше [Eng, Parkers, 1974].
Белок, обработанный ДДС-Na, растворяли до концентрации

99

0,5-1 мг/мл в 0,017 М Na-фосфатном буфере (рН 8,5) с 5%
ДДС-Na. К 100 мкл этого раствора добавляли 5 мкл раствора
флюоресцамина в ацетоне и встряхивали. Затем без дальнейшей
очистки 10 мкл этой смеси вносили в трубку для электрофореза.
Замечено, что ДДС-Na уменьшает эффективность окраски
флюоресцамином. По-видимому, он создает препятствия для
контакта красителя с аминогруппами белка. Аналогично исполь-
зовали флюоресцамин и для окраски пептидов перед электрофо-
резом [Rosemblatt et al., 1975]. В 1976 г. было описано исполь-
зование для окрашивания белков перед электрофорезом родст-
венного флюоресцамину препарата МДФФ (2-метокси-2,2-ди-
фенил-3-фуранона) [Barger et al., 1976]. Как и флюоресцамин,
этот препарат реагирует с первичными аминами, давая сильно
флюоресцирующие продукты, в то время как сам он в растворе
не флюоресцирует. Схема реакции представлена ниже.

В отличие от флюоресцамина МДФФ не привносит с собой
дополнительного заряда. Он хорошо растворим в ацетоне и
абсолютном метаноле. Максимум возбуждения флюоресцирую-
щего продукта - при 390 нм, флюоресценции - при 745 нм.
Реакция идет лучше в щелочной среде (рН 9,5.) Продукт устой-
чив в интервале рН 2-10. Интенсивность флюоресценции-в
2,5 раза выше, чем при окраске флюоресцамином. Она лишь не-
значительно уменьшается в случае предварительной обработки
белка ДДС-Na и ?-меркаптоэтанолом при 100°. Чувствитель-
ность метода очень высока: по утверждению авторов, им удава-
лось обнаруживать до 0,001 мкг белка в полосе. В отличие от
флюоресцамина окраска не ослабевает в течение нескольких ме-
сяцев. Однако есть данные, что с длинными полипептидными
цепями МДФФ реагирует слабее, чем флюоресцамин. Окраши-
вание ведут в 0,01 М боратном буфере (рН 9,5), энергично пере-
мешивая раствор белка с избытком раствора МДФФ в ДМСО.
Недавно [Chen, Thomas, 1980] МДФФ был использован для
окраски бромциановых пептидов альдолазы перед их разделе-
нием электрофорезом в 15%-ном ПААГ с ДДС-Na. Пептиды,
обработанные ДДС-Na и р-меркаптоэтанолом, окрашивали в
0,1 М Li-боратном буфере (рН 9,5), добавляя к ним в пятикрат-
ном избытке МДФФ, растворенный в абсолютном метаноле.

100

Ортофталевый альдегид (ОФА) в присутствии ?-меркапто-
этанола реагирует с первичными аминами белков и пептидов,
давая сильно флюоресцирующий продукт в соответствии с при-
веденной ниже схемой.

ОФА растворим в воде, но лучше-в метаноле, этаноле, аце-
тоне и диоксане. Реакция присоединения хорошо идет при
рН 8-9. При использовании ОФА его сначала растворяют в
одном из перечисленных органических растворителей, а потом
смешивают с избытком водного буфера нужной концентрации и
значения рН. Максимум возбуждения флюоресцирующего про-
дукта - при 340 нм, флюоресценции - при 445 нм. Раствор са-
мого ОФА не флюоресцирует. Чувствительность метода - выше,
чем в случае флюоресцамина, но и фон флюоресценции побочных
продуктов выражен сильнее.
Использование ОФА для окрашивания комплексов белок-
ДДС-Na перед их электрофорезом описано еще в 1973 г. [Wei-
dekamm et al., 1973]. Реакцию проводили в 0,025 М Na-фосфат-
ном буфере (рН 8,5) в присутствии 5% ДДС-Na и 2% ?-меркап-
тоэтанола. Сначала белок растворяли в этой смеси и прогревали
при 100° для полной денатурации и восстановления, затем туда
добавляли 1/5 объема 1%-ного раствора ОФА в метаноле и вы-
держивали в темноте 2-3 ч.
Локализация ферментов после электрофореза
В ряде случаев электрофорез ферментов в мягких условиях
(без ДДС-Na или мочевины) не сказывается на их активности.
Положение полос ферментов в геле можно идентифицировать с
помощью специфических реакций, дающих окрашенные продук-
ты. Для этого гель вымачивают в растворе субстратов и кофак-
торов, необходимых для протекания определенной ферментатив-
ной реакции, иногда с добавлением реагентов, сообщающих
окраску продукту этой реакции. Эту операцию следует проводить
быстро во избежание диффузии нефиксированных белков из их
полос. Если субстрат реакции полимерен и плохо диффундирует,
его можно заполимеризовать прямо в гель и следить за продви-
жением фронта ферментативной реакции вместе с миграцией
фермента. Разумеется, при этом необходимо ясно представлять,
каково будет поведение субстрата в электрическом поле во вре-
мя электрофореза.

101

Можно заполимеризовать субстрат и кофакторы в другом
("индикаторном") геле на основе агарозы или импрегнировать
ими фильтровальную бумагу. После окончания электрофореза
белков в пластине рабочего ПААГ на его поверхность наклады-
вают индикаторный гель или бумагу. Ферменты диффундируют
в них из рабочего геля и обнаруживают себя соответствующей
цветной реакцией. Габриель привел длинный список индикатор-
ных цветных реакций для ферментов [Gabriel, 1971]. Во многих
случаях в этих реакциях фигурирует восстановление НАД с
дальнейшей передачей электрона на краситель. Удобно в каче-
стве заключительного этапа реакции воспользоваться нефермен-
тативным восстановлением тетразолиевой соли до ее формазана,.
что дает сильно окрашенные и зачастую нерастворимые продук-
ты (схема реакции приведена ниже),

В качестве примера можно назвать часто употребляющийся
препарат "Methyl thiazolyl blue" (MTT) или еще более сложное
соединение "Nitro blue tetrazolium" (NBT). В окисленном виде


обе эти соли бесцветны. При восстановлении первая дает сине-
пурпурную, а вторая-иссиня-черную окраску. Реакция восста-
новления красителей ускоряется в присутствии промежуточного
переносчика электронов "Phenazine methosulfate" (PMS) или
нового, более стойкого реагента, выпускаемого для этой цели
фирмой "Boehringer" под названием "Meldolablue" [Turner,
Hopkinson, 1979].

102

Для обнаружения в геле протеолитических ферментов пред-
ложен ряд нетривиальных методов. Например, после электрофо-
реза гель вымачивают в течение 2 ч при 37° в 8%-ном растворе
цитохрома с в буфере с рН 8,5, содержащем 8 М мочевину и
1,7 мМ CaCl2. Затем белок фиксируют в 12,5%-ной ТХУ. Диф-
фундируя в гель, цитохром с окрашивает его в коричневый цвет
по всему объему. Полосы протеаз, разрушающих цитохром с,
остаются прозрачными и хорошо видны на коричневом фоне
[Ward, 1976]. Суть другого подхода заключается в том, что на
гель накладывают обработанную закрепителем в темноте (для
удаления серебра) и вымоченную в буфере фотопленку. После
трехчасовой выдержки при 35° во влажной камере на фотоплен-
ке можно обнаружить следы диффузии в нее протеаз, разрушаю-
щих слой желатины [Burger, Schroeder, 1976].
Для обнаружения нуклеаз при полимеризации геля в него
вносят ДНК (10 мкг/мл) или РНК (25 мкг/мл). Если нуклеазы
для своего действия нуждаются в ионах Mg2+, Са2+ или Zn2+, то
в их растворе ПААГ вымачивают после окончания электрофоре-
за. Далее следует окрашивание геля красителем для нуклеино-
вых кислот-бромистым этидием (см. главу 4). Окрашивается
весь гель, за исключением полос, содержащих нуклеазы, где
нуклеиновая кислота разрушена. Можно вести разделение нук-
леаз и в присутствии ДДС-Na, блокирующего их действие во
время электрофореза. Перед обработкой бромистым этидием
ДДС-Na из геля вымывают.
Заполимеризовав в ПААГ денатурированную ДНК, можно
выявить нуклеазы, специфичные для однонитевых ДНК. Мож-
но также исследовать оптимизацию условий, необходимых для
активности нуклеаз, варьируя состав буфера геля, или опробо-
вать различные ингибиторы нуклеазной активности. С помощью
кольцевых ДНК удается отличить эндонуклеазы от экзонуклеаз.
Электрофорезу можно подвергнуть лизаты бактерий для выяс-
нения содержания в них нуклеаз [Rosenthal, Lacks, 1977]. Окра-
шивание бромистым этидием в описанных опытах можно заме-
нить авторадиографией (см. ниже), если в гель заполимеризо-
вать меченную 32Р нуклеиновую кислоту или синтетический
полинуклеотид [Iborra et al., 1979].
Выше указывалось, что для локализации ферментов по их
активности электрофорез желательно проводить в условиях,
исключающих возможность денатурации. Однако в недавней ра-
боте [Lacks, Springhorn, 1980] было показано, что очистку цело-
го ряда ферментов (ДНКазы I, некоторых протеаз, амилазы,
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) можно производить электро-
форезом в ПААГ с ДДС-Na после соответствующей обработки
их детергентом при повышенной температуре. Денатурация ока-
зывается обратимой. По окончании электрофореза ДДС-Na от-
мывают и одновременно снимают с белка встряхиванием геля в
течение 1-2 ч в 0,04 М Трис-буфере, рН 7,6. Ферментативная
активность в ряде случаев восстанавливается.

103

По данным Хагера и Буржесс, при снятии ДДС-Na с фермен-
та имеет смысл денатурировать его кратковременной обработ-
кой 6 М гуанидинхлоридом с последующей ренатурацей при раз-
бавлении. Возможно, что при этом восстанавливается нативная
конфигурация белка, нарушенная при первоначальной обработке
ДДС-Na [Hager, Burgess, 1980]. Для ферментов, содержащих
несколько полипептидных цепей (химотрипсин), предваритель-
ную обработку (?-меркаптоэтанолом, разумеется, следует исклю-
чить. Впрочем, то же самое относится и к одноцепочечному трип-
сину. По-видимому, разрыв внутрицепочечных S-S-связей в
нем приводит к необратимой денатурации. Ферменты, состоящие
более чем из двух субъединиц, не ренатурируют.
В заключение отметим, что гликопротеиды после электрофо-
реза в ПААГ можно локализовать, вымачивая гель в растворе
конканавалина А, конъюгированного с флюоресцентной меткой,
например с флюоресцеинизотиоцианатом [Furlan et al., 1979],
или радиоактивно меченного введением 125I [Horst et al., 1980].
Локализация белковых полос осаждением ДДС-Na
Не очень чувствительные, но быстрые и простые методы по-
зволяют обнаружить полосы белка после электрофореза в при-
сутствии ДДС-Na по осаждению этого детергента. Наиболее
простой способ состоит в охлаждении геля до температуры 0-4°.
При боковом освещении на фоне черного бархата непрозрачные
белковые полосы и пятна хорошо видны среди почти прозрачно-
го геля. По-видимому, комплексы белок-ДДС-Na служат ядра-
ми конденсации большого количества мицелл ДДС-Na, раство-
римость которого очень сильно зависит от температуры. При
отргревании геля полосы и пятна исчезают. Нижний порог чув-
ствительности этого метода - 0,2 мкг белка на 1 мм2 площади
пятна [Wallace et al., 1974]. Попутно отметим недавно описан-
ный, аналогичный способ обнаружения белков в ПААГ, содержа-
щем 8 М мочевину. Гель выдерживают 5-10 мин при -70°.
В местах расположения белковых зон за счет связывания части
свободной воды белками мочевина кристаллизуется, давая не-
прозрачные полосы. Остальной гель при этом остается прозрач-
ным [Bachrach, 1981].
Недавно [Higgins, Dahmus, 1979] было предложено после
окончания электрофореза вымачивать гель в течение 1 ч при 25°
в 10-12 объемах 4 М раствора ацетата натрия. Свободный
ДДС-Na, который в концентрации 0,1% присутствует в геле, вы-
падает в осадок - гель становится белым и непрозрачным. Бел-
ки, связанные с ДДС-Na, при этом не осаждаются. Их прозрач-
ные полосы хорошо видны на темном фоне при освещении геля
сбоку и снизу. Чувствительность метода - 0,1 мкг белка на 1 мм2
площади пятна или полосы.

104

ЭЛЮЦИЯ БЕЛКОВ ИЗ ГЕЛЯ
Простейший прием элюции состоит в извлечении белка из по-
лоски или кусочка геля за счет диффузии в течение длительного
времени при 37-40°. Этот прием пригоден как для свободных
белков, так и для их комплексов с ДДС-Na. С целью облегчения
диффузии белков из геля последний измельчают, например рас-
тирают в маленьком стеклянном гомогенизаторе. Во время элю-
ции суспензию измельченного геля встряхивают. В элюирующий
буфер, как правило, вводят ДДС-Na даже в тех случаях, когда
электрофорез белка проводили без него. Это делают для облег-
чения растворения белков. После окончания экстракции гель
удаляют центрифугированием. От ДДС-Na и красителя белок
можно освободить осаждением и промывкой сначала смесью
ацетона с 0,1 М НС1 (6: 1), а затем чистым ацетоном. Осажден-
ный ацетоном белок высушивают или лиофилизируют. Брэй и
Браунли [Bray, Brownlee, 1973] элюировали таким образом бе-
лок в 0,05 М Na-фосфатный буфер <рН 7,5) с 0,1% ДДС-Na и
1 мМ ФМСФ ' при 37° в течение ночи при встряхивании. Белок
в комплексе с ДДС-Na осаждали (за счет ДДС-Na) добавле-
нием КС1 до 0,2 М и выдерживанием при 0°. Дрешер и Ли гомо-
генизировали кусочки геля в малом объеме 1%-ного раствора
ДДС-Na и элюировали белки в течение ночи при 40°. Такая кон-
центрация ДДС-Na оказалась необходимой для растворения
белков, осажденных в геле в ходе их фиксации кислотой и окра-
.шивания [Drescher, Lee, 1978]. В другой работе [Sreekrishna
et al., 1980] белки, предназначенные для последующего амино-
кислотного анализа, элюировали из ПААГ гомогенизацией в
0,05 М растворе бикарбоната аммония с 0,05% ДДС-Na и инку-
бацией в течение 10 ч при 37°. Бикарбонат аммония удаляли
повторной лиофилизацией. От ДДС-Na избавлялись, осаждая
белок добавлением 9 объемов подкисленного ацетона после рас-
творения лиофилизированного препарата в воде до концентра-
ции 1 % по ДДС-Na.
Иногда для улучшения растворения осажденного в геле бел-
ка экстракцию ведут в 1%-ном ДДС-Na с 6 М мочевиной [Buis-
son et al., 1976]. Щелочные негистоновые белки хроматина мож-
но экстрагировать 66%-ной уксусной кислотой на холоду [Rab-
bani et al., 1980]. Белки рибосом после двумерного электрофореза
и окраски СВВ R-250 можно также элюировать 66%-ной уксус-
ной кислотой. Краситель легко затем удалить на микроколонке
ДЭАЭ-целлюлозы прямо в той же кислоте. Анионный по своей
природе краситель десорбируется с белка и полностью задержи-
вается на анионообменнике, а щелочные рибосомальные белки
с ним не связываются [Bernabeu et al., 1980].
Описан способ экстракции белков в комплексе с ДДС-Na
60%-ной муравьиной кислотой [Gibson, Cracy, 1979], которую
------
1 Фенилметилсульфонилфторид - ингибитор протеаз.

105

затем упаривают, а сухой остаток суспендируют в 6 н. НС1. Бе-
лок при этом растворяется, а ДДС-Na остается в осадке. Его
удаляют центрифугированием, а краситель из раствора белка в
кислоте извлекают троекратной экстракцией октанолом. Соля-
ную кислоту удаляют высушиванием в струе азота, разбавив
предварительно препарат водой.
Возможен и другой подход. Сначала ДДС-Na и краситель
экстрагируют из ПААГ без растворения осажденного в полосах
белка. Этого добиваются пятикратной гомогенизацией геля в
растворе, содержащем 10% ТХУ и 30% этанола. Гель каждый
раз осаждают центрифугированием. Из очищенного таким обра-
зом геля белки экстрагируют 0,1 М NaOH в течение 2 ч при 37°
при встряхивании [Djondjurov, Holtzer, 1979]. Для малых кон-
центраций белков в полосах этот метод не подходит, так как
часть белков вымывается при обработке геля ТХУ.
Нефиксированные белки удобно извлекать из геля возобнов-
лением электрофореза до выхода белка из геля. Содержащую
нужный белок полосу (или пятно) в геле локализуют сопостав-
лением с окрашенными белками в параллельном контрольном
треке на пластине, который предварительно отрезают, или в конт-
рольной трубке. Можно фиксировать положение полос и с по-
мощью данзилированных маркеров (см. выше). Вырезанный из
геля участок помещают в трубку на небольшую "пробку" из
крупнопористого ПААГ или агарозы и заливают буфером, а на
нижний конец трубки надевают заполненный буфером диализ-
ный мешочек. Затем возобновляют электрофорез и ведут его до
тех пор, пока белок не выйдет из трубки в мешочек [Weliky
et al., 1975]. Особенно удобно следить за выходом белка при на-
личии данзилированных маркеров. Если находящийся в диализ-
ном мешочке буфер содержит в избытке неионный детергент
(2% NP-40) и 8 М мочевину, то ДДС-Na практически полностью
вытесняется из связи с белком и уходит через мембрану к аноду
[Tuszynski et al., 1977].
Описан вариант, при котором белок электрофоретически
элюируют в трубку большего диаметра, где на пробке из ПААГ
лежит слой оксиапатита, уравновешенного 0,1 М Na-фосфатным
буфером (рН 7,2) с 0,1% ДДС-Na. Несмотря на действие элект-
рического поля, белок собируется на оксиапатите, откуда его
затем, разобрав всю систему, можно элюировать 0,5 М фосфат-
ным буфером [Ziola, Seraba, 1976].
Нитроцеллюлозные мембранные фильтры обладают способ-
ностью сорбировать щелочные белки. Этим можно воспользо-
ваться для получения "реплики". Фильтр накладывают на по-
верхность геля, и выходящие из него за счет диффузии белки
тут же сорбируются и располагаются на нитроцеллюлозе точно
такими же полосами, как и в геле. Далее уже на фильтре мож-
но проводить идентификацию белков, например гибридизацией
их с меченной 32Р ДНК [Bowen et al., 1980]. Простейшее устрой-
ство для этой цели, предложенное авторами цитируемой работы,

106

показано схематически на рис. 29. К пластине геля с двух сторон
металлическими сетками через пропитанные буфером поролоно-
вые прокладки прижимают нитроцеллюлозные фильтры (18x
x18 см) рабочей поверхностью к гелю. Фильтры предваритель-
но смачивают буфером, чтобы в них не оставалось окклюдиро-
ванного воздуха. Для этого следует дать им некоторое время по-
плавать на поверхности буфера, а потом уже погрузить в него.
Если электрофорез шел в присутствии ДДС-Na, белки пред-



Рис. 29. Устройство для диф-
фузии белков из геля на нит-
роцеллюлозный фильтр [Bo-
wen et al., 1980]
/ - сетка из нержавеющей стади;
2 - поролон; 3 - нитроцеллюлоз-
иый фильтр; 4-ПААГ

варительно освобождают от него, вымачивая гель в 0,01 М рас-
творе Трис-НСl (рН 7), содержащем 0,05 М NaCl, 2 мМ ЭДТА
и 4 М мочевину, в течение 3 ч с перемешиванием. Для более
полного освобождения от ДДС-Na в этот раствор можно сначала
ввести 1% Тритона Х-100, а потом отмывать тем же буфером без
детергента. Собранную, как описано выше, многослойную систе-
му погружают в 2 л того же буфера, но без мочевины. Диффузия
идет при комнатной температуре в течение 36-48 ч с одной сме-
ной буфера.
Белки на фильтре можно окрасить, а .радиоактивные-обна-
ружить флюорографией (см. ниже). Для этого высушенный
фильтр ненадолго замачивают в 10%-ном растворе ППО в эфи-
ре и накладывают на него рентгеновскую пленку. Флюорогра-
фия или авторадиография с фильтра идет значительно лучше,
чем с геля, так как белки сорбируются на поверхности мембран-
ного фильтра.
Выход белков из геля на фильтр можно значительно уско-
рить, использовав электрофоретическую элюцию белков из пла-
стины геля в поперечном направлении, подобно тому, как это
было описано для электрофоретической отмывки красителя
[Towbin et al., 1979]. Для этого собирают такую же систему, как
в предыдущем варианте, с тем лишь отличием, что нитроцеллю-
лозный фильтр ("Millipore НА") накладывают на гель только с
одной стороны - той, куда будут мигрировать белки под дейст-
вием электрического поля. Весь "сэндвич" помещают в прибор
для электрофоретической отмывки геля и подбирают напряжение
так, чтобы напряженность поля в геле составляла около 6 В/см.
Если электрофорез белков вели в отсутствие ДДС-Na (напри-
мер, с мочевиной), то предварительное вымачивание геля и всех
компонентов системы, а также саму элюцию можно вести в
0,7%-ной уксусной кислоте. За 1 ч белки полностью выходят из
геля в направлении катода и прочно сорбируются на нитроцел-

107

люлозе. Однако не следует допускать перегрузки фильтра: его
сорбционная емкость составляет примерно 0,15 мкг белка на
1 мм2 поверхности. Для проверки можно вслед за первым поло-
жить второй листок нитроцеллюлозы - на нем не должно быть
белка.
Если разделение белков вели в комплексе с ДДС-Na, то и
элюировать их можно в этом комплексе. В таком случае следует
использовать буфер того же типа, какой используют для верхне-
го электродного резервуара ступенчатой системы электрофореза
по Лэммли (0,192 М глицин, 25 мМ Трис, 20%-ный метанол; рН 8,3). Направление миграции белков-к аноду. Выход белка
при этом получается неполным.
Перешедшие на фильтр белки Таубин и соавторы идентифи-
цировали иммунологически. Подробное рассмотрение метода вы-
ходит за рамки этой книги, поэтому ниже он описан лишь вкрат-
це. Фильтр вымачивали в 3%-ном растворе бычьего сывороточ-
ного альбумина для насыщения оставшихся свободными центров
сорбции, затем инкубировали с антисывороткой к интересующе-
му белку, промывали и инкубировали с "индикаторными" анти-
телами к иммуноглобулинам первой сыворотки, конъюгирован-,
ными с флюоресцентным красителем или меченными радиоактив-
но. Перенос белков из геля на нитроцеллюлозный фильтр
существенно облегчает их иммунологическую идентификацию,
так как крупные молекулы ?-глобулинов плохо диффундируют
в гель, тогда как фильтр сорбирует белки на своей поверхности
и они легко доступны для антител.
Описанный прием идентификации можно использовать во
всех случаях, когда белок способен образовывать специфические
комплексы (гормон-рецептор, рецептор-цАМФ, белок-нукле-
иновая кислота и др.), - конечно, при условии, что его активные
группы остаются открытыми при сорбции на нитроцеллюлозу.
Впрочем, последнее требование может относиться лишь к неболь-
шой доле молекул белка данного типа, достаточной для иденти-
фикации всей полосы.
Нитроцеллюлоза сорбирует только щелочные белки. Распро-
странение этого метода на любые белки связано с использова-
нием так называемой "диазобумаги", на которой предварительно
закреплены афинные сорбенты, например: антитела или антиге-
ны [Eriich et al., 1979]. Диазобумага была разработана и нашла
себе применение главным образом для гибридизации нуклеино-
вых кислот [Alwine et al., 1977], поэтому здесь нет места для
описания ее особенностей. Отметим только способ переноса бел-
ков из ПААГ на диазобумагу. После электрофореза белков в си-
стеме Лэммли ДДС-Na вымывают из геля 0,15 М Na-фосфатным
буфером (рН 7,4) с 0,15 М NaCl и 0,5% Тритона Х-100 при ком-
натной температуре в течение 1 ч. Затем гель кладут на стопку
фильтровальной бумаги в кювету, заполненную тем же буфером,
накрывают диазобумагой, а ее - несколькими слоями сухой
фильтровальной бумаги. Всю пачку прижимают через стеклян-

108

ную пластинку грузом. Буфер, поднимающийся из кюветы через
гель к сухой фильтровальной бумаге, за 1-2 ч при комнатной
температуре вымывает основную массу белка из геля. Нужный
белок задерживается на афинном сорбенте, остальные же уходят
дальше, в фильтровальную бумагу.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ БЕЛКОВ
ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПААГ
Аппаратура, сцинтилляторы, различные методы счета радио-
активности белков, а также способы оценки эффективности этих
методов требуют отдельного подробного рассмотрения. Ниже в
очень сжатом виде будут описаны только некоторые приемы
оценки радиоактивности белков после их электрофореза в
ПААГ.
Счет радиоактивности в элюатах белка
Все перечисленные в предыдущем разделе способы элюции
белков из геля позволяют оценивать их радиоактивность с по-
мощью приемов счета радиоактивности в растворах. Следует
помнить, что элюция белка из геля никогда не бывает полной,
поэтому количественная оценка содержания белка в полосе геля
при таком подходе носит более или менее приближенный харак-
тер. Кроме того, элюция связана со значительным разбавлением
белкового раствора.
Один из специфических вариантов счета радиоактивности
элюата из геля после электрофореза белков в комплексе с
ДДС-Na отработан именно для концентрирования белкового
препарата. В нем используется способность комплекса белок-
ДДС-Na при пониженной температуре и обработке 10%-ным рас-
твором ТХУ образовывать мицеллы, которые сорбируются на
нитроцеллюлозных фильтрах типа "Millipore НА". К элюату бел-
ка в 1%-ном растворе ДДС-Na с 6 М мочевиной добавляют в
качестве носителя бычий сывороточный альбумин до концентра-
ции 0,25 мкг/мл, а затем 2 объема 15%-ного раствора ТХУ.
Смесь хорошо встряхивают и оставляют на 15 мин во льду. Пос-
ле этого ее можно фильтровать и промывать на фильтре 5%-ным
раствором ТХУ. Счет радиоактивности ведут на фильтрах. Ис-
пользование фильтра типа "Millipore" здесь обязательно, так как
в присутствии ДДС-Na ТХУ не дает обычного осадка белка, а
на бумажных или стекловолокнистых фильтрах мицеллы комп-
лексов белок-ДДС-Na не задерживаются [Buisson et al., 1976].
Для качественного определения радиоактивности 14С и 125I
белковые полосы и пятна (при толщине геля не более 1,5 мм)
можно вырезать и просто высушить на поверхности любого из
стекловолокнистых фильтров типа "Whatman GF" или даже на
бумажном фильтре "Whatman N 1". Сушить достаточно 30 мин
при 50° или 2 ч при комнатной температуре. Счет радиоактивно-
сти ведут в толуоловом сцинтилляторе [Leinen, Wittliff, 1978].

109

Другой вариант с использованием фильтров типа GF/C вклю-
чает диффузию нефиксированных комплексов белок-ДДС-Na
из кусочков геля толщиной 0,7 мм в фильтры, смоченные
10%-ным раствором NH4OH. Диффузия идет в течение суток при
комнатной температуре в атмосфере аммиака. Затем фильтры
.сушат и просчитывают в толуоловом сцинтилляторе. Как и всег-
да при диффузии, полнота выхода белков зависит от их молеку-
лярной массы и пористости геля [Helliner, Wunner, 1971].
Растворение ПААГ
Полноту счета радиоактивности белка можно обеспечить
растворением геля. Обычный ПААГ можно растворить при по-
вышенной температуре в 30%-ном растворе перекиси водорода.
Если белки мечены 14С, то к раствору Н2О2 следует добавить
NH40H ,до концентрации 1%, чтобы улавливать радиоактивный
14СО2. Проще всего кусочек геля с белком растворять именно в
такой смеси при 65° в течение 4-6 ч и далее просчитывать ра-
диоактивность в сцинтилляторе на основе диоксана. Однако
эффективность счета в диоксановом сцинтилляторе ниже, а воз-
можность артефактов - тушения и хемолюминесценции - вы-
ше, чем в толуоловом сцинтилляторе, поэтому после описанного
растворения геля в Н2О2 с NH4OH иногда предпочитают исполь-
зовать один из фирменных "солюбилизаторов" и считать радио-
активность в сцинтилляторе на основе толуола [Goodman, Mat-
zura, 1971 ]. Хорошие результаты дает растворение ПААГ в
30%-ной Н2О2 с 5% NH40H (37°, 6 ч) в комбинации со сцинтил-
лятором на основе ксилола, выпускаемым фирмой NEN под наз-
ванием "Aquasol". Для подавления хемолюминесценции щелоч-
ного раствора в сцинтиллятор добавляют около 0,01 объема ле-
дяной уксусной кислоты.
Растворять ПААГ или хотя бы белок внутри него можно и
без перекиси водорода, с помощью некоторых фирменных солю-
билизаторов. Так, "Soluene" фирмы "Packard" растворяет ПААГ
в результате энергичного встряхивания в течение суток при 60-
65°. В солюбилизаторе NCS фирмы "Nuclear Chicago" при ана-
логичной обработке гель сильно набухает, белок растворяется и
выходит в сцинтиллятор [Paus, 1971]. Фирма NEN ("New Eng-
land Nuclear") рекомендует для обработки ПААГ использовать
3%-ный раствор солюбилизатора "Protosol" в сцинтилляцион-
ной смеси под названием "Econofluor". За ночь при 37° гель на-
бухает, и около 80% белка переходит в сцинтиллятор. Наконец,
недавно был предложен специальный "коктейль", содержащий
6 г ППО, 10 мг NCS и 10 мл "Hyamine 10X hydroxide" в 1 л то-
луола. По утверждению автора, за 24 ч при комнатной темпера-
туре в эту смесь из ПААГ выходит до 95% белка [Aloyo, 1979].
Тщательное сопоставление всех перечисленных выше мето-
дов для счета тритиевых препаратов после электрофореза в
ПААГ было недавно проведено Муром [Moore, 1980]. Наилуч-

110

шие результаты, по данным автора, дает обработка' предвари-
тельно растертого геля в течение ночи при комнатной темпе-
ратуре 1%-ным раствором солюбилизатора "Soluene 350" в то-
луоле, содержащим 0,5% ППО и 0,05% вторичного сцинтиллято-
ра MSB фирмы "Packard". Для ускорения процесса можно
предварительно солюбилизировать кусочек геля в 0,5 мл "Solue-
ne 350" при 50° в течение 3 ч, а затем добавить 10 мл того же
толуолового сцинтиллятора. Эффективность счета трития состав-
ляет около 60%, а выход достигает 90-95%.
Полное растворение геля легко осуществить в том случае,
когда при полимеризации вместо метиленбисакриламида гель
сшивают более лабильным бифункциональным агентом. В гла-
ве 1 уже был назван в этом качестве NN/-диaллилтapтapдиaмид
(ДАТД) и указаны условия растворения сшитого им геля в
йодной кислоте [Anderson, McClure, 1973]. В другом варианте
растворимого геля используют NN/-(l,2-диoкcиэтилeн)-биcaкpи-
ламид (ДОЭБА), который легко синтезировать из акриламида и
глиоксаля. Гель, сшитый ДОЭБА, растворяется в 0,025 М НЮ4
при 50° в течение 48 ч. Авторы работы [O'Connel, Brady, 1976]
утверждают, что гели, сшитые ДОЭБА, отличаются более вос-
производимыми характеристиками, чем при использовании
ДАТД. Описан также растворимый ПААГ, сшитый бисакрилил-
цистамином, который готовят из цистамина и акрилилхлорида
[Hansen, 1976]. Этот гель растворяется в ?-меркаптоэтаноле за
2-3 мин. В приготовлении таких гелей имеется целый ряд тон-
костей, которые необходимо учитывать во избежание образова-
ния дополнительных, устойчивых к воздействию (3-меркаптоэта-
нола сшивок [Hansen et al., 1980]. NN/-Бисакрилилцистамин в
настоящее время выпускается фирмой, так же как ДАТД и
ДОЭБА.
Несмотря на свою кажущуюся привлекательность раствори-
мые ПААГ не получили широкого распространения - скорее
всего; ввиду худшей воспроизводимости их характеристик. Очень
легко - простым нагреванием - расплавляются гели агарозы,
но их применяют в основном для электрофореза нуклеиновых
кислот, поэтому рассмотрение этого вопроса имеет смысл отло-
жить до следующей главы.
Импрегнирование сцинтиллятора в гель
Возможен и обратный подход к решению проблемы счета ра-
диоактивности белка после электрофореза - вместо элюции бел-
ка можно попытаться импрегнировать сцинтиллятор в кусочек
геля, заменив им водное окружение радиоактивного белка и со-
хранив при этом прозрачность геля. Такая попытка реальна.
В одном из описанных вариантов ПААГ дегидратируют в абсо-
лютном этаноле, потом этанол заменяют на толуол, а его-на
толуол-тритоновый сцинтиллятор [Gezelins, 1977]. По-видимому,
лучше начинать с замены воды в геле на диметилсульфоксид.

111

При этом гель не будет съеживаться и терять прозрачности как
это происходит при вымачивании его в этаноле.
Во всех случаях, когда обработке геля предшествует его раз-
резание, следует стремиться к тому, чтобы в одном кусочке геля
была вырезана целая полоса или все белковое пятно. Широко
распространенная практика разрезания цилиндрика геля на оди-
наковые диски толщиной 1-1,5 мм неудачна, так как разрез
"вслепую" может попасть на середину полосы. В результате это-
го радиоактивность, содержащаяся в полосе, будет просчитана в
двойном объеме геля, что даст ложную картину вдвое более ши-
рокого и низкого пика радиоактивности на электрофореграмме.
Разумеется, для того чтобы правильно вырезать белковую
полосу, ее надо окрасить, а это трудно сделать при малой кон-
центрации белка в полосе, что нередко имеет место при фрак-
ционировании радиоактивно меченных белков. Однако разработ-
ка новых высокочувствительных методов окрашивания белков,
например серебром, поможет решить эту проблему.
Авторадиография
Регистрацию полос радиоактивных белков в пластине геля
можно осуществить методом авторадиографии. На гель наклады-
вают рентгеновскую пленку и экспонируют ее в течение длитель-
ного времени в темноте, обычно при комнатной температуре.
Экспозицию ведут в кассете, где пленка прижимается к гелю
пружинами через резиновую прокладку. В зависимости от уров-
ня радиоактивности белков экспозиция может длиться от не-
скольких часов до многих дней. Затем пленку проявляют обыч-
ными проявителями, предназначенными для получения макси-
мально контрастного изображения. Под действием ?-излучения
участки пленки, лежавшие над белковыми полосами и пятнами,
чернеют. Авторадиографию имеет смысл проводить только в тех
случаях, когда белки мечены радиоактивным углеродом или
йодом. Энергия излучения трития слишком мала, чтобы испус-
каемые им ?-частицы смогли преодолеть воздушный промежуток
между гелем и пленкой, да и просто вылететь из пластины, ввиду
их сильного поглощения в геле.
Потеря энергии ?-частиц в геле достаточно велика и в слу-
чае использования радиоактивного углерода, поэтому перед
авторадиографией гель высушивают. Кстати, толщина высушен-
ного геля будет тем меньше, чем меньше содержание в нем ме-
тиленбисакриламида. Для высушивания гель переносят на
фильтровальную бумагу ("Whatman 3MM"), под нее подклады-
вают пористую прокладку и перфорированную металлическую
пластинку. Все это помещают в полиэтиленовый мешок и при-
соединяют к вакуумному насосу. При подогревании в горячей
воде или под лампой гель высыхает за 1-2 ч, образуя тонкую
прочную пленку на поверхности фильтровальной бумаги. Есть
множество фирменных устройств для сушки гелей. В них пласти-

112

ну геля обычно кладут на подключенную к вакуум-насосу по-
ристую основу и накрывают листом тонкой резины, которую при-
сасывает вакуумом. Во избежание прилипания резины к гелю
под нее можно положить тонкую пленку. Несмотря на высуши-
вание, регистрация р-частиц углерода из глубинных слоев не-
возможна для гелей с исходной толщиной более 0,4 мм.
Для авторадиографии следует использовать неэкранирован-
ную рентгеновскую пленку типа "Kodak No Screen X-Ray Film",
например: NS-5T (США) или РТ-1 и РТ-2 (СССР). Фирма
LKB (Швеция) рекламирует пленку, пригодную для авторадио-
графии препаратов, меченных тритием, под названием "LKB-
Ultrafilm". Суть дела здесь не в повышении чувствительности,
а в отсутствии защитного слоя над фотографической эмульсией.
Это облегчает проникновение в нее "слабых" ?-электронов три-
тия, но затрудняет последующую обработку пленки. Чувстви-
тельность метода авторадиографии для регистрации 14С можно
оценить из следующих ориентировочных данных. Радиоактив-
ность порядка 25000 распадов в минуту, равномерно распреде-
ленная по площади 1 см2, надежно регистрируется за 24 ч экспо-
зиции.
Для регистрации ?-излучения 125I удобно применять способ
"непрямой" авторадиографии. ?-Излучение регистрируется рент-
геновской пленкой, но большая его часть пронизывает ее и те-
ряется, поэтому позади пленки устанавливают так называемый
"интенсифицирующий экран", покрытый твердым сцинтиллято-
ром (CaVO4). Под действием ?-излучения экран флюоресцирует,
а свет этой флюоресценции регистрируется пленкой. Разрешение
и резкость полос при этом несколько ухудшаются, поскольку
экран удален от геля на толщину пленки, а не все ?-частицы вы-
летают из геля перпендикулярно его поверхности, зато выигрыш
в чувствительности получается значительный.
Для непрямой авторадиографии следует использовать экра-
нированные рентгеновские пленки, например: "Kodak X-Omat R"
и "Kodak RP-50" (США) или РМ-1 (СССР). Интенсифицирую-
щие экраны выпускают, в частности, фирма "Du Font" (США)
под названием "Lightning Plus Intensifying Screen" и химфарм-
завод им. Семашко под маркой ЭУ-ВЗ.
Для повышения чувствительности пленки ее иногда предва-
рительно засвечивают до плотности потемнения (после проявле-
ния), соответствующей A540=0,2-0,3. Объяснение этого стран-
ного на первый взгляд феномена можно найти в работе [Laskey,
Mills, 1975].
Флюорография
Для регистрации положения в геле белков, меченных три-
тием, применяют метод флюорографии. Смысл его в том, чтобы
ввести сцинтиллятор внутрь геля таким образом, чтобы он нахо-
дился в непосредственном контакте с радиоактивными белками
в полосах. Свечение сцинтиллятора внутри геля легко выходит

113

из него наружу и регистрируется наложенной на гель рентгенов-
ской пленкой того же типа, который используют при непрямой
авторадиографии. По существу говоря, такой подход уже был
рассмотрен выше, но тогда не стояла задача сохранения геомет-
рических размеров целой пластины геля, чего трудно добиться
при импрегнировании в гель жидкого сцинтиллятора.
Повсеместное распространение для флюорографии гелей по-
лучила процедура, предложенная в 1974 г. Боннером и Ласки.
Сначала воду в геле замещают на диметилсульфоксид (ДМСО),
вымачивая пластину после фиксации в ней белков в течение 1 ч
в двух сменах по 20 объемов ДМСО (по отношению к объему
геля). Надо помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через
кожу, поэтому работать следует в перчатках. Затем гель перено-
сят на 3 ч в 4 объема 22%-ного (масса/объем) раствора ППО в
ДМСО; за это время ППО входит в гель. ДМСО не является
сцинтилляционным растворителем, поэтому его необходимо
убрать, но так, чтобы ППО остался в геле. Высушить ДМСО не
удается, и приходится прибегать к следующему приему. Гель
переносят в воду и вымачивают в ней около 1 ч. ППО в воде не-
растворим и немедленно выпадает в осадок. Гель становится
белым, непрозрачным и заметно твердеет, зато ДМСО снова за-
мещается на воду, которую затем нетрудно высушить, как было
описано выше. На фильтровальной бумаге после высушивания
остается жесткая белая пленка. Хотя она на вид и непрозрачна,
но вспышки сцинтилляций внутри нее (в местах контакта ППО
с радиоактивными белками) дают достаточно света, чтобы быть
зарегистрированными рентгеновской пленкой. В результате до-
статочно продолжительного экспонирования на пленке появляет-
ся картина расположения радиоактивных полос или пятен в геле
[Bonner, Laskey, 1974]. Засвечивание пленки для повышения ее
чувствительности производят и в этом случае. Экспонирование
пленки следует вести при температуре сухого льда, поскольку
при более высокой, пусть даже и отрицательной температуре
резко снижается чувствительность метода.
Гели с низким содержанием акриламида, например смешан-
ные гели из 2%-ного ПААГ и агарозы, могут растворяться в
ДМСО. Для них в аналогичной процедуре следует заменить
ДМСО на метанол (10%-ный раствор ППО в метаноле). Для
более концентрированных гелей метанол непригоден - гели в
нем сжимаются.
Концентрированные и сильно сшитые гели часто трескаются
при сушке обычным способом. Вакуум к гелю обычно подается
только с одной стороны через сетку и фильтровальную бумагу.
К противоположной стороне геля во время сушки плотно приле-
гает полиэтиленовая пленка или тонкая резина. Это приводит к
тому, что со стороны бумаги гель затвердевает раньше ("стек-
ленеет"), а на противоположной его поверхности остается влага,
которая может быть отсосана только через трещинки в геле. Во
избежание этого дефекта было предложено между свободной по-

114

верхностью геля и пленкой или резиной прокладывать слой по-
ристого полиэтилена, через который вакуум подается и к этой
поверхности геля [Joshi, Haenni, 1980].
Недавно было указано на возможность замены ППО в каче-
стве сцинтиллятора на салицилат натрия [Chamberlain, 1979].
Для него максимум флюоресценции лежит вблизи 410 нм, что
вполне приемлемо для экранированной рентгеновской пленки.
Главное же преимущество этого реагента - в его водораствори-
мости. Автор работы предлагает просто вымачивать гель в
10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение
30 мин при комнатной температуре, а затем сушить и флюоро-
графировать, как обычно. Нагревать гель во время высушивания
следует не выше, чем до 80°, во избежание возгонки салициловой
кислоты. Раствор салицилата можно хранить в течение 1-2 не-
дель. Потом он коричневеет (по-видимому, окисляется).
После флюорографии для количественных определений ра-
диоактивности полосы из высушенного геля можно вырезать,
дать им снова набухнуть в минимальном количестве воды и да-
лее растворять с помощью солюбилизаторов. При оценке эффек-
гивности счета в жидком сцинтилляторе можно пользоваться
только методом внутренней стандартизации.
Для правильного совмещения изображения на рентгеновской
пленке с гелем, без чего из него нельзя вырезать нужные для
счета участки, как и при авторадиографии, пользуются реперны-
ми отметками по углам пластины геля. Эти отметки делают ра-
диоактивными чернилами. С этой целью можно использовать
любые не диффундирующие в геле чернила с примесью плохо
растворимого, достаточно активного меченого препарата. Впро-
чем, забота об отсутствии диффузии чернил относится к случаю
авторадиографии влажных гелей, например при регистрации ра-
диоактивного фосфора. Для высушенных гелей это не так суще-
ственно.
Комбинацией авторадиографии и флюорографии можно ре-
гистрировать в геле двойную метку 3Н и 14С (например, сопо-
ставлять составы двух белковых смесей). В белки одной смеси
вводят радиоактивную метку по 3Н, в белки второй - по 14С. Обе
смеси объединяют и разделяют двумерным электрофорезом.
Пластину геля импрегнируют сцинтиллятором, высушивают и
регистрируют флюорографией на пленку "Kodak IR-5" сцинтил-
ляцию от обеих белковых смесей (3H+14С). С негатива делают
контактный отпечаток, так что все пятна радиоактивности ока-
зываются белыми. Затем с того же геля на неэкранированную
пленку "Kodak NS-5T" при комнатной температуре регистрируют
авторадиографией только 14С. К свету сцинтилляций эта пленка
нечувствительна. Накладывают вторую пленку на позитив с
первой. Не закрытые черным белые пятна указывают местона-
хождение белков, меченных только тритием, т. е. входящих в
состав только одной из двух смесей. Затем изотопные метки двух
белковых смесей можно поменять местами [McConkey, 1979].

115

Авторадиографией и флюорографией можно пользоваться не
только для пластин, но и для цилиндрических гелей. Для этой
цели из цилиндрика геля надо в продольном направлении выре-
зать плоский слой толщиной 0,5-1,5 мм. Описано простое приспо-
собление, облегчающее эту операцию [Watts et al., 1977].
Флюорографию нитроцеллюлозных фильтров с перенесенны-
ми на их "репликами" белков из геля осуществляют очень про-
сто. Фильтр погружают в 10%-ный раствор ППО в эфире, высу-
шивают и регистрируют сцинтилляцию на рентгеновскую плен-
ку, как это было описано для высушенного геля. Флюорография
и авторадиография нитроцеллюлозных фильтров осуществляется
лучше, чем в случае гелей, так как белки концентрируются на
поверхности фильтров.
ПРЕПАРАТИВНЫИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ
Электрофорез в ПААГ не получил широкого распространения
в качестве препаративного метода фракционирования и очистки
белков. Одна из причин этого, по-видимому, состоит в трудности
осуществления равномерного теплоотвода из большой массы ге-
ля любой конфигурации (цилиндрической, кольцевой или плос-
кой). Неравномерность теплоотвода и возникающие в геле гра-
диенты температуры приводят, как уже отмечалось, к резкому
ухудшению качества разделения белков.
Вторая трудность связана с необходимостью создания удоб-
ной и надежной камеры элюции для сбора белков по мере их
последовательного выхода из геля. В многочисленных конструк-
циях, предлагавшихся в начале 70-х годов, такую камеру соз-
давали под вертикально расположенным гелем, отделяя ее от
нижнего электродного буфера диализной пленкой. Для сохране-
ния качества разделения белков камера элюции очень малого
объема должна быстро и полно, без застойных зон, промываться
элюирующим буфером, а выходящие из геля белки не должны
сорбироваться на ее поверхностях, в частности на диализной
пленке. Удачного решения этих проблем найдено не было. Столб
геля, деформируясь под собственной тяжестью, сползал в каме-
ру, застойные зоны при элюции приводили к смешиванию белков
из разных полос, сорбция на пленке оставалась значительной.
Недавно появилось сообщение об еще одной попытке преодо-
леть указанные трудности. Препаративное фракционирование
белков вели в кольцевом 2,3%-ном ПААГ с ДДС-Na. Диализную
мембрану, отделяющую камеру элюции от нижнего электродного
резервуара, заменили слоем 10%-ного ПААГ. Во избежание
сползания рабочего геля в камеру элюирующий буфер в нее по-
давался под гидростатическим давлением, уравновешивающим
вес геля, а скорость элюции задавалась перистальтическим на-
сосом, стоящим на выходе из камеры. Сама камера имела форму
незамкнутого кольца. Элюирующий буфер подавался с одного
ее конца и выходил с другого. Сообщается о хорошем разделе-

116

нии ряда белковс молекулярными массами 100-500 тыс. при за-
грузке в гель 4 мг белка [Hardman, Kane, 1980].
Из-за его оригинальности стоит упомянуть об одном решении
проблемы камеры элюции [Marceau et al., 1975]. ПААГ полиме-
ризуют в цилиндре из плексигласа, закрытом внизу диализной
мембраной, лежащей на пористой подложке. Над самой мембра-
ной в цилиндр открываются отверстия двух трубочек. Одна из
них используется для подкачки, вторая - для слива элюирую-
щего буфера. ПААГ не прилипает к плексигласу, и весь столб
геля может перемещаться вверх внутри цилиндра. Такое пере-
мещение на очень малое расстояние вызывается кратковремен-
ной подкачкой буфера под гель при закрытом сливе. Так созда-
ется камера элюции: она существует только то время, которое
необходимо для выхода в нее очередной полосы белка. Затем
открывают кран трубочки для слива буфера. Гель под действием
собственного веса оседает, и камера полностью опоражнивается.
Процесс повторяют либо регулярно, по заданной программе, ли-
бо при подходе к нижнему концу геля очередной окрашенной
маркером белковой полосы. Перед опорожнением камеры поляр-
ность напряжения на несколько секунд сменяют на обратную,
что помогает десорбции белков с мембраны.
Проще и надежнее вести элюцию заранее окрашенных белко-
вых полос последовательно, одну за другой, в сменные диализ-
ные мешочки [Sun, Hall, 1974]. В цитируемой работе ПААГ по-
лимеризовали тоже в цилиндре из плексигласа диаметром 3 см,
по оси которого проходила трубка для дополнительного охлаж-
дения геля циркулирующей водой. Гель высотой 21 см поддержи-
вался снизу найлоновой сеткой. Сменные диализные мешочки
легко одевались на нижний конец цилиндра с помощью поли-
этиленовых переходников. Перед снятием очередного мешочка
полярность напряжения на короткое время реверсировали. Та-
ким образом авторам удалось выделить из 6 мг исходного бел-
кового препарата три компонента, относительно мало различаю-
щиеся между собой по молекулярной массе (43, 47 и 53 тыс.
яальтон).
Возможно построить препаративную систему электрофореза
с последовательной элюцией белковых полос с нижнего края
пластины ПААГ. Фирма "Bio-Rad" предлагает для этой цели
специальные прокладки, используемые при полимеризации геля.
Конструкция прокладок позволяет подвести к нижнему краю ра-
бочего геля толщиной до 6 мм по обеим его сторонам две тру-
бочки, через которые потом и осуществляют элюцию белков.
Сначала между стеклянными пластинками формы полимеризуют
пробку из плотного ПААГ, затем, как раз на уровне трубочек и
на высоту их диаметра, заливают слой раствора сахарозы, а над
этим слоем уже полимеризуют рабочий гель. Сахарозу потом за-
мещает элюирующий буфер.
Для препаративного фракционирования белков нередко ис-
пользуют систему ступенчатого электрофореза, хотя иной раз и

117

из несколько других соображений, чем создание узкой началь-
ной полосы. Наличие дополнительного формирующего геля при
большой загрузке предохраняет от преципитации белка на гра-
нице рабочего геля, позволяет увеличить объем препарата, обес-
печивает удаление из него остатков соли до начала процесса
рабочего разделения и, наконец, снимает необходимость преэлек-
трофореза, так как основная часть персульфата успевает уйти
из рабочего геля к аноду до того, как в этот гель вступают бел-
ки. Максимальная загрузка ПААГ при препаративном фракцио-
нировании белков может достигать 5 мг на 1 см2 сечения геля.
Общим недостатком любых устройств с последовательной
элюцией белков в конце пути их миграции через весь гель явля-
ется продолжительность этого процесса и, в силу этого, диффу-
зия белковых зон (особенно для белков, выходящих последни-
ми), поэтому сейчас на практике отдают предпочтение обычному
(хотя и с увеличенной загрузкой) фракционированию белков в
трубках диаметром до 1,7 см или в толстых пластинах. Фракцио-
нирование ведут с примесью окрашенных "свидетелей", как было
описано выше. Аликвоту разделяемой смеси белков окрашивают
ремазолом [Sun, Hall, 1974] или посредством данзилирования
[Tijssen, Kurstak, 1979; Schetters, McLeod, 1979]; окрашенные
полосы вырезают и белки элюируют из геля за счет диффузии
или электрофореза (см. выше).
Следует иметь в виду, что при элюции белков из геля может
выходить большое количество линейного полиакриламида, не
вошедшего в состав матрицы геля. Он не обнаруживается при
оценке чистоты белка аналитическим электрофорезом. Между
тем аналитическое ультрацентрифугирование показывает, что
количество элюированного полиакриламида может быть таким
же, как и самого белка. Дополнительную очистку белка в этом
случае можно провести его сорбцией на ионообменную смолу
[Brooks, Sander, 1980].
Недавно был предложен оригинальный способ электрофоре-
тической элюции белков одновременно из нескольких полос ге-
ля, вырезанных из пластины после препаративного электрофоре-
за [Judd, 1979]. На прямоугольный поднос наносят ровный слой
.пропитанного буфером сефадекса Г-25 "суперфайн" толщиной
2-3 мм. С интервалом в 1-1,5 см перпендикулярно длинной
стороне подноса в сефадексе выскребают канавки, куда укла-
дывают полоски геля (рис. 30). По концам подноса на сефадекс
через смоченную буфером фильтровальную бумагу кладут уголь-
ные электроды и подают напряжение. Под действием электриче-
ского поля белки из каждой полоски геля мигрируют в прилежа-
щий слой сефадекса. Эти слои затем снимают, переносят в мик-
роколонки и белки из них элюируют.
Кстати, можно просто заполнить сефадексом вертикальную
колонку и использовать его в качестве антиконвекционной среды
для препаративного электрофореза белков. Это, конечно, уже не
электрофорез в геле, и качество фракционирования будет заве-

118

домо хуже, но для грубого разделения смеси белков оно может
быть вполне приемлемым.
Отметим также успешное фракционирование до 1 г белковой
смеси электрофорезом в градиенте концентрации раствора саха-
розы (10-45%) в буфере с рН 8,5. Электрофорез вели в цилиндре
диаметром 12 см и высотой 17 см [Walters, Bont, 1979]. Тонкость
метода - в наслаивании препарата на раствор сахарозы с по-
мощью металлического сита, которое поднимается по мере уве-
личения объема препарата, оставаясь сцепленным с мениском
жидкости силами поверхностного натяжения. Это позволяет на-


Рис. 30. Схема электрофоретиче-
ской элюции белков из геля в се-
фадекс [Judd, 1979]
1-полоски, вырезанные из геля; 2-
сефадекс Г-25 "суперфайн"; 3 - уголь-
ные электроды; 4 - смоченная буфе-
ром фильтровальная бумага



нести 30 мл исходного белкового препарата совершенно ровным
слоем толщиной 3 мм. Электрофорез во избежание разогрева
жидкости ведут при малой плотности тока (0,2 мА/см2) в тече-
ние 15 ч. Фракции собирают, сливая содержимое колонки через
воронку, расположенную в ее нижней части. Препаративный
электрофорез в 5-25%-ном градиенте сахарозы в 0,1 М Трис-
боратном буфере (рН 8) с 6 М мочевиной был недавно исполь-
зован для очистки фотохимически сшитого комплекса тРНК и
тРНК-синтетазы [Renaud et al., 1979].
К электрофорезу в геле эти методы, разумеется, прямого от-
ношения не имеют, так как являются примерами электрофореза
в свободной жидкости. Именно с этого начиналось применение
электрофореза для фракционирования биополимеров. Однако за
последнее десятилетие, во всяком случае для аналитических це-
лей, электрофорез в свободной жидкости был полностью вытеснен
электрофорезом в гелях или на твердых носителях (бумаге, раз-
личных производных целлюлозы, полиамидных пленках и т. д.),
который широко применялся при фракционировании пептидов,
аминокислот и других сравнительно низкомолекулярных биоло-
гически важных молекул, в том числе и в высоковольтных ва-
риантах. В свое время, например, очень важную роль сыграл
метод фракционирования олигонуклеотидов гидролизата РНК
двумерным электрофорезом. В первом направлении разделение
вели на полосках ацетатцеллюлозы в пиридин-ацетатном буфе-
ре (рН 3,5) с добавлением 7 М мочевины, во втором - на ДЭАЭ-
бумаге в 7%-ной НСООН [Brownlee, 1972]. Ввиду малой емко-
сти ацетатцеллюлозы общая загрузка не превышала 0,1 мг гид-
ролизата РНК, поэтому использовали препараты, меченные ра-
диоактивным фосфором.

119

Сейчас методы фракционирования низкомолекулярных био-
логических объектов электрофорезом на твердых носителях на-
столько энергично и успешно вытесняет жидкостная хроматогра-
фия под высоким давлением (ЖХВД), что рассматривать их
уже не имеет смысла. Впрочем, изредка электрофорез на твер-
дом носителе еще используют и для фракционирования белков.
Так, сравнительно недавно было описано очень хорошее разде-
ление девяти модификаций казеина молока электрофорезом на
полосках ацетатцеллюлозы. Эти модификации различались уров-
нем фосфорилирования белка, и разделение шло по величине
электрического заряда [West, Towers, 1976].

ОГЛАВЛЕНИЕ
Часть первая
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Введение .................. 3
Глава 1
Гели для электрофореза .................. 7
Полиакриламидный гель (ПААГ) ................ 7
Исходные материалы ................... 7
Процесс полимеризации ПААГ ............... 10
Выбор концентраций мономеров .............. 13
Агароза ......................... 16
Смешанный гель (агароза+ПААГ) .............. 20
Ацетатцеллюлозная пленка, импрегнированная ПААГ ....... 21
Глава 2
Техника приготовления гелей и аппаратура ........... 21
Вертикально расположенные трубки ....-..........: 21
Вертикально расположенные пластины .............. 26
Горизонтально расположенные пластины ............ 32
Глава 3
Электрофорез белков .................... 37
Замечания общего характера .................. 37
Миграция белков в геле ................. 37
Напряженность электрического поля (H) ......... 38
Выбор буфера рабочего геля ............... 40
Выделение тепла при электрофорезе ............ 42
Загрузка геля. Ширина белковых зон ............ 44
Введение мочевины и (З-меркаптоэтанола. Некоторые артефакты . 46
Лидирующие красители ................. 47
Разделение белков по размерам и заряду ............ 48
Выбор рабочего буфера ................. 48
Использование мочевины ................. 50
Загрузка геля и подготовка препарата ..;......... 52
Некоторые примеры ................... 53
Разделение белков по размеру с использованием ДДС-Na ..... 56
Существо метода ..................... 56
Выбор пористости геля .................. 59
283

Присутствие мочевины и нейояных детергентов ........ 60
Выбор рабочего буфера геля ............... 61
Подготовка белкового препарата .............. 6в
Проведение электрофореза .........;...... 63
Окрашивание и элюция белков .............. 64
Ступенчатый электрофорез (disc-electrophoresis) ......... 66
Градиент пористости ПААГ .................. 73
Двумерный электрофорез в ПААГ ................ 76
Электрофорез с использованием Тритона Х-100 в цетавлона .... 83
Тритон Х-100 ..................... S3
Цетавлон ................. 85
Окрашивание белков в ПААГ ................ 88
Кислые красители ................... 90
Другие красители и методы окрашивания .......... 94
Флюоресцентные красители ................ 97
Локализация ферментов после электрофореза ......... 101
Локализация белковых полос осаждением ДДС-Na . .... . . 104
Элюция белков из геля ............. 105
Определение радиоактивности белков после электрофореза в ПААГ . 109
Счет радиоактивности в элюатах белка ........... 109
Растворение ПААГ .................... 110
Импрегнирование сцинтиллятора в гель ........... 111
Авторадиография .................... 112
Флюорография ..................... 113
Препаративный электрофорез белков .............. 116
Глава 4
Электрофорез нуклеиновых кислот.................................................................. 120
Замечания общего характера............................................................................. 120
Выбор буфера геля и напряженности электрического поля...................................120
Выбор характера геля и его пористости.......................................................... 121
Влияние вторичной структуры..................................................................... 123
Маркерные молекулы................................................................................. 125
Лидирующие красители.............................................................................. 126
Электрофорез в мягких условиях........................................................................ 126
Фракционирование плазмид и фрагментов ДНК................................................126
Фракционирование РНК.............................................................................. 128
Электрофорез в денатурирующих гелях............................................................... 128
Щелочные гели......................................................................................... 129
Гели, содержащие мочевину. Секвенирование ДНК и РНК...................................131
Денатурирующие гели с формамидом............................................................ 135
Денатурирующие гели с формальдегидом....................................................... 138
Гели, содержащие гидроокись метилртути...................................................... 140
Денатурация нуклеиновых кислот глиоксалем.................................................. 142
Использование градиентов пористости ПААГ....................................................... 142
Двумерный электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов................................ 144
Некоторые особые случаи электрофореза нуклеиновых кислот.................................. 147
Электрофорез в геле агарозы тройного комплекса ДНК-РНК-поли-
мераза-РНК............................................................................................. 147
284

Выявление мРНК при электрофорезе суммарной РНК в геле агарозы 148
Использование жидкого (не сшитого) ПААГ.......................................................149
Окрашивание нуклеиновых кислот после электрофореза ...... 150
Элюция нуклеиновых кислот из гелей ............. 153
Элюция из ПААГ за счет диффузии ............ 153
Элюция из гелей агарозы ................ 154
Электрофоретическая элюция ............... 158
Перенос нуклеиновых кислот из геля на нитроцеллюлозные фильтры
и диазобумагу ..................... 162
Определение радиоактивности ................ 165
Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот ........ 166
Литература ....................... 168
Часть вторая
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Введение ......................... 174
Глава 1 .
Основные понятия теории седиментации ............ 175
Глава 2
Ультрацентрифуга ..................... 177
Принцип действия и расположение важнейших узлов ....... 177
Проверка готовности основных систем к пуску .......... 179
Пуск центрифуги ...... .............. 180
Глава 3
Роторы и пробирки .................... 182
Угловые роторы ....................... 182
Пробирки для угловых роторов .............. 184
Уход за роторами и пробирками .............. 187
Роторы со свободно подвешенными пробирками (бакет-роторы) . . . 189
Роторы с вертикальными пробирками ..........'... 191
Максимально допустимая частота вращения ротора ........ 191
Зональные роторы ..................... 193
Особенности эксплуатации и ухода ...'.......... 197
Глава 4
Раздельное осаждение частиц (дифференциальное центрифугирование) 199
Глава 5
Зонально-скоростное центрифугирование ............. 201
Константа седиментации .................. 203
Изокинетический градиент плотности ............... 204
Выбор среды ............ ь .......... 206
Характеристики растворов сахарозы ............... 210
Профиль градиента сахарозы ................. 213
Создание градиента плотности сахарозы ............ 214
Наслоение препарата на градиент ........ i .... 219
285

<<

стр. 4
(всего 4)

СОДЕРЖАНИЕ